胡元春，呂鳳霞

（1.新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南新鄉(xiāng)453000；2.河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司）

PCV2-Cap蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)與鑒定

胡元春1，呂鳳霞2

（1.新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南新鄉(xiāng)453000；2.河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司）

pCold是一種新型載體，可以在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性的目的蛋白，將含有Cap蛋白基因的重組質(zhì)粒pCold-ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可溶性表達(dá)Cap蛋白，通過SDS-PAGE和Western blot對(duì)融合蛋白進(jìn)行鑒定，大量表達(dá)后，對(duì)其進(jìn)行了純化。

PCV2；大腸桿菌

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PWMS）的病原。該病以發(fā)熱、漸進(jìn)性消瘦、呼吸困難和黃疸等癥狀為特征的慢性傳染病，更為嚴(yán)重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各種病原的繼發(fā)感染，造成的間接損失難以估計(jì)。目前，PCV2已經(jīng)成為嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一。

PCV2病毒包含兩個(gè)主要開放式閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼病毒復(fù)制酶相關(guān)蛋白（Rep）和病毒衣殼蛋白（Cap），其中Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有型特異性，存在3個(gè)特有的抗原位點(diǎn)，是研究PCV2基因工程苗的主要候選目的基因，也可作為PCV試驗(yàn)豬及自然感染豬血清學(xué)檢測(cè)的標(biāo)志。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用不同表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Cap蛋白進(jìn)行原核或真核表達(dá)［1］，研究其免疫特性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

BL21感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒pCold-ORF2，種毒PCV BH株及PCV陰、陽血清。

1.2 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

將陽性質(zhì)粒1 μl加入到制備的BL21感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min；在42℃水浴中作用90 s，迅速取出來放在冰中冷卻3～5 min；加入800 μl LB培養(yǎng)基，搖勻，放置在37℃培養(yǎng)45 min；取40 μl菌液涂布于濃度為50 μg/ml氨芐抗性平板上，37℃過夜培養(yǎng)。

1.3 目的蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化及大量表達(dá)

挑取單個(gè)菌落至3 ml含50 μg/ml的氨芐LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h；將含重組質(zhì)粒的大腸桿菌加入4管LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床振蕩培養(yǎng)，測(cè)量細(xì)菌濃度達(dá)到OD0.4～0.5，放入低溫（15～20℃）搖床中30 min；然后分別在1、2、3、4管中加入不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，放置在低溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)24 h；將菌液轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中離心4 min，棄去上清，用300 μl PBS吹打沉淀至懸浮，用超聲波裂解儀分別裂解4 min；將裂解出的蛋白在4℃離心機(jī)中離心，吸取上清液至新的EP管中，剩余的沉淀用400 μl PBS懸起；分別取50 μl上清液以及對(duì)應(yīng)的沉淀懸浮液，加入loading Buffer12.5 μl，100℃煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析鑒定。選擇條帶最粗的濃度作為最佳濃度。以最佳濃度的IPTG作為誘導(dǎo)濃度低溫誘導(dǎo)表達(dá)，在16 h、20 h、24 h、28 h取樣，每次50 μl菌液，加入loadingBuffer12.5 μ l，100℃煮沸5 min；上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析鑒定，根據(jù)條帶的粗細(xì)確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。選取最佳誘導(dǎo)濃度的IPTG，在最佳誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4 陰性對(duì)照

將未連接目的基因的pCold載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，選取最佳誘導(dǎo)條件，進(jìn)行大量表達(dá)。對(duì)表達(dá)出的菌液離心，棄去上清，沉淀用PBS重懸，超聲裂解儀裂解菌體，裂解出的上清作為陰性對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析鑒定及Western blot。

1.5 可溶性重組蛋白的純化

1.5.1 純化柱的制備

加2 ml樹脂于柱子中，靜置待上清與沉淀分層，打開柱子底部和頂部的蓋子，靠重力作用濾出上清；待上清完全濾出，加入6 ml的去離子水，重懸樹脂，靜置分層，濾出上清；加入6 ml 1×Native Purification Buffer，重懸樹脂，靜置分層，濾出上清，重復(fù)兩遍。

1.5.2 純化蛋白

將蛋白裂解液上清（可溶性蛋白）加入已制備好的柱子中，靜置待上清與沉淀分層，打開蓋子，濾出上清；用8 ml Native Wash Buffer重懸樹脂，靜置分層，濾出上清，重復(fù)3次；用8 ml Native Elution Buffer洗脫蛋白，收集上清。將誘導(dǎo)產(chǎn)物及純化產(chǎn)物分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析鑒定及Western blot。

