陳燁 鄒聰華 鄭曉春
【摘要】 目的:探討鞘內(nèi)注射艾司洛爾對福爾馬林炎性大鼠脊髓背角pERK蛋白表達(dá)的影響。方法:36只SD大鼠鞘內(nèi)置管后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水組(N組)、艾司洛爾注射液400 μg/kg組(S1組)、艾司洛爾注射液800 μg/kg組(S2組),各12只。鞘內(nèi)置管5 d后,各組注射以上藥物,然后在大鼠后肢皮下注射福爾馬林50 μL,以Vonfrey及Hargreaves法測定機(jī)械縮足反射閾值(MWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(TWL),觀察大鼠的疼痛行為學(xué)變化。觀察1.5 h后,采用免疫組織化學(xué)方法檢測脊髓背角pERK蛋白表達(dá)。結(jié)果:與N組相比,S1、S2組的Ⅱ相階段的疼痛行為均有減少,且S1、S2組L4~5節(jié)段脊髓表達(dá)的pERK蛋白表達(dá)均比N組少(P<0.01)。結(jié)論:鞘內(nèi)注射艾司洛爾可減少福爾馬林大鼠脊髓背角pERK蛋白表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】 疼痛; 脊髓; 艾司洛爾; pERK
腎上腺素受體分布于大部分交感神經(jīng)節(jié)后纖維所支配的效應(yīng)器細(xì)胞膜上,其受體分為3種類型,即β1受體、β2受體和β3受體。β1受體主要分布于心肌,可激動引起心率和心肌收縮力增加,其代表為艾司洛爾,近幾年廣泛應(yīng)用于臨床。文獻(xiàn)[1-4]研究發(fā)現(xiàn)該阻滯藥可減少麻醉維持藥物的用量,而靜脈注射艾司洛爾可減少丙泊芬的注射痛[5]。但β1受體阻滯藥艾司洛爾是否具有調(diào)節(jié)疼痛的作用仍未闡明。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最具代表性的通路,ERK信號通路的調(diào)節(jié)是治療糖尿病神經(jīng)病理性痛的新靶點(diǎn)[6]。轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)是ERK信號通路最重要的下游信號蛋白,p-ERK可從胞漿轉(zhuǎn)位到核內(nèi)通過磷酸化CREB發(fā)揮其對靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[7]。本研究擬通過鞘內(nèi)注射艾司洛爾,觀察大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表達(dá)的變化,來探索艾司洛爾是否具有疼痛調(diào)節(jié)作用,現(xiàn)報告如下。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器 Microspianl導(dǎo)管(美國ALZA公司),艾司洛爾注射液(江蘇奧賽康醫(yī)藥公司,批號20150213),5%福爾馬林(NS 3.2 mL+37%福爾馬林0.5 mL),Real time PCR儀(TAKARA公司,日本),MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,PCR試劑盒(Invitrogen Life公司,美國),兔抗鼠pERK一抗(4370S,Cell Signaling,USA),羊抗兔生物素化二抗(BA1003,武漢博士德生物工程有限公司),DAB顯色試劑盒(AR1022,武漢博士德生物工程有限公司)。
1.2 動物選擇及鞘內(nèi)置管 SD雄性大鼠,由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,體重260~290 g。用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射,參照文獻(xiàn)[8]的方法,鞘內(nèi)置管。置管隔天行注射2%利多卡因?qū)嶒灒闯霈F(xiàn)雙下肢無力的大鼠剔除。
1.3 實驗分組 將置管成功的大鼠隨機(jī)分為三組,各12只。生理鹽水組(N組),艾司洛爾注射液400 μg/kg組(S1組),艾司洛爾注射液800 μg/kg組(S2組)。置管5 d后,大鼠注射各組藥物后在同側(cè)足掌皮下注射5%福爾馬林50 μL。
1.4 行為學(xué)觀察 以文獻(xiàn)[9]的Vonfrey細(xì)絲法和文獻(xiàn)[10]的Hargreaves法測定機(jī)械縮足反射閾值(MWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(TWL),觀察大鼠術(shù)后1.5 h的疼痛行為學(xué)變化。Von法是用Von Frey絲刺激大鼠注射處旁,逐漸加壓至大鼠出現(xiàn)抬腿、添足行為,記錄壓力值。Hargareaves法是熱痛刺激儀照射大鼠足底,至出現(xiàn)回避。每只大鼠測定5次,每次間隔3 min,取平均值。
1.5 免疫組化方法 注射甲醛1.5 h后,各大鼠均在注射福爾馬林后1.5 h斷頭處死,剪開脊柱肌肉及椎板,暴露脊髓和L5神經(jīng)節(jié),截取L4~5段脊髓,置于甲醛固定液中固定后石蠟包埋切片,切片經(jīng)抗原修復(fù)、封閉非特異抗原、一抗兔抗Fos血清(1∶50)、二抗羊抗兔IgG血清及DAB呈色處理后,蘇木素復(fù)染,透明、封片。采用LEICA Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)對免疫組織化學(xué)染色的切片進(jìn)行圖像分析,每張圖像選用積分光密度(integrated optical density,IOD)來表示pERK陽性反應(yīng)產(chǎn)物的量。
