高羽亭 楊 慧，2

(廣東醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣東 東莞 523808)

PARP-1沉默對骨髓間充質干細胞凋亡的影響

高羽亭1楊 慧1，2

(廣東醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣東 東莞 523808)

目的 探討沉默PARP-1對1，4-苯醌(PBQ)致大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)凋亡的影響。方法 以空載體BMSCs為對照組，以PARP-1沉默BMSCs為處理組，免疫印跡法檢測聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)-1蛋白表達量。磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解PBQ，分別以0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0和320.0 μmol/L PBQ染毒兩組細胞，根據(jù)細胞活力檢測結果選擇合適染毒濃度后，應用噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞活力，Annexin V-PE/7-AAD標記的流式細胞技術檢測細胞凋亡，實時熒光定量-聚合酶鏈反應檢測兩組細胞PARP-1基因表達。結果 沉默細胞PARP-1蛋白表達量〔(0.15±0.02)倍〕與對照組細胞〔(1.00± 0.03)倍〕相比，下降了85%(P<0.05)。PBQ染毒24 h后，相同劑量下兩組細胞的活力并無顯著性差異。隨著PBQ染毒劑量增加，兩組細胞PARP-1表達水平和凋亡率均明顯增高(P<0.05)，且相同劑量下PARP-1沉默細胞比對照組細胞凋亡率明顯增高(P<0.05)。結論 PARP-1沉默BMSCs在PBQ作用下更易發(fā)生凋亡，PARP-1可能參與了PBQ誘導的細胞凋亡。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1；1，4-苯醌；骨髓間充質干細胞；凋亡

1，4-苯醌(PBQ)又稱對苯醌，是苯的代謝終產物，在有機合成工業(yè)中廣泛應用。PBQ作用于骨髓，能引起造血功能損害并導致白血病，但其毒性作用機制尚不完全清楚〔1〕。PBQ在體內能通過形成多種DNA加合物誘導遺傳突變的產生，也能夠促進或抑制細胞凋亡〔2，3〕。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)作為真核細胞中的一種核酶，也是細胞凋亡核心成員caspase 的底物，在細胞凋亡中具有重要作用〔4〕。細胞DNA因環(huán)境不良因素作用損傷后，PARP-1能感受和傳遞DNA損傷信息，調控細胞的損傷修復〔5〕。本研究探討PARP-1在PBQ誘導骨髓間充質干細胞(BMSCs)凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 PBQ、噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司)；逆轉錄試劑盒(立陶宛Fementas公司)；熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(德國Roche公司)；TRIzol Reagent (美國Invitrogene公司)；兔抗PARP-1一抗(美國Abcom公司)，鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠二抗、HRP標記的山羊抗兔二抗(美國Santa cruz公司)；低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 BMSCs細胞培養(yǎng) 大鼠BMSCs細胞株由本實驗室保存，以1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、100%濕度條件下培養(yǎng)。

1.3 PARP-1沉默BMSCs細胞模型 PARP-1沉默BMSCs細胞由前期研究建立〔6〕。以空載體BMSCs(shRNA-CTR)細胞為對照組，以PARP-1沉默BMSCs細胞(PARP-1-shRNA)為處理組。

1.4 PBQ染毒劑量的選擇及細胞活力測定 shRNA-CTR和PARP-1-shRNA細胞按4×103個/孔接種于96孔板，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將PBQ配成系列終濃度，分別為0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0和320.0 μmol/L，體積為100 μl/孔，染毒24 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，4 h后吸出液體，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min后測定吸光度(A)值。細胞活力(%)=(A實驗組-A空白組) /(APBS組-A空白組)×100%。每個劑量設5個復孔。

1.5 細胞凋亡檢測 PARP-1-shRNA和shRNA-CTR細胞按4×105個/孔接種于6孔板中，貼壁后分別給予0、10.0、20.0、40.0 μmol/L PBQ進行染毒。具體操作見文獻〔8〕。

1.6 PARP-1 mRNA表達水平檢測

1.6.1 細胞總RNA提取 PARP-1-shRNA和shRNA-CTR細胞按4×105個/孔接種于 6孔板中，貼壁后給予0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L PBQ染毒24 h，TRIzol試劑提取細胞總RNA。

