朱葛麗+臧淑妃+婁國強+施軍平

[摘要] 目的 探討5-脂氧化酶（5-LO）通路在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的作用。 方法 將4周齡ApoE-/-雄性小鼠16只隨機分為兩組：對照組（普通飼料）、NASH模型組（高脂高膽固醇飼料）。連續(xù)喂養(yǎng)12周后，肝組織油紅染色觀察脂肪變，采用HE染色進行NAFLD活動度評分（NAFLD activity score，NAS）。熒光定量RT-PCR檢測5-LO、BLT1等mRNA表達，Western Bot法檢測5-LO蛋白，酶聯(lián)免疫法檢測肝臟白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）。 結果 高脂高膽固醇飲食12周能誘導ApoE-/-小鼠出現(xiàn)NASH表現(xiàn)，建模成功。NASH模型組較對照組肝組織5-LO mRNA及蛋白表達明顯升高（P<0.01），肝勻漿LTB4水平[（71.09±18.23）pg/mL vs （46.71±11.71） pg/mL]升高（P<0.01），其受體BLT1 mRNA水平顯著升高（P<0.01），中性粒細胞趨化因子和相應受體MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表達均較對照組明顯升高（P<0.01）。 結論 5-LO炎癥通路通過上調(diào)中性粒細胞粘附浸潤相關因子，誘導中性粒細胞浸潤，促進非酒精性脂肪性肝炎進展。

[關鍵詞] 5-脂氧化酶；脂肪性肝炎；非酒精性；中性粒細胞

[中圖分類號] R575 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）28-0035-04

隨著人們飲食和生活方式的改變，與肥胖和代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）相關的非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）發(fā)病率逐年攀升，在普通人群中發(fā)病率達30%以上，而在肥胖個體中甚至達到80%以上，嚴重威脅人類健康[1]。既往研究表明，肝小葉內(nèi)中性粒細胞[neutrophil，也稱多形核白細胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）]浸潤是NASH早期的特征性病理改變[2]，但經(jīng)典TLR4 致炎信號通路激活不能完全解釋其發(fā)病。新近研究顯示，5-LO炎癥通路異常激活在MetS相關疾病包括肥胖、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化等疾病中參與系統(tǒng)性慢性低度炎癥的形成[3，4]，敲除5-LO 或BLT1 基因可使小鼠異常代謝表型明顯減輕[5，6]；但目前相關研究更多集中在外周脂肪組織，這條致炎通路在NASH早期肝小葉內(nèi)PMNs 浸潤過程中作用如何有待進一步研究。本研究利用ApoE基因敲除（ApoE-/-）的高脂高膽固醇飲食誘導NASH小鼠模型，觀察該通路異常在NASH早期肝小葉內(nèi)中性粒細胞浸潤過程中的可能作用。

1材料與方法

1.1 動物模型的建立及取材

SPF級4周齡C57BL/6J ApoE-/-雄性小鼠16只（購于南京大學國家遺傳工程小鼠資源庫），飼養(yǎng)于杭州師范大學動物實驗中心SPF級動物房，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機均分為兩組：對照組（n=8）予普通飼料喂養(yǎng)； NASH模型組（n=8）予高脂高膽固醇飼料（D12079B，Reasearch Diet，美國）喂養(yǎng)。連續(xù)喂養(yǎng)12周后處死動物，常規(guī)采集血清標本，由肝左葉固定部位取材，制備肝臟石蠟切片和冰凍切片，其余肝組織-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。本研究獲杭州師范大學倫理委員會審查通過。

1.2肝臟病理學檢查

肝臟冰凍切片行油紅O染色觀察肝細胞脂肪變，石蠟切片HE染色觀察肝細胞脂肪變性程度、氣球樣變、小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎癥程度以計算NAFLD活動度計分（NAFLD activity score，NAS）。

1.3 熒光定量RT-PCR

取適量肝組織，Trizol法提取總RNA，取總RNA 2 μg采用逆轉錄試劑盒（Roche）合成cDNA，再將逆轉錄產(chǎn)物3 μL在熒光定量PCR儀進行PCR擴增，以18S為內(nèi)參，以2-ΔΔCT比較相關基因的表達水平，各基因引物見表1。