1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,Levene法檢測各組樣本方差齊性。方差齊時,各組pERK相對蛋白濃度采用Friedman ANOVA方差分析,pERK的IOD值的組間采用One-way ANOVA方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義時用LSD法比較;方差不齊時,采用多因素方差分析,pERK的IOD值的組間比較采用Kruskal-Walllis秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
N組、S1組、S2組注射甲醛后出現(xiàn)疼痛反應(yīng),表現(xiàn)為注射足只能稍受力或不能受力,抬起甚至舔咬注射足??捎^察到完整的雙相疼痛反應(yīng),即注射后即刻出現(xiàn)3~5 min的急性疼痛時相(第一時相),中間5~10 min的靜息期,隨后出現(xiàn)可持續(xù)40~60 min的繼發(fā)性疼痛時相(第二時相),靜息期注射足可正常行走,無明顯疼痛反應(yīng)。注射福爾馬林后各組大鼠均出現(xiàn)疼痛行為,與N組相比,S1、S2組MWT均減低,TWL縮短,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。與Ⅱ相N組IOD值(88.35±4.83)比較,S1、S2組大鼠脊髓背角pERK蛋白表達(dá)均變少,IOD值為(41.85±3.92)、(22.23±2.62)均下降(P<0.01),見圖1。
3 討論
急慢炎性疼痛實驗中,福爾馬林實驗是具有代表性的模型[11],它廣泛應(yīng)用于疼痛相關(guān)機(jī)制及止痛藥的評價。有研究表明,大鼠后足注射福爾馬林后即可出現(xiàn)2個疼痛機(jī)制不同的反應(yīng)時相:Ⅰ相(5~10 min)是福爾馬林直接刺激外周傷害感受器所致;Ⅱ相(15~50 min)是主要是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元興奮性增加而導(dǎo)致中樞敏化有關(guān)[12-13]。本研究中N組大鼠足底注射福爾馬林后,大鼠出現(xiàn)明顯的兩相疼痛反應(yīng),表明大鼠出現(xiàn)了炎性疼痛及痛覺過敏,Ⅱ相生理鹽水組的時間顯著高于艾司洛爾組,提示艾司洛爾能抑制炎性反應(yīng)所導(dǎo)致的第二期的疼痛中樞敏感化,這可能與艾司洛爾抑制交感神經(jīng)有關(guān)。endprint
絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要系統(tǒng),它被激活后可維持疼痛敏化狀態(tài)[14-15],其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是MAPK的重要成員,激活后的ERK可通過磷酸化神經(jīng)元膜離子通道或受體,改變神經(jīng)元的興奮性。例如,傷害性刺激通過ERK信號通路激活NR1受體,誘導(dǎo)中樞敏化。ERK信號通路還參與緩激肽誘導(dǎo)脊髓第2板層神經(jīng)元NMDA受體和AMPA受體電流增強(qiáng),誘發(fā)痛覺過敏[16-17]。本研究中福爾馬林致炎后的大鼠脊髓背角均可見高表達(dá)的pERK,說明存在傷害性刺激的持續(xù)性傳入。
本研究表明,艾司洛爾呈劑量依賴地減少福爾馬林炎性大鼠Ⅱ相的疼痛行為,并且抑制了脊髓背角pERK蛋白表達(dá)。Mizobuchi等[18]發(fā)現(xiàn)蘭地洛爾可減少福爾馬林炎性大鼠脊髓c-fos mRNA表達(dá),也表明了β1受體阻滯劑具有減少炎性疼痛的作用。文獻(xiàn)[19-20]研究發(fā)現(xiàn),β1受體阻滯劑阻滯感覺神經(jīng)中的河豚毒素相關(guān)的Na+離子通道,β-受體阻滯劑能激活游離細(xì)胞膜上的G-蛋白,產(chǎn)生突觸后或突觸前抑制,減少神經(jīng)介質(zhì)的釋放,提示β-受體阻滯劑對疼痛有中樞抑制作用,雖然艾司洛爾脂溶性低、在血液中被快速代謝,但并不排除其具有中樞作用的可能性。本研究采用置管給藥,理論上存在局部吸入血引起全身效應(yīng),但艾司洛爾是超短效藥,不可能持續(xù)存在幾個小時的鎮(zhèn)痛作用,所以推斷艾司洛爾在脊髓水平參與了疼痛的調(diào)節(jié)。雖然鞘內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用艾司洛爾的鎮(zhèn)痛效應(yīng)不足以完全逆轉(zhuǎn)痛行為,但其獨(dú)特的抗損傷效應(yīng)和累積的鎮(zhèn)痛效應(yīng),可能使其成為新的鞘內(nèi)鎮(zhèn)痛的輔助用藥。由于國內(nèi)外對艾司洛爾調(diào)節(jié)疼痛研究少,其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究并闡明。
參考文獻(xiàn)
[1]李彩虹.氣管表面麻醉與靜注艾司洛爾對全麻誘導(dǎo)插管時血流動力學(xué)的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2009,25(4):1072-1073.
