王婷婷，王紅燦，路玉蓉，葉東碩，楊登科，張光濤，張芳婷，龍光輝，張 健，楊寅柯

(1.湖南大學(xué)生物學(xué)院，中國 長沙 410082; 2.深圳市博圣康生物科技有限公司,中國 深圳 518000; 3.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，中國 深圳 518000)

間充質(zhì)干細(xì)胞與未成熟樹突細(xì)胞聯(lián)合胰島細(xì)胞移植治療小鼠糖尿病

王婷婷1，王紅燦1，路玉蓉2，葉東碩2，楊登科2，張光濤3，張芳婷3，龍光輝3，張 健1，楊寅柯1

(1.湖南大學(xué)生物學(xué)院，中國 長沙 410082; 2.深圳市博圣康生物科技有限公司,中國 深圳 518000; 3.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，中國 深圳 518000)

為建立一種有效的胰島移植免疫耐受的新方案，利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定未成熟樹突細(xì)胞(immature dendritic cells,imDCs)，成骨誘導(dǎo)鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，雙硫腙(Dithizone,DTZ)染色鑒定胰島細(xì)胞.胰島細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療小鼠糖尿病，測定移植后糖尿病小鼠血糖及糖化血紅蛋白變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)未成熟樹突細(xì)胞共同移植雖然未能顯著延長移植物的存活時(shí)間(7±2.65 d)，但能顯著降低糖尿病小鼠血糖水平；200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞共移植，可使血糖下降到較低水平，并維持移植物存活時(shí)間達(dá)8±2.31天；200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞及2×105個(gè)未成熟樹突細(xì)胞共同移植于糖尿病小鼠，可使糖尿病鼠血糖下降并顯著延長移植物的存活時(shí)間(12.6±3.48 d).結(jié)果說明聯(lián)合移植在一定程度上可延長移植物的存活時(shí)間并使血糖維持在較低的水平，有效控制糖化血紅蛋白濃度，較單獨(dú)移植胰島細(xì)胞治療小鼠糖尿病有積極的作用.

樹突細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；胰島細(xì)胞移植；糖尿?。惶腔t蛋白

20世紀(jì)70年代以來，胰島移植成為治療糖尿病的主要選擇之一[1-3]，胰島移植細(xì)胞的質(zhì)量與數(shù)量是決定移植效果的關(guān)鍵，除了如何獲得高純度、高產(chǎn)量及高成活率的胰島細(xì)胞，胰島移植后無血管期以及后期的血管形成不良導(dǎo)致胰島丟失和胰島移植后效率低和免疫排斥也是目前亟需解決的問題[4].有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)不僅可以產(chǎn)生促組織再生和修復(fù)的細(xì)胞因子和生長因子，防止糖尿病動物體內(nèi)損傷的胰腺β細(xì)胞凋亡[5]，而且可以通過形成胰島細(xì)胞分泌胰島素并穩(wěn)定血糖水平[6-8].體外研究則發(fā)現(xiàn)，MSCs可抑制T細(xì)胞的活化和各種刺激引起的T細(xì)胞增殖，并表明MSCs異體移植不會引起免疫排斥反應(yīng)，還可誘導(dǎo)產(chǎn)生非特異性免疫耐受[9].未成熟樹突細(xì)胞(immature dendritic cell,imDCs)不表達(dá)共刺激分子，當(dāng)imDCs攜帶自身抗原移行至外周淋巴組織后不能使T細(xì)胞活化，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生自身耐受，相應(yīng)延長異種胰島細(xì)胞在糖尿病小鼠體內(nèi)的存活時(shí)間[10-11].在本研究中作者考察間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、未成熟樹突細(xì)胞(imDCss)與胰島細(xì)胞3種細(xì)胞不同移植方式在治療糖尿病鼠中的治療效果，建立一種胰島移植治療糖尿病鼠免疫耐受的新方案，為臨床開展胰島移植治療糖尿病提供有益的探索.

