朱阿楠 方亞君 許 紅 王利峰 陳洪宇 俞艷雯

(余姚市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，浙江 余姚 315400)

CX3CR1基因多態(tài)性與糖尿病腎病炎癥介質(zhì)的相關(guān)性

朱阿楠 方亞君1許 紅1王利峰1陳洪宇2俞艷雯1

(余姚市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，浙江 余姚 315400)

目的 探討趨化因子受體CX3CR1-V249I 、CX3CR1-T280M 基因多態(tài)性的與糖尿病腎病(DN)炎癥介質(zhì)核因子(NF)-κB、Fractalkine(FKN)、白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子( TNF)-α的相關(guān)性。方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法檢測(cè)及反向測(cè)序法檢測(cè)80例DN患者(DN組)、119例糖尿病(DM組)患者和118例對(duì)照者(C組)的CX3CR1 基因T280M、V249I 多態(tài)性分布，ELISA法測(cè)定各組血清中NF-κB、FKN、IL-6、 TNF-α濃度。結(jié)果 等位基因V249I在C組中的分布頻率(20.33%)明顯高于DN組(17.23%)和DM組(8.75%)(P<0.05)；等位基因T280M在各組中分布頻率無明顯差異(P>0.05)。DN組及DM組中V249I、T280M變異型患者血清中FKN濃度較野生型明顯增加(P<0.05)；DN組及DM組中V249I、T280M 變異型患者血清中NF-κB濃度較野生型明顯減少(P<0.05)；DM組中突變型患者血清TNF-α濃度較野生型明顯減少(P<0.05)；DN組T280M突變型患者血清IL-6濃度較野生型濃度明顯增多(P<0.05)。結(jié)論 CX3CR1-V249I突變可能減少了DN的發(fā)生，炎癥因子NF-κB、FKN、 TNF-α可能參與了此過程；而CX3CR1-T280M基因多態(tài)性和DN發(fā)生無明顯關(guān)聯(lián)，但I(xiàn)L-6加速DN的發(fā)生可能和T280M突變有關(guān)。

趨化因子受體；V249I；T280M；基因多態(tài)性；糖尿病腎病；炎癥介質(zhì)

糖尿病腎病(DN)是由于血糖持續(xù)升高、腎小球血流動(dòng)力學(xué)改變等多種因素共同作用引起的一種以腎小球硬化為主的腎臟病變。研究證實(shí)炎癥介質(zhì)在DN 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔1，2〕。本研究分析了糖尿病(DM)患者、DN患者和對(duì)照組人群中CX3CR1兩個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)的多態(tài)性分布情況及其炎癥介質(zhì)的濃度變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，選取2009年1月至2013年12月我院門診及住院DM患者199例，所有患者知情同意并簽署知情同意書，診斷符合1999 年WHO糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)。其中DN組80例，尿白蛋白排出率(UAER)>200 μg/min；DM組119例，DM組所有患者腎小球?yàn)V過率(GFR)正常，且運(yùn)動(dòng)后UAER<20 μg/min。DN組男53例，女27例；平均年齡(62.23 ± 10.11)歲；糖尿病病程(11± 3.02)年。DM組男69例，女 50例；平均年齡(58.91 ± 9.18)歲；糖尿病病程(10± 2.18)年。同時(shí)選取正常對(duì)照組(C組)：我院同期門診健康體檢者118例，男67例，女51例；平均年齡(59.93±10.08)歲，體檢正常，排除糖尿病及其他腎臟疾病、血管病變等。各組在年齡和性別及病程差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法檢測(cè) 采取外周血全血提取基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、酶切、電泳，得出電泳圖。(MX3005P 定量PCR儀，上海智巖科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 DNA序列分析 分別選取CX3CR1 的T280M基因位點(diǎn)純合子野生型、純合子突變型、雜合子標(biāo)本，經(jīng)純化后進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序由杭州艾迪康生物有限公司完成，測(cè)序結(jié)果在SNP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析比較。

1.4 各組血清Fractalkine(FKN)、核因子(NF)-κB、白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α濃度測(cè)定 常規(guī)空腹采肘部靜脈血，采用ELISA法(ELx800TM通用酶標(biāo)儀，上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司)測(cè)定各組血清 FKN(試劑為美國Cytolab公司)、NF-κB(試劑為美國Cytolab公司)、IL-6(試劑為上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)、TNF-α(試劑為美國Cytolab公司)濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行χ2和t檢驗(yàn)。采用Logistic 回歸分析比較基因型與DN的相關(guān)性，其關(guān)聯(lián)性用比值比(OR)和95%可信度(95%CI)表示。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡 對(duì)DM組、DN組與C組的CX3CR1基因多態(tài)性進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，三組之間不存在顯著差異(P=0.6231)，說明群體基因遺傳平衡來自同一孟德爾群體。