[2] Lee M H,Chung M H,Han C S,et al.Comparison of effects of intraoperative esmolol and ketamine infusion on acute postoperative pain after remifentanil-based anesthesia in patients undergoing laparoscopic cholecystectomy[J].Korean J Anesthesiol,2014,66(3):222-224.
[3]騰士勇,陶國榮,于布為.艾司洛爾、拉貝洛爾和尼卡地平對氣管插管期間心血管反應(yīng)、腦電雙頻指數(shù)和熵指數(shù)的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2008,9(3):756-758.
[4] Akgün S E,Titiz L,Akpek E,et al.Pretreatment with a very low dose of intravenous esmolol reduces propofol injection pain[J].Agri,2013,25(1):13-18.
[5] Dhir R,Singh M R,Kaul T K.Effect of intravenous esmolol on analgesic requirements in laparoscopic cholecystectomy[J].Anaesthesiol Clin Pharmacol,2015,31(3):37-39.
[6] Ma W,Quirion R.The ERK/MAPK pathway, as a target for the treatment of neuropathic pain[J].Expert Opinion on Therapeutic Targets,2005,9(4):699-713.
[7] Song X S,Cao L,Xu Y B,et al.Activation of ERK/CREB pathway in spinal cord contributes to chronic constrictive injury-induced neuropathic pain in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2005,26(7):789-798.
[8] Yaksh T L,Rudy T A.Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space[J].Physiol Behav,1976,17(1):1031-1036.
[9] Chaplan S R,Bach F W,Pogrel J W,et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J].Neurosci Methods,1994,53(1):55-63.
[10] Hargreaves K,Dubner R,Brown F,et al.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia[J].Pain,1998,32(1):77-88.
[11] Onifer S M,Reed W R,Sozio R S.Antinociceptive Effects of Spinal Manipulative Therapy on Nociceptive Behavior of Adult Rats during the Formalin Test[J].Evid Based Complement Alternat Med,2015,3(4):52-54.endprint
[12] Diniz D A,Petrocchi,J A,Navarro L C.Serotonin induces peripheral mechanical antihyperalgesic effects in mice[J].Eur J Pharmacol,2015,15(2):767-769.
[13] Hagihira S,Taenaka N,Yoshiya I.Inhalation anesthetics suppress the expression of c-fos protein evoked by noxious somatic stimulation in the deeper layer of the spinal cord in the rat[J].Brain Research,1997,751(1):124-130.
[14]曹紅,張玉秋.ERK/MAPK信號通路與痛覺信息加工[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2011,6(2):370-373.
[15] Zhang X,Zhang H,Shao H.ERK MAP kinase activation in spinal cord regulates phosphorylation of Cdk5 at serine 159 and contributes to peripheral inflammation induced pain/hypersensitivity[J].Plos One,2014,31,9(1):87-89.
[16] Hu H J.ERK integrates PKA and PKC signaling in superficial dorsal horn neurons.Ⅱ.Modulation of neuronal excitability[J].Journal of Neurophysiology,2003,90(3):1680-1688.
[17] Zhuang Z Y,Gerner P,Woolf C J,et al.ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model[J].Pain,2005,114(6):149-159.
[18] Mizobuchi S,Matsuoka Y,Obata N.Antinociceptive Effects of Intrathecal Landiolol Injection in a Rat Formalin Pain Model[J].Acta Med Okayama,2012,66(3):285-289.
[19] Gencer A,Gunduz O,Ulugol A.Involvement of Descending Serotonergic and Noradrenergic Systems and their Spinal Receptor Subtypes in the Antinociceptive Effect of Dipyrone[J].Drug Res (Stuttg),2015,65(12):645-649.
[20] Hageluken A,Naurnberg B,Harhammer R,et al.Lipophilic beta-adrenoceptor antagonists are effective direct activators of G-proteins[J].Biochem Pharmacol,1994,47(10):1789-1795.
(收稿日期:2016-08-04) (本文編輯:張爽)endprint