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠(6周齡)，SD大鼠(270 g)均購自廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；胎牛血清(GIBCO)；RPMI-1640，DMEM/F12培養(yǎng)基，HBSS，青霉素和鏈霉素均購自HYCLONE；MTT及DMSO均購自上海生物工程有限公司；淋巴細(xì)胞分離液(Histopaque-1.077 g/mL)，膠原酶-V，鏈脲佐菌素(STZ)，雙硫腙(DTZ)及吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)均購自SIGMA；Rat INS (Insulin) ELISA Kit 購自Elabscience；小鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)ELISA Kit購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；Anti-Mouse CD11c FITC，Anti-Mouse CD86 FITC，Anti-Mouse CD80 FITC，Anti-Mouse MHC-Ⅱ FITC，Rat IgG2b K Isolype Control FITC，Armenian Hamster IgG Isotype Control FITC，Rat IgG2a K Isotype Control FITC均購自EBIOSCIENCE；重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant mice granulocyte macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF和重組小鼠白介素-4 (recombinant mice interleukin4，rmIL-4) 購自PEPROTECH；血糖儀及血糖試紙為羅氏ACCU-CHEK?Performa.流式細(xì)胞儀為BD；酶標(biāo)儀為Bio-Tek.

1.2 方法

1.2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo) 取6～8周齡的雄性BALB/c小鼠斷頸處死，無菌取出雙側(cè)的股骨和脛骨，剔凈周圍組織，后用DMEM/F12培養(yǎng)基(含1%青霉素/鏈霉素)沖洗.剪掉兩端膨大關(guān)節(jié)，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基沖洗髓腔，至髓腔變白.沖洗液經(jīng)74 μm濾網(wǎng)過濾，收集濾液并離心，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2～5×106/mL，用6孔板培養(yǎng).將培養(yǎng)板放入37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中，3 h后，換液，去除不貼壁的細(xì)胞.此后，每8 h換液一次，棄去未貼壁細(xì)胞，直至72 h(從初始培養(yǎng)算起).以后每3 d換液一次，待細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化并傳代，繼續(xù)放入37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取純化的第3代MSC接種于24孔板，細(xì)胞生長融合至80%～90%時(shí)，換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 d換液一次，以含10%FBS的DMEM/F12為對照.37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).誘導(dǎo)2周后，ALP鈣鈷法染色，誘導(dǎo)3周的細(xì)胞，Von kossa’s礦化染色.

1.2.2 未成熟樹突細(xì)胞(imDCss)的分離培養(yǎng)和鑒定 取6～8周齡的雄性BALB/c小鼠斷頸處死，無菌取出雙側(cè)的股骨和脛骨，剔凈周圍組織，用RPMI-1640 培養(yǎng)基沖洗，減掉兩端膨大關(guān)節(jié)，用培養(yǎng)基沖洗髓腔，至髓腔變白，沖洗液經(jīng)74 μm濾網(wǎng)過濾，收集濾液離心，收集細(xì)胞.加入1mL細(xì)胞裂解液，輕輕拍打30～60 s后立即加入50 mL冷的PBS稀釋裂解液，離心后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL.

收集的細(xì)胞用含10%FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基(含1%青霉素/鏈霉素)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).同時(shí)培養(yǎng)基中加入20 μg/L Recombinant Mouse GM-CSF，10 μg/L Recombinant Mouse IL-4；第3天和第5天半量換液，補(bǔ)充GM-CSF和IL-4至全量，培養(yǎng)到第7天，進(jìn)行流式鑒定，鑒定的抗體表型分別為CD11c，MHC-Ⅱ，CD86，CD80.

1.2.3 大鼠胰島細(xì)胞的分離純化及活力檢測 將成年SD大鼠(8～10周齡，體重250～300 g)用戊巴比妥鈉麻醉；打開腹腔，結(jié)扎胰管；經(jīng)膽總管向胰腺注入膠原酶V溶液(1 g/L) 8～10 mL，摘取胰腺，37.5℃水浴20 min后終止消化，通過0.45 mm篩網(wǎng)過濾細(xì)胞.洗滌后用Histopaque@-1077純化獲得胰島細(xì)胞；收集細(xì)胞，再洗滌，取5 mL胰島懸液雙硫腙(DTZ)染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，并進(jìn)行胰島當(dāng)量計(jì)數(shù)和純度分析.重復(fù)3次，分別鏡檢計(jì)數(shù)雙硫腙(DTZ)陽性細(xì)胞團(tuán).胰島當(dāng)量=(3次陽性胰島數(shù)值之和/3)×[樣本總量(mL) / 50 μL]，胰島的純度=DTZ染色陽性的胰島個(gè)數(shù)/細(xì)胞團(tuán)總數(shù)×100%，此實(shí)驗(yàn)中胰島的純度=紅色 / (紅色+黃色)×100%.