1.6.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 PARP-1表達 以制備的RNA為模板，逆轉錄反應制備cDNA，qRT-PCR檢測PARP-1表達水平。PCR引物由上海英駿生物公司合成，引物序列見表1。用2-△△CT法定量分析，采用比較Ct值法，以管家基因ACTB為內參基因，倍數(shù)改變=2-△△CT，其中△△CT=△CT實驗-△CT對照，△CT=CTPARP-1-CTACTB，實驗重復3次。

表1 PCR引物序列

1.7 免疫印跡 細胞裂解液冰浴細胞5 min，提取總蛋白，Bradford法蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封閉0.5 h，一抗4℃過夜、洗脫，二抗孵育1 h、洗脫。增強化學發(fā)光顯影X線膠片暗室曝光，掃描底片后定量分析，實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS15.0軟件進行方差分析，t檢驗，χ2檢驗。

2 結 果

2.1 PARP-1沉默細胞的鑒定 PARP-1-shRNA細胞PARP-1蛋白表達量為(0.15±0.02)倍，比shRNA-CTR細胞〔(1.00 ± 0.03)倍〕下降了85%(P<0.05)，表明本實驗室建立的細胞PARP-1沉默效果良好。見圖1。

圖1 shRNA-CTR和PARP-1-shRNA細胞中PARP-1蛋白的表達水平

2.2 PBQ染毒劑量的選擇及細胞活力測定 要保證細胞活力在75%以上，染毒劑量不能超過40 μmol/L。當染毒劑量一定時，兩組細胞的活力并無顯著性差異。說明PARP-1沉默對于細胞的活力無明顯影響。見圖2。

圖2 不同劑量PBQ染毒24 h后細胞活力變化

2.3 PBQ作用下細胞中PARP-1基因表達 隨著PBQ染毒劑量增加，兩種細胞PARP-1表達水平均呈上升的趨勢。當染毒劑量為40.0 μmol/L時，兩組細胞PARP-1 mRNA的表達水平均達到最高。見圖3。

與PBS對照組比較:1)P<0.05;與相同處理組shRNA-CTR比較:2)P<0.05；下表同圖3 兩種細胞PBQ作用24 h后PARP-1mRNA表達水平

2.4 PBQ誘導細胞凋亡的作用 隨著PBQ濃度增高，兩種細胞的凋亡率均逐漸升高。PBQ 10.0～40.0 μmol/L時，兩種細胞凋亡率比PBS對照組均明顯增高(P<0.05)；且相同劑量組的兩種細胞比較，PARP-1-shRNA比shRNA-CTR細胞凋亡率明顯增高(P<0.05)。見表2。

表2 不同劑量PBQ作用24 h后兩種細胞凋亡率的 變化

3 討 論

作為造血微環(huán)境的主要成分，BMSCs功能和結構的完整性對于保持機體造血的穩(wěn)定性十分重要〔8〕。長期接觸苯可增加患急性髓系白血病或再生障礙性貧血的風險。PBQ是苯在體內的代謝產物，也是苯發(fā)揮毒性作用的關鍵物。研究發(fā)現(xiàn)，PBQ能夠抑制DNA 的復制，誘導DNA 單鏈的斷裂并可誘發(fā)癌變〔9〕。熊夢禎等〔2〕報道，PBQ能誘導人胚肺成纖維細胞(HELF)發(fā)生凋亡，且凋亡率隨著PBQ染毒濃度增高而升高。本次實驗結果也說明PBQ能誘導BMSCs細胞發(fā)生DNA的損傷。

作為DNA 損傷的分子感受器，PARP-1被抑制后能影響其與DNA斷端的結合，導致其喪失損傷修復能力〔10〕。本文結果顯示，本實驗室建立的大鼠PARP-1沉默細胞株抑制PARP-1基因表達效果良好。PARP-1-shRNA在染毒劑量10.0～40.0 μmol/L時，凋亡率明顯升高，且在同一劑量組凋亡率比shRNA-CTR細胞明顯升高。說明PAPR-1沉默BMSCs細胞DNA損傷修復能力明顯減弱，對環(huán)境有害因素更敏感。

