唐一波，李超燕，吳細(xì)波，曹玉美（廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場，廣西 南寧 530317）

應(yīng)用PCR-RFLP方法檢測優(yōu)質(zhì)瘦肉型種公豬的氟烷基因

唐一波，李超燕，吳細(xì)波，曹玉美
（廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場，廣西 南寧 530317）

為構(gòu)建穩(wěn)定的抗應(yīng)激核心豬群，進(jìn)一步凈化隱性氟烷基因，采用PCR-RFLP技術(shù)檢測了良圻原種豬場公豬站在群公豬大約克夏、長白、杜洛克3個品種合計(jì)216頭生產(chǎn)公豬氟烷基因分布情況，并通過直接測序法對檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，在群的216頭生產(chǎn)公豬中只檢測到氟烷基因顯性純合子（HalNN），并未檢測出HalNn、Halnn兩種類型的個體，氟烷顯性基因HalN頻率和隱性基因Haln頻率分別為1.00和0，并在Hal基因第16內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)3個新的堿基突變位點(diǎn)。在生產(chǎn)公豬中，已實(shí)現(xiàn)氟烷隱性基因的剔除，為培育優(yōu)質(zhì)瘦肉型配套系種豬選育工作提供了有力的保障。

豬；氟烷基因；PCR-RFLP；應(yīng)激綜合征

氟烷基因（Halothane,Hal），又稱氟烷敏感基因或蘭尼定受體基因，是控制豬應(yīng)激綜合征的主效基因之一，當(dāng)該基因的cDNA中發(fā)生C1843→T1843突變時，豬只易產(chǎn)生應(yīng)激綜合征[1]（porcine stress syndrome, PSS）。PSS是指豬只在受到外界因子（如爭斗、運(yùn)輸、高熱、驅(qū)趕）的刺激時發(fā)生異常的應(yīng)激反應(yīng)而死亡或宰后產(chǎn)生PSE或DFD劣質(zhì)豬肉，它給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。Haln基因在我國地方豬種檢出率較低，但是在外來豬種中具有較高的檢出率。由于近年來不斷地引進(jìn)外來豬種進(jìn)行品種改良以及追求Haln對瘦肉率的遺傳效益，Haln基因有呈擴(kuò)散趨勢[2]。國內(nèi)的豬場大部分以外來豬種大約克夏豬、長白豬、杜洛克豬為主要規(guī)模化生產(chǎn)構(gòu)架，這3個品種及其生產(chǎn)的三元雜種商品豬均屬于高瘦肉率的豬種，與地方豬種相比更容易產(chǎn)生PSS。研究表明，國內(nèi)的地方品種在風(fēng)味及肉質(zhì)品質(zhì)上都要優(yōu)于國外的引進(jìn)品種如長白、大約克夏、杜洛克及其配套生產(chǎn)的三元雜種豬等，很可能在某些肉質(zhì)性狀的遺傳標(biāo)記上存在差異[3]。國內(nèi)外養(yǎng)豬行業(yè)的競爭十分激烈，而市場對豬肉的需求逐步從數(shù)量過渡到對優(yōu)質(zhì)、健康豬肉的需求，因此對應(yīng)激敏感基因的篩查及剔除具有重大意義。

氟烷基因型有3種，氟烷顯性純合子（HalNN）、氟烷隱性純合子（Halnn）、雜合子（HalNn），其中Halnn型雖然在生長速度和瘦肉率方面優(yōu)于HalNN，但易使豬只產(chǎn)生PSS，因此在育種群中作為父本的種公豬基因型應(yīng)當(dāng)優(yōu)選HalNN型[4]。近年來，隨著基因分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，對氟烷基因型的檢測方法也不斷更新。目前應(yīng)用比較廣泛的檢測技術(shù)有很多，包括高通量測序技術(shù)、芯片技術(shù)、時間飛行質(zhì)譜技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)?限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)技術(shù)（PCRRFLP法）等[5]。PCR-RFLP法由于便捷、準(zhǔn)確性高，在氟烷基因檢測上有較多的應(yīng)用。研究顯示，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Hha I進(jìn)行PCR-RFLP時，當(dāng)Hal基因C1843→T1843發(fā)生突變，則會導(dǎo)致Hha I內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)5＇GCG↓C3＇發(fā)生改變，表現(xiàn)為PCR產(chǎn)物可被限制性內(nèi)切酶Hha I切成不同的帶型[6]：若在凝膠上顯示2個條帶（493 bp+166 bp），基因型為NN；1個條帶（659 bp），基因型為nn；3個條帶（659 bp+493 bp+ 166 bp），則基因型為Nn。