以無酚紅Hanks液配置AO儲存液及PI儲存液，避光4 ℃保存.使用前，稀釋成規(guī)定的濃度，活的胰島細(xì)胞經(jīng)AO/PI染色呈綠色，死亡的胰島細(xì)胞經(jīng)AO/PI染色呈紅色.拍照并用Image-Pro plus軟件分析胰島細(xì)胞活力.胰島的活力=綠色/(紅色+綠色)×100%.

1.2.4 葡萄糖刺激胰島細(xì)胞胰島素釋放濃度的測定 用含2.8 mmol/L葡萄糖和16.8 mmol/L葡萄糖的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，將分離純化后的胰島細(xì)胞接種于24孔板，每孔約100 IEQs胰島細(xì)胞，37 ℃各孵育2 h，分別收集培養(yǎng)液保存，ELISA法測定培養(yǎng)液中胰島素的含量.刺激指數(shù)(Stimulation Index，SI)=16.8 mmol/L葡萄糖刺激下的胰島素濃度/2.8 mmol/L葡萄糖刺激下的胰島素濃度.

1.2.5 體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)及MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖影響 以SD大鼠外周血T淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞(R)，分別將絲裂霉素C(40 mg/L)處理的 MSCs,imDCs,imDCs+MSCs作為刺激細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，將一定濃度的反應(yīng)細(xì)胞與相應(yīng)濃度的刺激細(xì)胞(S)(S與R數(shù)目比為1∶10)加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL 10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔， 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天.終止反應(yīng)前4 h，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，4 h后，離心棄上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀(BIO-TEK)570 nm處測定吸光度.并計(jì)算其刺激指數(shù)(SI)=實(shí)驗(yàn)組OD570吸光度/對照組OD570吸光度.

MLR實(shí)驗(yàn)分為5組：A組(陰性對照組)：DC(SD大鼠，方法同小鼠imDCs)與T細(xì)胞混合培養(yǎng)組(nS∶nR為1∶10，即T細(xì)胞為1×105/孔，DC為1×104/孔)；B組：(陽性對照組)：mDCs(LPS刺激imDCs成熟)與T細(xì)胞混合培養(yǎng)組(nS∶nR為1∶10)；C組：MSCs與T細(xì)胞混合培養(yǎng)組(nS∶nR為1∶10)； D組：imDCs與T細(xì)胞混合培養(yǎng)組(nS∶nR為1∶10)；E組： imDCs及MSCs與T細(xì)胞混合培養(yǎng)組(T細(xì)胞為1×105/孔，MSCs為5×103/孔，imDCs為5×103/孔).

1.2.6 小鼠糖尿病模型的建立 以pH 4.5的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配置12 g/L鏈脲佐菌素(STZ)溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌后置冰上備用.BALB/c小鼠，雄性，8～10周齡，75%酒精常規(guī)消毒腹部皮膚，150 mg/kg體重腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液.注射72 h后開始測定血糖，連續(xù)測定5 d，每天血糖都維持16.7 mmol/L以上為造模成功.

1.2.7 實(shí)驗(yàn)分組及術(shù)后血糖、糖化血紅蛋白檢測 將8～10周齡的糖尿病雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，接受胰島與同源未成熟樹突細(xì)胞(imDCs)或間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的移植.糖尿病小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，在背部肋下皮膚處做一小切口，以無菌棉簽擠壓暴露左腎.A組(n=5)：糖尿病模型對照組，未移植細(xì)胞；B組(n=6)：200個(gè)胰島移植于糖尿病小鼠左腎被膜下；C組(n=6)：200個(gè)胰島與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植于糖尿病小鼠左腎被膜下；D組(n=6)：200個(gè)胰島及2×105個(gè)未成熟樹突細(xì)胞(imDCs)移植于糖尿病小鼠左腎被膜下；E組(n=5)：將200個(gè)胰島、2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)及2×105個(gè)未成熟樹突細(xì)胞(imDCs)共同移植于糖尿病小鼠左腎被膜下.移植后，尾靜脈采血檢測血糖值，移植后連續(xù)兩次血糖水平>11.1 mmol/L定義為發(fā)生移植排斥反應(yīng)，連續(xù)兩次血糖水平>16.7 mmol/L定義為移植物失功.