2.2 CX3CR1基因V249I、T280M酶切結(jié)果 限制性片段V249I瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果：目的產(chǎn)物經(jīng)AclⅠ酶切后，出現(xiàn)1條條帶295 bp，為突變型純合子II型；出現(xiàn)2條條帶104 bp和191 bp，為野生型純合子VV型；出現(xiàn)3條條帶104 bp、191 bp和295 bp，為雜合子VI型。限制性片段T280M瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果：目的產(chǎn)物經(jīng)HpyCH4Ⅲ酶切和瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)1 條295 bp條帶，為突變型純合子MM型；96 bp和199 bp條帶，為野生型純合子TT型；96 bp、199 bp、295 bp條帶，為雜合子TM型。見圖1、圖2。

2.3 兩組CX3CR1基因T280M、V249I頻率比較 各組CX3CR1-V249I均有3種基因型，即VV型、VI型、II型，均以VV型為主；DN組和DM組、DN組和C組V249I的基因型頻率差異顯著(P值分別為0.004，0.032)。DM組和C組V249I的基因型頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，基因型比較：χ2=0.771，P=0.680；等位基因比較：χ2=0.753，P=0.386)。DN組和C組CX3CR1-T280M有兩種基因型：TT型、TM型；DM組三種基因型：TT型、TM型、MM型，各組均以MM型為主，等位基因頻率和基因型頻率在各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。多因素Logistic回歸分析顯示：V249I多態(tài)性與DN發(fā)生負(fù)關(guān)聯(lián)，VI和II基因型在非DN患者中的分布明顯增多，并獨(dú)立于DN其余危險(xiǎn)因素，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009；OR=0.827，95%CI：0.698～0.981)。

2.4 各組V249I不同基因型患者血清炎癥介質(zhì)濃度比較 DN組及DM組中突變型(V+II)FKN濃度較野生型(VV)濃度明顯增加(P<0.05)；DN組及DM組中突變型NF-κB濃度較VV基因型濃度明顯減少(P<0.05)；DM組中突變型TNF-α濃度較VV基因型濃度明顯減少(P<0.05)，C組中各種炎癥介質(zhì)濃度在突變型和野生型之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1和表2。

圖1 CX3CR1基因V249I酶切電泳結(jié)果

2.5 各組T280M不同基因型患者血清中炎癥介質(zhì)濃度比較 表3、表4可見，各組中TM + MM基因型(突變型)患者血清FKN濃度較TT基因型(野生型)均明顯增加(P<0.05)；DN組及DM組中突變型患者血清NF-κB濃度較野生型明顯減少；DN組突變型患者血清IL-6濃度較野生型明顯增多(P<0.05)；

圖2 CX3CR1基因T280M酶切電泳結(jié)果表1 各組CX3CR1 基因V249I 頻率比較〔n(%)〕

組別n基因型VVVIIIχ2值P值等位基因頻率(%)VIχ2值P值DN組8068(85.0)1)2)10(12.5)1)2)2(2.5)1)2)11.0771)0.0041)91.251)2)8.751)2)9.6981)0.0021)DM組11982(73.21)33(22.32)4(4.46)6.8972)0.0322)82.7717.235.7732)0.0162)C組11875(68.18)38(28.18)5(3.64)79.6620.33

與C組比較：1)P<0.05；與DM組比較：2)P<0.05

表2 各組CX3CR1 基因T280M 頻率比較〔n(%)〕

表3 V249I不同基因型患者血清中炎癥遞質(zhì)及細(xì)胞因子濃度比較±s)

表4 各組T280M不同基因型患者血清中炎癥遞質(zhì)及細(xì)胞因子濃度比較±s)

DM組中突變型患者血清TNF-α濃度較野生型明顯減少(P<0.05)，C組中NF-κB、IL-6、TNF-α濃度在突變型和野生型之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討 論