良圻原種豬場公豬站存欄生產(chǎn)公豬216頭，是國內(nèi)首家應(yīng)用空氣過濾新工藝，集全國生豬品種改良、加快場內(nèi)種豬遺傳進(jìn)展以及社會化供精任務(wù)于一體的新式公豬站，配套服務(wù)公司內(nèi)部及社會客戶3萬余頭母豬，因此公豬遺傳效應(yīng)的改進(jìn)十分重要。為探究Haln基因在良圻原種豬場的分布情況，特對在群生產(chǎn)公豬、后備公豬進(jìn)行氟烷敏感基因的檢測，及時發(fā)現(xiàn)并淘汰公豬群體中攜帶Haln基因的個體，以期育成一個無Haln基因的抗應(yīng)激種豬群體，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、健康的豬肉。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年9月至2016年2月在廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場獸醫(yī)技術(shù)中心進(jìn)行。

1.2 材料

216頭試驗(yàn)種豬均來自廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場公豬站的生產(chǎn)公豬，其中大約克夏公豬68頭，長白公豬72頭，杜洛克公豬76頭。用耳號鉗剪取一小塊耳組織（約0.5 g），放于裝有1 mL 75%乙醇的1.5 mL離心管中，在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA的提取

參照基因組DNA抽提試劑盒說明提取樣品DNA，DNA樣品于-20℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成[1]

根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)DNA Star軟件分析，設(shè)計(jì)出一對合適的引物并由上海生工合成。

上游引物序列為：5＇-TCCAGTTTGCCACAGGTC CTACCA-3＇，下游引物序列為：5＇-ATTCACCGGAGT GGAGTCTCTGAG-3＇。

1.5 PCR擴(kuò)增體系及產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括上、下游引物各0.5 μL，Taq酶8μL，DNA模板1μL，ddH2O10μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，64℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸7 min后，4℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，預(yù)期擴(kuò)增片段659 bp。

1.6 RFLP分析

酶切總反應(yīng)體系20 μL：PCR產(chǎn)物10 μL，ddH2O 8 μL，限制性內(nèi)切酶Hha I 2 μL，37℃水浴恒溫過夜。酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.7 測序分析

在進(jìn)行RFLP檢測分析基因型個體后，隨機(jī)抽取5個樣本，將PCR產(chǎn)物送英俊生物有限公司進(jìn)行雙向測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬Hal基因的PCR擴(kuò)增

樣品經(jīng)過35個循環(huán)的PCR擴(kuò)增后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，在659 bp處出現(xiàn)單一的特異性條帶，與目的片段大小相符，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 Hal基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 豬Hal基因的酶切反應(yīng)結(jié)果

對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Hha I進(jìn)行消化，酶切結(jié)果用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。從表1可知，在216個樣本中僅檢測出HalNN基因型，沒有檢出Halnn型及HalNn型個體。

圖2 HhaⅠ酶切結(jié)果

表1 Hal基因的基因型頻率和等位基因頻率分布

2.3 測序結(jié)果

對已進(jìn)行RFLP檢測的基因型樣本隨機(jī)抽取5份進(jìn)行測序驗(yàn)證及序列比對，結(jié)果見圖3。測序結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)個體在Hal基因CDS的1 843位點(diǎn)處HhaI酶切位點(diǎn)C→T產(chǎn)生堿基變異，僅出現(xiàn)了堿基C的單一峰，證明了本研究中RFLP檢測結(jié)果的可靠性。

圖3 Hal基因測序結(jié)果

在本研究中未發(fā)現(xiàn)C1843→T1843位點(diǎn)的突變，但是卻在5個樣品中都發(fā)現(xiàn)了新的3處未報(bào)道的堿基突變位點(diǎn)。從圖4和5可以發(fā)現(xiàn)，在Hal基因第16內(nèi)含子上的18 280、18 359、18 361處分別存在一處新的突變位點(diǎn)，分別導(dǎo)致基因產(chǎn)生G→C、T→C、A→G的變異。雖然這些突變處于內(nèi)含子上，不直接參與基因的編輯，但是內(nèi)含子對基因的轉(zhuǎn)錄具有某種調(diào)控作用，使機(jī)體的基因表達(dá)發(fā)生改變。DNA上的內(nèi)含子可以轉(zhuǎn)錄到前體RNA中，Hal基因中內(nèi)含子16上產(chǎn)生的突變，是否導(dǎo)致其合成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能改變，從而影響豬只的生長性能及肉質(zhì)性狀，還需進(jìn)一步分析。