移植后，每4 d小鼠眼眶取血ELISA法測定糖化血紅蛋白(HbA1c)濃度.糖化血紅蛋白的濃度：HBA1C%=HbA1c(g/dl)/Hb(g/dl) ×100%.糖化血紅蛋白為4%～6%時(shí)定義為血糖控制正常；6%～7%為血糖控制比較理想；7%～8%定義為血糖控制一般；8%～9%定義為控制不理想；糖化血紅蛋白>9%定義為血糖控制很差.ADA(美國糖尿病學(xué)會)建議糖化血紅蛋白控制在小于7%，IDF(國際糖尿病聯(lián)盟)建議糖化血紅蛋白控制標(biāo)準(zhǔn)為小于6.5%，目前我國將糖尿病患者糖化血紅蛋白的控制標(biāo)準(zhǔn)定為6.5%以下.采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 MSCs形態(tài)觀察及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定

骨髓細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)72 h后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞形態(tài)不均一，有成纖維樣細(xì)胞，也有小的圓形細(xì)胞等[圖1A(彩圖見封三)].一周后主要以梭樣細(xì)胞為主，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)均一(圖1B，第三代)，表現(xiàn)出典型的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)形態(tài).對傳代培養(yǎng)第三代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，鑒定所分離細(xì)胞為MSCs，顯微鏡下可見：鈣鈷法染色可見細(xì)胞質(zhì)有大量褐色沉淀， ALP呈陽性表達(dá)(見圖1C)；Von kossa’s礦化染色可見細(xì)胞聚集處有黑色骨塊，島狀分布(見圖1D).

A.72 h后貼壁細(xì)胞；B.傳代培養(yǎng)第三代；C.ALP鈣鈷法染色；D.ALP鈣鈷染色對照；E.Von Kossa’s礦化染色；F.Von Kossa’s 礦化染色對照圖1 小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖及成骨鑒定(10×10)Fig.1 Morphology and osteogenic differentiation potential of mouse mesenchymal stem cells (10×10)

2.2 imDCs形態(tài)觀察及表面標(biāo)志測定

利用BALB/c小鼠骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞，3 h后只保留貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)3 d即可見大量集落形成[圖2A(彩圖見封三)]，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞體積、形態(tài)變化，培養(yǎng)7 d后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面產(chǎn)生不規(guī)則的毛刺狀突起(圖2B).經(jīng)流式細(xì)胞儀分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓未成熟樹突細(xì)胞高表達(dá)CD11c(89.9%)，中度表達(dá)MHC-Ⅱ(36.61%)，低表達(dá)CD80 (5.03%)和CD86 (1.5%)(見圖3)，符合imDCs表面標(biāo)志物的特征.

A.培養(yǎng)3 d形成的細(xì)胞集落 B.培養(yǎng)7 d的細(xì)胞形態(tài)圖2 小鼠未成熟樹突細(xì)胞形態(tài)圖(10×10)Fig.2 Figures of immature dendritic cells (10×10)

圖3 小鼠未成熟樹突細(xì)胞流式鑒定Fig.3 Flow cytometric analysis of imDCs surface molecules

2.3 大鼠胰島細(xì)胞的形態(tài)觀察及活性檢測

顯微鏡下觀察純化后的胰島細(xì)胞形態(tài)如圖4A(彩圖見封三)；胰島細(xì)胞經(jīng)DTZ染色見圖4B，胰島細(xì)胞呈猩紅色，外分泌細(xì)胞不會被DTZ染色而呈黃色，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)純化前分離的大鼠胰腺胰島純度為4.5%±1.5%，純化后為67%±9.85%；純化后胰島細(xì)胞AO/PI染色結(jié)果見圖4C，其中活細(xì)胞被染成綠色，而死亡的胰島細(xì)胞呈紅色，選擇4個(gè)不同的視野進(jìn)行拍照，Image-pro plus 6.0分析胰島純化后的細(xì)胞存活百分比，即胰島的活力，本研究中作者共分析了4例大鼠胰腺分離純化后活力，結(jié)果如圖4D所示，純化后獲得的胰島存活率平均為(91±3)%.