Tuttle〔3〕認(rèn)為 DN 是一種炎癥性疾病，F(xiàn)ornoni等〔4〕試驗(yàn)證明：免疫炎癥反應(yīng)細(xì)胞、細(xì)胞因子、急性期反應(yīng)蛋白及凝血因子等炎癥反應(yīng)因子在糖尿病腎損害中發(fā)揮重要作用。Park等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)Fractalkine /CX3CR1參與介導(dǎo)了腎臟的發(fā)生發(fā)展過程。近年發(fā)現(xiàn)CX3CR1 基因中存在V249I、T280M 堿基突變，這種遺傳變異對(duì)CX3CR1和FKN的親和力產(chǎn)生明顯影響，從而影響炎癥過程中白細(xì)胞的游走、黏附和聚集，并可能影響 DN 的遺傳易感性〔6〕。

本研究顯示CX3CR1基因的 249I 等位基因與DN發(fā)生的危險(xiǎn)性下降明顯相關(guān)，獨(dú)立于DN其他危險(xiǎn)因素；T280M基因多態(tài)性和DN無明顯關(guān)聯(lián)。FKN/CX3CR1 通過參與白細(xì)胞特別是吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的游走和活化、介導(dǎo)細(xì)胞間黏附等作用在許多炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)小鼠系膜細(xì)胞的增殖受FKN/CX3CR1的影響，F(xiàn)KN劑量越大，系膜細(xì)胞增殖越明顯〔8〕。在體外培養(yǎng)的小鼠腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)促炎癥因子IL-1β、TNF-α是FKN 的主要誘導(dǎo)物，TNF-α的表達(dá)水平與慢性腎疾病風(fēng)險(xiǎn)率呈正相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)DN病情變化的指標(biāo)〔9〕。TNF高表達(dá)可通過誘導(dǎo)腎小球血管表達(dá)ICAM-1、誘導(dǎo)氧自由基產(chǎn)生、刺激腎小球系膜細(xì)胞合成IL-1、MCP-1等途徑參與DN的發(fā)生發(fā)展〔10〕。FKN/CX3CR1 的表達(dá)也依賴于NF-κB信號(hào)通路，NF-κB 活化后可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與TNF-α 啟動(dòng)子的κB 序列結(jié)合，使TNF-α 的釋放增加〔6〕，且兩者之間還存在著正反饋?zhàn)饔??？梢奆KN/CX3CR1與DN發(fā)生發(fā)展有關(guān)，這一過程又受TNF-α、NF-κB等炎癥因子的影響〔10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，DN組CX3CR1基因249I等位基因的變異較DM組及C組明顯減少。其潛在的可能機(jī)制為DN患者V249I等位基因變異降低，相對(duì)而言導(dǎo)致了CX3CR1表達(dá)增加，同時(shí)DN患者血清中FKN濃度增加，F(xiàn)KN-CX3CR1系統(tǒng)激活，單核細(xì)胞表達(dá)NF-κB和TNF-α增加，腎血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞的損傷，促進(jìn)了DN的發(fā)生發(fā)展。McDermott等〔11〕在其研究中也發(fā)現(xiàn)外周CX3CR1受體非正常的表達(dá)，使表達(dá)CX3CR1受體的細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞上膜結(jié)合型FKN的趨化和黏附能力均顯著下降，從而減輕了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。本研究說明V249I變異型對(duì)FKN的趨化活性下降，與FKN的結(jié)合率也降低，炎癥因子NF-κB、TNF-α濃度降低，減輕了DN 的發(fā)生發(fā)展。但是DN組中VI+II基因型TNF-α濃度較VV基因型濃度減少無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也可能其他途徑參與調(diào)節(jié)TNF-α的生成。T280M基因多態(tài)性和DN無明顯關(guān)聯(lián)，但V280M變異型和V249I變異型中炎癥因子TNF-α、NF-κB、FKN的濃度高度一致，其原因?yàn)楸狙芯繕颖局蠺280M基因大多和V249I突變同時(shí)發(fā)生。在McDermott等〔11〕研究也發(fā)現(xiàn)：CX3CR1-M280經(jīng)常與CX3CR1-I249同時(shí)存在，但是與后者相比，兩者在冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生率的下降方面作用卻不相同。