1.4 Western Blot

取適量肝組織用RIPA裂解液裂解，上清液行蛋白濃度測定后，將等量樣品加入5X蛋白上樣緩沖液，95℃ 5 min變性。各組蛋白上樣50 μg，用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進行常規(guī)電泳、轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉30 min，按1∶1 000 加入兔抗小鼠5-LO（Abcam）一抗及兔抗小鼠β-actin（CST）一抗，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3次。按1∶5000加入山羊抗兔IgG（Abcam）二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次，化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像并進行分析。

1.5肝組織LTB4檢測

取肝組織15 mg加入生理鹽水500 μL進行勻漿，采用SPE（C-18）柱形筒（CAYMAN）萃取待檢液，根據(jù)ELISA試劑盒（CAYMAN）說明書進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，方差不齊則采用秩和檢驗，計量資料相關性分析采用Pearson檢驗。雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝組織病理學變化

油紅O染色結果顯示：對照組小鼠肝組織無明顯脂肪變，NASH模型組則出現(xiàn)明顯脂肪變。HE染色結果顯示：對照組肝臟肝小葉及門管區(qū)結構清晰，未見明顯脂肪變、氣球樣變以及炎癥細胞浸潤；NASH模型組肝細胞出現(xiàn)彌漫性脂肪變及不同程度氣球樣變，肝小葉內(nèi)有明顯炎癥細胞浸潤，計算NAS積分為3～7分，其中75%>4分達到NASH診斷標準。

2.2肝組織中5-LO/BLT1及相關炎癥因子mRNA表達水平

NASH模型組肝組織中5-LO以及BLT1 mRNA的表達均較對照組明顯升高（P<0.01），同時NASH模型組中性粒細胞趨化因子和相應受體MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表達均較對照組明顯升高（P<0.01），見圖1。

2.3肝組織中5-LO、BLT1 mRNA表達水平與NAS積分的相關性分析

對NASH模型組肝組織中5-LO以及BLT1 mRNA的表達水平與NAS積分進行Pearson相關分析，結果表明：5-LO mRNA的表達水平與NAS積分呈正相關（r=0.891，P<0.01）；BLT1 mRNA的表達水平與NAS積分呈正相關（r=0.889，P<0.01）。

2.4 肝組織5-LO蛋白表達水平

NASH模型組肝組織中5-LO的蛋白表達量較對照組明顯升高（圖2）。

2.5肝組織LTB4水平

NASH模型組肝組織中LTB4水平為（71.09±18.23）pg/mL，較對照組的（46.71±11.71）pg/mL明顯升高（t=-3.18，P<0.01）。

3 討論

本研究用ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠輔以高脂高膽固醇飲食，模擬現(xiàn)代流行的飲食習慣，建立非酒精性脂肪性肝炎的動物模型。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該模型同時伴隨著血糖升高、胰島素抵抗，合并肥胖、脂質(zhì)代謝紊亂等，符合人類NASH發(fā)病過程。與前期結果一致，ApoE-/-小鼠高脂高膽固醇飲食12周能成功建立NASH模型。

中性粒細胞是外周血中數(shù)量最多的白細胞，作為最早到達炎癥部位的免疫細胞，參與構成機體的第一道防線。來自本課題組以及國外研究均發(fā)現(xiàn)NASH早期肝小葉內(nèi)存在中性粒細胞浸潤這一特征性病理變化[7，8]。近年研究一致認為，以模式識別受體Toll 樣受體（TLRs）和庫普弗細胞（KC）為主介導的天然免疫異常介導了肝臟炎癥的發(fā)生：脂肪變的肝細胞在脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物所誘導的脂毒性、氧應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等多重刺激下釋放損傷相關危險信號，激活KCs、肝星狀細胞和肝實質(zhì)細胞等表達的TLRs，招募炎癥細胞并放大肝臟炎癥[9，10]。但上述經(jīng)典的發(fā)病機制并不能解釋肝小葉內(nèi)中性粒細胞浸潤這個NASH 早期的特征性病理改變。在不同飲食配方誘導的TLR4和TLR9基因敲除小鼠NASH 模型中，僅能一定程度減輕肝臟損傷但不足以完全抑制肝臟炎癥的發(fā)生[11，12]，提示盡管TLRs信號介導炎癥放大過程，但在早期的炎癥啟動階段可能存在著更為重要的非TLRs 依賴的炎癥激活途徑。