圖4 Hal基因第16內(nèi)含子18 280位點(diǎn)測序結(jié)果

圖5 Hal基因第16內(nèi)含子18 359和18 361位點(diǎn)測序結(jié)果

3 討論

RFLP（RestrictionFragment Length Polymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）是為第一代分子生物學(xué)標(biāo)記，與PCR技術(shù)相結(jié)合的PCR-RFLP技術(shù)具有操作便捷、穩(wěn)定性高、針對性強(qiáng)等特點(diǎn)[7]，可以直接在酶切后的電泳圖譜中進(jìn)行基因特定位點(diǎn)的分型及多態(tài)性檢測，近年來廣泛運(yùn)用于動物遺傳育種工作研究中。

影響豬肉品質(zhì)的因素主要有飼養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)水平、屠宰條件及遺傳因素，其中遺傳因素起到至關(guān)重要的作用。Hal基因作為影響豬肉品質(zhì)的基因之一，被廣泛的應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種當(dāng)中。研究結(jié)果表明，Hal基因具有多效性[8-9]。Hal基因一方面是調(diào)控豬只產(chǎn)生PSS的主效基因之一，是產(chǎn)生PSE或DFD劣質(zhì)豬肉主要因子；另一方面，Hal基因雜合子對豬的胴體性狀、瘦肉率、日增重等經(jīng)濟(jì)性能有一定的增效作用，同時在肉色、pH和失水率等性狀上，各基因型也存在顯著或極顯著的差異[4]。

研究表明，Halnn型母豬與HalNN、HalNn型相比，產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、斷奶仔豬重等繁殖性能顯著降低[10]。在常規(guī)的選種選育中，很容易將Hal基因雜合子豬在生長性能上的表現(xiàn)出來的優(yōu)勢作為主要選留依據(jù)進(jìn)行留種，從而使Haln基因頻率在群體里增加、擴(kuò)散。因此，在育種過程中，應(yīng)對核心群種豬進(jìn)行氟烷基因的檢測，淘汰種豬群中的Halnn、HalNn型個體。

2007年伍少欽等[11]采用PCR-RFLP方法對良圻原種豬場第二種豬場核心群112頭種豬進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)良圻原種豬場第二種豬場的核心群中攜帶隱性氟烷基因Haln的個體存在幾率很小。本次試驗(yàn)檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)C1843→T1843位點(diǎn)的突變，Hal基因檢測全為NN個體，HalN頻率為1.00，Haln頻率為0，說明良圻原種豬場公豬站的生產(chǎn)公豬攜帶Haln基因的幾率很小，具備開展優(yōu)質(zhì)瘦肉型抗應(yīng)激種豬配套系構(gòu)建的條件。在Hal基因第16內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)3處新的堿基突變位點(diǎn)，這些位點(diǎn)堿基的替換是否可能影響生產(chǎn)公豬的生長、繁殖性能，是我們下一步研究Hal基因作用、應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的方向。在接下來的育種工作中應(yīng)當(dāng)重視氟烷隱性基因的凈化工作，持續(xù)的對氟烷基因進(jìn)行檢測，及時發(fā)現(xiàn)并淘汰育種群中的Haln基因，培育出健康優(yōu)質(zhì)抗應(yīng)激配套系豬群。

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[11]伍少欽，唐榮福，吳志君，等.廣西畜牧獸醫(yī)[J]，2007（5）：214-216.

（編輯：富春妮）

Detection of the Halothane Gene in Breeder Boars of High-Quality Lean-Type Pig with Using PCR-RFLP

TANG Yibo,LI Chaoyan,WU Xibo,CAO Yumei
（Guangxi State Farms Yongxin Livestock Husbandry Group Co.,Ltd.,Nanning 530317,China）

In order to build stable core swinery against stress and purify recessive halothane gene in boar station of Liangqi original seed farm,allele frequency distribution of 216 pigs was examined using PCR-RFLP, and then was identified using sanger sequencing.The experimental pigs were Yorkshire,Landrace and Duroc, and were in semen collection stage.The results showed that there was only dominant homozygote(HalNN)and no heterozygote(HalNn)and recessive homozygote(Halnn)in experimental pigs,and the allele frequency of HalNand Halnwas 1.00 and 0,respectively.Moreover,we found 3 novel mutant site in 16th intron.Therefore,the recessive allele of halothane was cleaned to provide powerful guarantee for selective breeding high-quality lean-type boars.

pig;halothane gene;PCR-RFLP;stress syndrome

S828

A

1002-1957(2017)01-0060-03

2016-12-15

重大專項(xiàng)計(jì)劃—優(yōu)質(zhì)瘦肉型配套系種豬選育與產(chǎn)業(yè)化示范（桂科重14121003-2-3）

唐一波（1987-），男，廣西賀州人，助理畜牧師，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖工作.E-mail:tang09284217@163.com