A.純化后的胰島(25×10) B.胰島DTZ染色(25×10) C.胰島AO/PI染色 (25×10) D.分離的大鼠胰島活力圖4 大鼠胰島細(xì)胞的形態(tài)觀察及活性檢測Fig.4 Morphological observation and activity detection of islets

2.4 葡萄糖刺激分離的胰島細(xì)胞胰島素釋放濃度

ELISA法檢測不同濃度葡萄糖刺激胰島細(xì)胞后胰島素釋放水平，結(jié)果如圖5所示，分離的大鼠胰島細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下對葡萄糖的刺激仍具有良好的胰島素釋放能力，SI為2.53±0.29.

2.5 imDCs與MSCs對MLR中T淋巴細(xì)胞抑制作用

分別比較imDCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)組和MSCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)組以及imDCs+MSCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)組中T細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)imDCs+MSCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)組對T細(xì)胞刺激顯著低于其他各組，MTT檢測分析表明imDCs+MSCs對T細(xì)胞刺激能力低，并能顯著抑制T細(xì)胞的增殖(SI=1.15±0.12，P<0.05)，結(jié)果如圖6所示，與對照組(mDCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)組)相比，imDCs-T細(xì)胞(SI=1.58±0.18)，MSCs-T細(xì)胞(SI=1.66±0.13)，說明imDCs與MSCs均對T細(xì)胞增殖有抑制作用，而imDCs+MSCs對T細(xì)胞的抑制效果更明顯.

圖5 釋放胰島素濃度Fig.5 The release of insulin

圖6 MTT檢測imDCs與MSCs對MLR體系中T淋巴細(xì)胞活化刺激(*P<0.05)Fig.6 The activation of T cells stimulated by imDCs or MSCs was determined by the MTT assay(*P<0.05)

2.6 移植后血糖水平檢測

移植后各組小鼠血糖檢測結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，僅200個(gè)胰島細(xì)胞移植后小鼠血糖很快降低，在較低水平維持5 d后開始升高，移植7 d后血糖水平高于11.1 mmol/L，且呈持續(xù)上升趨勢，10 d后血糖值高于16.7 mmol/L；200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞共移植組中，移植后第三天小鼠血糖降至5.4±1.25 mmol/L，并維持在較低水平，直至移植14 d后，血糖值高于16.7 mmol/L，但其血糖維持在降低水平的時(shí)間相較于胰島移植組略長(8±2.31 d)； 200個(gè)胰島同2×105個(gè)未成熟樹突細(xì)胞共同移植于糖尿病鼠可使糖尿病鼠血糖下降，并較長時(shí)間地維持血糖于較低水平(7±2.65 d)，第11天血糖水平(12.48 mmol/L)低于胰島細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞移植的血糖水平(15.63 mmol/L)，具有顯著差異(P﹤0.05)，且從第8天起血糖水平整體低于間充質(zhì)干細(xì)胞和胰島細(xì)胞移植組.200個(gè)胰島細(xì)胞與2×105個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞、2×105個(gè)未成熟樹突細(xì)胞共同移植，可以更長時(shí)間地維持血糖處于較低水平(12.6±3.48 d)，且從第7天開始其血糖水平均低于其他各組，綜上說明聯(lián)合移植可以延長移植物的存活時(shí)間.