白三稀是一種經(jīng)典的促炎性脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物，由必需脂肪酸n-6多不飽和脂肪酸（PUFA）轉化生成的花生四烯酸（AA）在5-LO催化下形成，然后經(jīng)高親和力受體BLT1和低親和力受體BLT2表達廣譜和高效的致炎效應包括釋放趨化因子、招募PMNs、淋巴細胞等，其中5-LO、LTB4 和BLT1作為核心信號分子介導炎癥觸發(fā)和放大過程[13，14]。國外有研究發(fā)現(xiàn)予小鼠高脂飲食后，在肝臟和肌肉中LTB4 表達增加[15]。本研究也觀察到NASH模型組肝臟LTB4分泌增加，同時發(fā)現(xiàn)其催化酶5-LO在mRNA及蛋白表達水平均較對照組升高，其受體BLT1水平顯著升高，進一步分析5-LO、BLT1 mRNA表達量與NAS積分的相關性，結果示隨著肝臟脂肪變以及炎癥的進展，5-LO、BLT1mRNA表達量呈正相關。最近的研究顯示高脂血癥可通過調(diào)節(jié)5-LO促進中性粒細胞產(chǎn)生LTB4，從而導致炎癥的發(fā)生[16]。因此，脂代謝異常導致的5-LO致炎信號通路可能在NASH早期炎癥啟動尤其是特征性的肝小葉內(nèi)PMNs 浸潤過程中起了重要作用，可能主要由失衡的PUFAs 中間代謝產(chǎn)物為此炎癥過程提供了某種觸發(fā)或放大信號。

外周血液中的少量哨兵PMNs 在感知特異性危險信號后可被相應部位內(nèi)皮細胞捕獲、阻滯、粘附并跨越內(nèi)皮細胞遷移至炎癥部位，同時迅速促進其他PMNs向損傷組織大量浸潤。既往研究表明，組織損傷后，中性粒細胞立即釋放脂質(zhì)介質(zhì)，導致中性粒細胞進一步激活，激活的中性粒細胞進一步釋放趨化因子和炎癥反應的擴大，一步激活和炎癥反應的擴大，通過正反饋性的調(diào)節(jié)引起炎癥瀑布[17]。在炎癥性疾病比如類風濕性關節(jié)炎和過敏性哮喘疾病中，釋放的LTB4通過激活中性粒細胞LTB4受體BLT1招募更多的中性粒細胞，BLT1/中性粒細胞進一步激活釋放IL-1，其次誘導細胞釋放CCR1、CXCR2配體，中性粒細胞的招募被趨化因子極大的放大[18，19]。本研究中觀察到NASH模型組中性粒細胞趨化因子和相應受體MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表達均較對照組明顯升高，提示5-LO炎癥通路通過脂質(zhì)-細胞因子-趨化因子軸調(diào)控炎癥反應過程，并作為初始信號觸發(fā)后續(xù)細胞因子、趨化因子的釋放而參與中性粒細胞或混合性炎癥細胞招募和最終免疫效應的實現(xiàn)[20]。

本研究顯示，肝細胞脂質(zhì)代謝異常激活5-LO炎癥通路，LTB4合成增加，促進中性粒細胞趨化因子、粘附分子釋放，招募中性粒細胞向炎癥部位浸潤和觸發(fā)后續(xù)炎癥反應，造成組織損傷。肝臟5-LO、BLT1與NAS積分顯著正相關，提示5-LO炎癥通路在NASH的疾病進展中發(fā)揮重要作用。為明確5-LO炎癥通路在NASH中的作用，本課題組將進一步利用藥物阻斷該炎癥通路，為研究治療NASH新的作用靶點提供實驗依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Labrecque DR，Abbas Z，Anania F，et al. World Gastroenterology Organisation global guidelines：Nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis[J]. Journal of Clinical Gastroenterology， 2014，48（6）：467-473.