本實驗結果提示PARP-1可能參與了PBQ誘導的細胞凋亡。DNA損傷后修復不迅速會導致細胞死亡，修復不正確會導致基因變異，誘發(fā)癌癥。PARP-1表達水平將影響DNA損傷修復的結局。Ling等〔11〕報道，PARP-1參與了DNA修復和細胞死亡等，PARP-1表達增高有利于DNA損傷的修復。雖然沉默細

胞中PARP-1本底值較低，PBQ仍能誘導其表達，但由于其水平較低，會影響DNA損傷的修復。也有研究表明，由于PAPR-1沉默會導致細胞喪失部分修復能力和誘導細胞死亡能力，在環(huán)境有害因素作用下，帶有堿基損傷的細胞可能發(fā)生惡性轉化而生成腫瘤〔12〕。

綜上，PBQ能誘導BMSCs發(fā)生凋亡，PARP-1沉默BMSCs在PBQ作用下更易發(fā)生凋亡，PARP-1可能參與了PBQ誘導的細胞凋亡，但PARP-1參與該凋亡過程的具體機制仍待深入研究。

1 張 敏，朱麗瑾，余 珉，等.1，4-苯醌抑制人骨髓間充質干細胞中copine 1、copine 3的表達〔J〕.中國工業(yè)醫(yī)學雜志，2012；25(4)：251-4.

2 熊夢禎，張 娟，孫蓉麗，等.1，4-苯醌致人胚肺成纖維細胞的凋亡效應與調控機制〔J〕.癌變，畸變，突變，2012；24(1)：6-9.

3 Das A，Chakrabarty S，Choudhury D，etal.1，4-Benzoquinone (PBQ) induced toxicity in lung epitbelial cells is mediated by the disruption of the microtubule network and activation of caspase-3〔J〕.Chem Res Toxicol，2010；23(6)：1054-66.

4 徐永春，陳佳佳，陳玉婷，等.PARP-1在苯代謝物氫醌誘導細胞凋亡中的作用〔J〕.廣州化工，2014；42(21)：3-5.

5 凌曉璇，溫橋生，杜諭君，等.多聚聚合酶-1在氫醌誘導的DNA損傷應答中的作用及其機制〔J〕.職業(yè)與健康，2015；31(14)：1906-9.

6 高羽亭，黃明元，劉林華，等.大鼠聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1基因RNA干擾表達質粒構建與鑒定〔J〕.中國職業(yè)醫(yī)學，2012；39(1)：1-4.

7 高羽亭.利用RNA干擾技術研究PARP-1在低劑量氫醌對骨髓間充質干細胞毒性中的作用〔D〕.長春：吉林大學，2012.

8 代 凱，陳潔平.間充質干細胞在骨髓造血重建中作用的研究進展〔J〕.重慶醫(yī)學，2015；44(11)：1553-5.

9 楊 鳳，周建華.1，4-苯醌對V79細胞毒性及DNA損傷效應研究〔J〕.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2009；35(6)：336-40.

10 Wang Z，Wang F，Tang T，etal.The role of PARP-1 in the DNA damage response and its application in tumor therapy〔J〕.Front Med，2012；6(2)：156-64.

11 Ling XX，Liu JX，Yun L，etal.Poly(ADP-ribosyl)ation of apoptosis antagonizing transcription factor involved in hydroquinone-induced DNA damage response〔J〕.Biomed Environment Sci，2016；29(1)：80-4.

12 Schiewer MJ，Knudsen KE.Transcriptional roles of PARP1 in cancer〔J〕.Mol Cancer Res，2014；12(8)：1069-80.

〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

廣東醫(yī)科大學科研基金(No.2XB13012)

高羽亭(1982-)，女，博士，講師，主要從事衛(wèi)生毒理學、間充質干細胞研究。

R33

A

1005-9202(2017)03-0575-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.022

1 東莞市環(huán)境醫(yī)學重點實驗室

2 廣東醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院實驗中心