2.7 移植后糖化血紅蛋白檢測

糖化血紅蛋白(HbA1c)是血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，血糖和血紅蛋白的結(jié)合生成糖化血紅蛋白是不可逆反應(yīng)，并與血糖濃度成正比，檢測糖化血紅蛋白能更好地監(jiān)控血糖的控制情況，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用ELISA法檢測血液中糖化血紅蛋白(HbA1c)，結(jié)果如圖8所示，與對照組相比，各移植組在移植后12天內(nèi)糖化血紅蛋白水平都控制良好，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明胰島移植能有效控制糖尿病小鼠血糖水平；但隨著時(shí)間的推移，小鼠HbA1c水平呈上升趨勢，血糖控制效果日益減低，移植后第16天的檢測結(jié)果顯示，B，C，D實(shí)驗(yàn)組HbA1c均大于7%，第20天僅胰島移植組HbA1c為(8.1±0.56)%，血糖控制效果不理想；而D組移植后第16天((7.3±0.43)%，P<0.05)和第20天((7.0±0.43)%，P<0.05)的檢測結(jié)果表明，D組控制血糖效果較B，C組均好；E組自移植后16天糖化血紅蛋白一直控制在6.5%以下(P<0.01)，且HbA1c值穩(wěn)定，直至第20天，為(6.6±0.41)%，說明胰島細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞、未成熟樹突細(xì)胞聯(lián)合移植血糖控制效果較好，且明顯優(yōu)于其他組.

注：*P<0.05,**P<0.01圖7 糖尿病小鼠接受移植后的隨機(jī)血糖水平監(jiān)測Fig.7 Random blood glucose monitoring after islets transplantation

注：*P<0.05,**P<0.01圖8 糖尿病小鼠接受移植后的糖化血紅蛋白檢測Fig.8 The concentration of HbA1c monitoring after islets transplantation

3 討論

糖尿病模型鼠移植同種異體胰島細(xì)胞可以達(dá)到降低血糖的目的，但由于移植后的免疫排斥致使治療效果不能長久維持，移植不久血糖就會升高.樹突細(xì)胞因其在機(jī)體免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)中諸多的特殊作用而受人們關(guān)注.其中，未成熟樹突細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受能使移植器官在不使用免疫抑制劑的情況下長期存活被認(rèn)為是一種防治移植排斥反應(yīng)的有效方法[12-13].本文將胰島細(xì)胞與未成熟樹突細(xì)胞(imDCs)混合移植于糖尿病小鼠，發(fā)現(xiàn)移植物的存活時(shí)間明顯延長并維持血糖在較低水平，糖化血紅蛋白控制效果良好，證實(shí)了未成熟樹突細(xì)胞的免疫耐受功能，但在移植一段時(shí)間后，血糖水平升高并恢復(fù)高血糖狀態(tài)，移植物功能減退，其可能原因是未成熟樹突細(xì)胞體內(nèi)刺激成熟，因此體內(nèi)如何長期維持樹突細(xì)胞的未成熟或耐受狀態(tài)仍是一個(gè)難題.有研究發(fā)現(xiàn)移植間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以降低I型及Ⅱ糖尿病的血糖值，并推測其降低血糖的機(jī)制可能是促進(jìn)胰島細(xì)胞再生、免疫調(diào)節(jié)以及提高胰島的敏感性[14-15].許多研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分泌的細(xì)胞因子EGF和HGF對β細(xì)胞的增加和凋亡至關(guān)重要，還分泌VEGF等促進(jìn)移植物新生血管形成，增加細(xì)胞間的血管密度[16-18].Gao 發(fā)現(xiàn)移植的MSCs在糖尿病動物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)移到胰腺，促進(jìn)β細(xì)胞再生和修復(fù)，在體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞可以使胰島細(xì)胞增加P-Akt和P-Erk的表達(dá).在體外，胰島細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)也可使P-Akt和P-Erk的表達(dá)量增加，而Akt和Erk又是β細(xì)胞增值的主要調(diào)節(jié)者[19].本文也證實(shí)胰島與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)混合移植可以延長移植物的存活時(shí)間并使血糖維持在較低的水平，但其具體的作用機(jī)制尚待深入研究，作者推測β細(xì)胞的再生可能是通過復(fù)制先前存在的β細(xì)胞或通過間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在胰腺細(xì)胞的組織再生.