1.6 SDS-PAGE電泳

將配好的12%膠板固定于電泳裝置，加入1×Running Buffer后加樣。將陰性對(duì)照GST、誘導(dǎo)產(chǎn)物、純化產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE電泳（上層膠80～90V，下層膠120～130V），當(dāng)指示劑遷移至底部時(shí)停止電泳，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，觀察條帶。

1.7 Western blot

將樣品按上述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（20V，30min），10%的脫脂乳37℃封閉3 h；加入用PBST稀釋的單抗，過夜；PBST洗滌膜3次，每次10 min；加入1∶20 000 IgG-HRP，室溫作用1 h，充分洗滌后，使用SuperSignal West Pico Trial Kit顯色后進(jìn)行X光顯影，觀察特異蛋白條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的蛋白表達(dá)與條件優(yōu)化

將不同濃度IPTG不同誘導(dǎo)時(shí)間的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，結(jié)果顯示pCold-ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21誘導(dǎo)后在23kD附近出現(xiàn)蛋白條帶，0.1mM的IPTG誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)表達(dá)24 h誘導(dǎo)量達(dá)到最高。

2.2 目的蛋白的純化

將上清經(jīng)親和層析柱純化后，純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，可得到一條較純的目的條帶。同時(shí)將空載體蛋白作為陰性對(duì)照。

2.3 Western blot結(jié)果

將純化前后的目的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，經(jīng)X光顯影后，在膠片上均出現(xiàn)大小約為23kD的特異性目的條帶，純化后的蛋白條帶單一，純化效果較好。上述結(jié)果說明表達(dá)的可溶性蛋白具有良好的PCV2抗原性。

3 討論

近年來，豬圓環(huán)病毒2型已成為獸醫(yī)病毒學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。Cap蛋白是PCV2的主要免疫原［2］，在流行病學(xué)診斷及疫苗學(xué)研究中具有重要地位，因此該蛋白是PCV2的研究熱點(diǎn)。國(guó)外已有利用表達(dá)的PCV2 ORF2編碼的Cap蛋白作為抗原建立PCV2抗體檢測(cè)ELISA的報(bào)道。

目前，對(duì)目的蛋白的表達(dá)主要是采用原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。該研究使用的質(zhì)粒pCold-ORF2中含有的PCV2 ORF2基因?yàn)轸然尾糠只?，去除了N端的大量稀有密碼子，可以在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。

該研究選用pCold載體與目的基因連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進(jìn)行蛋白的表達(dá)，極大提高可溶性蛋白的表達(dá)量。除此之外，降低重組蛋白合成的速率可以提高蛋白的可溶性，蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)模型研究表明，活性蛋白的產(chǎn)率取決于蛋白合成的速率、蛋白折疊的速率、蛋白聚集的速率。在高水平表達(dá)時(shí)，新生肽鏈的聚集速率一旦超過蛋白折疊的速率就會(huì)導(dǎo)致包涵體的形成。因此降低重組蛋白合成的速率可以提高蛋白的可溶性。在低溫環(huán)境下，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，蛋白質(zhì)合成也相應(yīng)較慢，新合成的蛋白質(zhì)會(huì)有更充分的時(shí)間折疊，同時(shí)降低培養(yǎng)溫度也能降低重組蛋白降解的速率，提高重組蛋白的穩(wěn)定性，但有一個(gè)下限為8～10℃，低于此溫度，大腸桿菌會(huì)停止生長(zhǎng)，蛋白液基本停止表達(dá)。所以該研究采用低溫（15～20℃）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

該研究將含有PCV2 ORF2基因?yàn)轸然尾糠只虻闹亟M質(zhì)粒pCold-ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中，通過最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，成功表達(dá)出了目的蛋白，獲得一個(gè)大約23kD的重組蛋白，通過Western blot分析，表明此蛋白具有很好的免疫原性。為建立PCV2感染診斷與檢測(cè)的血清學(xué)技術(shù)奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］琚春梅，陳煥春，劉正肥，等.應(yīng)用在大腸桿菌中表達(dá)的豬2型圓環(huán)病毒ORF2蛋白建立一種ELISA診斷方法［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（6）：689-693.

［2］劉長(zhǎng)明，陸月華，張超范，等.豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白在昆蟲桿狀病毒中的報(bào)道［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，27（6）：479-482.

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1004-5090（2017）04-0005-02

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