研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，DM患者血清IL-6可明顯升高，且和尿蛋白濃度正相關(guān)。IL-6 的升高可顯著削弱胰島β 細(xì)胞的功能，引起胰島素分泌功能障礙、胰島素抵抗和代謝綜合征的發(fā)生，最終導(dǎo)致DM進(jìn)展為DN。而且升高的 IL-6與腎小球系膜細(xì)胞上的IL-6受體結(jié)合，刺激腎小球系膜的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，使腎小球?yàn)V過膜增厚。本研究顯示各組V249I不同基因型患者血清中IL-6的濃度無顯著差異；但T280M不同基因型中，DN組突變型患者血清IL-6濃度較野生型明顯增多，說明IL-6濃度變化與V249I、T280M兩個(gè)位點(diǎn)的突變情況并不一致，DN組T280M位點(diǎn)的突變與IL-6濃度的增加有一定相關(guān)性，目前相關(guān)機(jī)制尚不清楚，DN患者中IL-6濃度的增加與FKN-CX3CR1 系統(tǒng)關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)CX3CR1 的V249I多態(tài)位點(diǎn)突變和DN發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)，T280M基因多態(tài)性和DN無明顯關(guān)聯(lián)，V249I等位基因突變可能對(duì)DM患者腎臟病變起著保護(hù)作用。CX3CR1多態(tài)性有可能通過影響腎臟的炎癥過程而參與DN的發(fā)生發(fā)展。要更深入了解CX3CR1多態(tài)性與DN的關(guān)系，尚需大樣本、多臨床中心的進(jìn)一步研究。

1 謝紹鋒，黃莉吉，趙 越，等.血清 Fractalkine 和超敏 C 反應(yīng)蛋白與早期 2 型糖尿病腎病的相關(guān)性研究〔J〕.中國全科醫(yī)學(xué)，2013；3(16)：987-90.

2 Yamagishi S，Matsui T，Nakamura K，etal.Olmesartan blocks inflammatory reactions in endothelial cells evoked by advanced gyrations end products by suppressing generation of reactive oxygen species〔J〕.Ophthalmic Res，2008；40(1)：10-5.

3 Tuttle KR.Metabolism and immunology：diabetic nephropathy is an inflammatory disease〔J〕.J Am Soc Nephrol，2005；16(6)：1537-8.

4 Fornoni A，Ijaz AJ，Tejada T，etal.Role of inflammation in diabetic nephropathy〔J〕.Curr Diabetes Rev，2008;4(1)：10-7.

5 Park J，Song KH，Ha H.Lipopolysaccharide increases monocyte binding to mesangial cells through fractalkine and its receptor〔J〕.Transplant Proc，2012;44(4)：1029-31.

6 Donadelli R，Zanchi C，Morigi M，etal.Protein overload induces fractalkine upregulation in proximal tubular cells through nuclear factor kappa B-and p38 mitogen-activated protein kinasedependent pathways〔J〕.J Am Soc Nephrol，2003;14(10)：2436-46.

7 Escher F，Vetter R，Kühl U，etal.Fractalkine in human inflammatory cardiomyopathy〔J〕.Heart，2011;97(9)：733-9.

8 Park J，Song KH，Ha H.Fractalkine increases mesangial cell proliferation through reactive oxygen species and mitogen-activatedprotein kinases〔J〕.Transplant Proc，2012;44(4)：1026-8.

9 Yeo ES,Hwang JR，Park JE,etal.Tumor necrosis factor(TNF-alpha)and C reactive protein(CRP)are positively associated with the risk of chronic kidney disease in patients with type 2 diabetes〔J〕.Yonsei Med,2010;51(4)：519-25.

10 Tsiotra PCJ,Tsigos C，Yfanti E，etal.Visfatin，TNF-alpha and IL-6 mRNA expression is increased in mononuclear cells from type 2 diabetic women〔J〕.Horm Metab Res J,2007;39(10)：758-63.

11 McDermott DH，F(xiàn)ong AM，Yang Q，etal.Chemokine receptor mutant CX3CRI-M280 has impaired adhesive function and correlates with protection from cardiovascular disease in humans〔J〕.J Clin Invest,2003；1(11)：1241-50.

12 何 煜，張 琰，廖婷婷，等.老年早期糖尿病腎病患者血清胱抑素C與氧化應(yīng)激的相關(guān)性〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(2)：594-6.

〔2015-08-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

余姚市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2009Y11)

朱阿楠(1975-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌學(xué)研究。

R318.16

A

1005-9202(2017)03-0616-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.040

1 余姚市中醫(yī)醫(yī)院腎內(nèi)科 2 杭州市中醫(yī)院腎內(nèi)科