研究報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞不僅可抑制單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化，抑制樹突細(xì)胞的成熟，還能產(chǎn)生多種具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子包括抑制未成熟樹突細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子.如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的TSG-6可抑制骨髓來源的樹突細(xì)胞成熟[20]，分泌IL-6參與調(diào)控未成熟樹突細(xì)胞保持不成熟的細(xì)胞表型[21]，此外，還分泌PGE2參與調(diào)控單核細(xì)胞分化成未成熟樹突細(xì)胞[22].間充質(zhì)干細(xì)胞還可減少成熟樹突細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，減少IL-12的產(chǎn)生，減少T細(xì)胞的激活[20].另有研究表明MSC-DC發(fā)揮抑制作用是通過細(xì)胞直接接觸作用而非通過分泌可溶因子[23]，而PD-L1(programmed-death ligands 1)是表達(dá)于樹突細(xì)胞上的B7家族分子，可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)其受體PD-1并與其結(jié)合引發(fā)下游反應(yīng)而誘導(dǎo)T細(xì)胞分化或失能等，而且imDCs對T細(xì)胞活化的影響與imDCs上表達(dá)的PD-L1有關(guān)[24-25].本實(shí)驗(yàn)利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)及MTT檢測法分析體外imDCs與MSCs對同源異體T細(xì)胞刺激活化影響，發(fā)現(xiàn)imDCs與MSCs均能有效抑制T細(xì)胞增殖，而且imDCs與MSCs聯(lián)合對T細(xì)胞的抑制效果最為明顯， MSCs，imDCs，imDCs+MSCs聯(lián)合胰島移植治療糖尿病能夠有效維持血糖低水平的可能機(jī)制是這些細(xì)胞影響了T細(xì)胞的活化及增殖，而imDCs+MSCs更加強(qiáng)了對T細(xì)胞的抑制效果，而imDCs+MSCs與T細(xì)胞的抑制效果是否與PD-L1分子相關(guān)尚需進(jìn)一步研究.

作者通過建立的高質(zhì)量、高數(shù)量胰島細(xì)胞的分離系統(tǒng)，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、未成熟樹突細(xì)胞(imDCs)與胰島細(xì)胞一起移植于糖尿病小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島移植物的存活時(shí)間相較于胰島細(xì)胞與imDCs或胰島細(xì)胞與MSCs混合移植均延長，且其降低血糖的效果顯著改善，糖化血紅蛋白控制效果最為理想，對胰島功能重建、血糖長期穩(wěn)定控制以及免疫耐受均有一定借鑒意義.

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(編輯 WJ)

Co-Transplantation of Islets with Mesenchymal Stem Cells and Immature Dendritic Cells in the Treatment of Mouse Diabetes

WANGTing-ting1,WANGHong-can1,LUYu-rong2,YEDong-shuo2,YANGDeng-ke2,ZHANGGuang-tao3,ZHANGFang-ting3,LONGGuang-hui3,ZhangJian1,YANGYin-ke1*

(1.College of Biology,Hunan University,Changsha 410082,China; 2.Shenzhen BioScien Pharmaceutical Ltd.,Shenzhen 518000,China;3.Shenzhen Hospital,Peking University,Shenzhen 518000,China)

To establish an effective plan for immune tolerance of islets transplantation,immature dendritic cells (imDCs) were identified by flow cytometry (FCM).Mesenchymal stem cells (MSCs) were incubated to differentiate into osteoblasts and islets were identified with dithizone (DTZ) staining method.From the results of three co-transplantation groups,it was found that transplantation did not significantly prolong graft survival (7±2.65 d),but remarkedly decreased blood glucose and glycosylated hemoglobin concentration in the diabetes of mouse by co-transplantation of 200 islets and 2×105imDCs.Co-transplantation of 200 islets with 2×105MSCs could significantly decrease blood glucose level and prolong graft survival for 8±2.31 days.Transplantation of 200 islets with 2×105MSCs and 2×105imDCs could not only restore normal blood glucose level,but also significantly prolong graft survival for 12.6±3.48 days.This result indicates that co-transplantation of islets with imDCs or MSCs can promote graft survival and reverse blood glucose level,and at the meanwhile effectively control the glycosylated hemoglobin concentration as well,which is better than islets transplantation alone.

dendritic cell; mesenchymal stem cells; islets transplantation; diabetes; HbA1c

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.01.007

2016-03-15

深圳科技創(chuàng)新委技術(shù)研究開發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目(2012026154206)

* 通訊作者,E-mail：ykyang99@hnu.edu.cn

R392.4

A

1000-2537(2017)01-0044-07