[2] Farrell GC，Rooyen DV，Gan L，et al. NASH is an inflammatory disorder：pathogenic，Prognostic and therapeutic implications[J]. Gut & Liver，2012，6（2）：149-171.

[3] Marcos MC，Joan C，Esther T. The 5-lipoxygenase/leukotriene pathway in obesity，insulin resistance，and fatty liver disease[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care，2011，14（4）：347-353.

[4] Cao RY，St AT，Gr？覿bner R，et al. Genetic and pharmacological inhibition of the 5-lipoxygenase/leukotriene pathway in atherosclerotic lesion development in ApoE deficient mice[J]. Atherosclerosis，2009， 203（2）：395-400.

[5] Martínez-Clemente，Marcos，F(xiàn)erré N，et al. 5-lipoxygenase deficiency reduces hepatic inflammation and tumor necrosis factor alpha-induced hepatocyte damage in hyperlipidemia-prone ApoE-null mice[J]. Hepatology，2010，51（3）：817-827.

[6] Spite M，Hellmann J，Tang Y，et al. Deficiency of the leukotriene B4 receptor，BLT-1，protects against systemic insulin resistance in diet-induced obesity[J]. Journal of Immunology，2011，187（4）：1942-1949.

[7] Gadd VL，Skoien R，Powell EE，et al. The portal inflammatory infiltrate and ductular reaction in human nonalcoholic fatty liver disease[J]. Hepatology，2014，59（4）：1393-1405.

[8] Moles A，Murphy L，Wilson CL，et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse[J].Journal of Hepatology，2014，60（4）：782-791.

[9] Henaomejia J，Elinav E，Jin C，et al. Inflammasome-mediated dysbiosis regulates progression of NAFLD and obesity[J].Nature，2012，482（7384）：179-185.

[10] Sohn W，Jun DW，Kang NL，et al. Lactobacillus paracasei，Induces M2-Dominant Kupffer Cell Polarization in a Mouse Model of Nonalcoholic Steatohepatitis[J]. Digestive Diseases & Sciences，2015， 60（11）：3340-3350.

[11] Chantal A，Rivera，Patrick Adegboyega，et al. Toll-like receptor-4 signaling and Kupffer cells play pivotal roles in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis[J]. Journal of Hepatology，2007，47（4）：571-579.

[12] Miura K，Kodama Y，Inokuchi S，et al. Toll-like receptor 9 promotes steatohepatitis by induction of interleukin-1β in mice[J]. Gastroenterology，2010，139（1）：323.

[13] Staff TPO. Correction：Leukotriene production is increased in abdominal obesity[J]. Plos One，2015，10（1）：e0117861.

[14] Tull SP，Yates CM，Maskrey BH，et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation：Novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment[J]. Plos Biology，2009，7（8）：e1000177.

[15] Li P，Oh dY，Bandyopadhyay G，et al. LTB4 promotes insulin resistance in obese mice by acting on macrophages，hepatocytes and myocytes[J]. Nature Medicine，2015，21（3）：239-247.

[16] Lai XF，Qin H D，Guo LL，et al. Hypercholesterolemia increases the production of leukotriene B4 in neutrophils by enhancing the nuclear localization of 5-lipoxygenase[J]. Cellular Physiology & Biochemistry International Journal of Experimental Cellular Physiology Biochemistry & Pharmacology，2014，34（5）：1723-1732.

[17] Odobasic D，Kitching AR，Holdsworth SR. Neutrophil-Mediated Regulation of Innate and Adaptive Immunity：The Role of Myeloperoxidase[J]. Journal of Immunology Research，2016，（6）：1-11.

[18] Dixit N，Wu DJ，Belgacem YH，et al. Leukotriene B4 activates intracellular calcium and augments human osteoclastogenesis[J]. Arthritis Research & Therapy，2014，16（6）：1-12.

[19] Sumida H，Yanagida K，Kita Y，et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis[J]. Journal of Immunology，2014，192（9）：4361-4369.

[20] Sadik CD，Luster A D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation[J]. Journal of Leukocyte Biology，2012，91（2）：207-215.

（收稿日期：2016-06-17）