焦緒娜，吳佳琦，李貝影，閆曉敏，黃 娟，單 虎

(青島農業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109)

貉源犬瘟熱病毒血凝素基因的克隆及序列分析

焦緒娜△，吳佳琦△，李貝影，閆曉敏，黃 娟*，單 虎*

(青島農業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109)

為了對1例貉源犬瘟熱(CD)進行病毒檢測并分析其血凝素H基因變異情況，本研究從1只疑似犬瘟熱病死的貉采病料進行研磨，利用RT-PCR方法擴增犬瘟熱病毒H基因，對擴增出的H基因片段進行克隆測序，并對得到的H基因序列進行分析。結果表明，該貉感染犬瘟熱病毒，得到的H基因核苷酸和氨基酸序列與CDV野毒株同源性較高，分別為89.1%～98.0%和85.4%～97.5%。 遺傳進化分析表明其屬于Asia-1型野毒株，N連接糖基化位點分析結果表明，該毒株在542 aa處比參考野毒株多了1個潛在的N糖基化位點，在525 aa-550 aa間多出了1個抗原表位。

犬瘟熱病毒；血凝素基因；N連接糖基化；進化分析

犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的世界范圍內流行的接觸性傳染病。目前犬瘟熱已經在阿根廷、澳大利亞、巴西、德國、匈牙利、意大利、南非、南韓、中國、美國等多個國家都有發(fā)生[1]。犬瘟熱病毒不僅能感染狐貍、貉子等毛皮動物，也能感染熊貓、獼猴[2]等，甚至有人從患 Pagrt’s 疾病(一種炎癥性骨病)的病人組織中檢測出 CDV核酸。犬瘟熱流行時一般是貉先發(fā)病然后是狐貍，且該病有地方流行性。發(fā)病動物表現(xiàn)出嚴重的免疫抑制[3]，病死率較高，對全世界的毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)有重大的影響。

H蛋白基因序列構建系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明犬瘟熱病毒包括America 1 、America 2、Arctic-like、Asia 1～4、South America 2～3、European、European wildlife、Rockborn-like、Africa等13個不同的基因型[4-6]，在我國流行的多為Asia-1型[7-8]。對各病毒結構蛋白的單克隆抗體進行研究來分析疫苗株和野毒株病毒結構蛋白的變異情況，結果表明犬瘟熱病毒中的H蛋白是所有結構蛋白中變異率最高的[9]。在免疫壓力下，H蛋白抗原非常容易發(fā)生漂變，因而免疫過的水貂、貉子、狐貍等毛皮動物仍有發(fā)生犬瘟熱的可能[10]。研究發(fā)現(xiàn)疫苗株和野毒株H蛋白的潛在天冬酸胺糖基化位點是不同的，疫苗株Convac及Onderstepoort株分別是7個和4個，而野毒株一般是8個～9個，其中309-311位的糖基化位點是野毒株所特有的，N連接糖基化位點的差異性能影響病毒的抗原性[11]，所以這些遺傳的差異可能是近年來暴發(fā)犬瘟熱的重要原因。

本試驗從山東榮成一養(yǎng)殖場送檢的貉體內分離得到了犬瘟熱病毒，利用RT-PCR 方法得到H基因片段，測序后進行同源性比對、系統(tǒng)進化分析、N糖基化位點的分析及對抗原表位進行預測分析。最后通過該病毒H基因與其他毒株比較分析該病毒株H蛋白發(fā)生的變異情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢病料、菌株和質粒 山東威海榮成某養(yǎng)殖場疑似感染犬瘟熱病毒貉的鼻拭子眼分泌物、肺臟、肝臟、脾臟。大腸埃希菌株DH5α、質粒pMD19-T均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 參考毒株 參考毒株有Rong(2016) 、00-2601、007Lm、9L、14-CO 12、48-05、095Cr、324-03、Argentina 24、CDV3、HeB(09)3、HLJ1、NJ(11)2和Onderstepoort 14個。

1.1.3 主要試劑 DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL 5 000、rTaq聚合酶、T4 DNA連接酶、膠回收純化試劑盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)，寶生物工程(大連)有限公司產品；犬瘟熱膠體金抗原檢測試紙，青島維爾福生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 榮成某養(yǎng)殖場部分貉表現(xiàn)為眼鼻有膿性分泌物，精神沉郁，食欲廢絕，最后死亡，送樣檢測時用CDV膠體金抗原檢測試紙檢測其鼻拭子和眼睛分泌物結果為CDV陽性。剖檢后發(fā)現(xiàn)肺臟和脾臟出血嚴重，采集肺臟、脾臟、肝臟放入研磨缽中用液氮研磨，研磨成粉狀的病料裝入10 mL離心管中加入適量的PBS。

1.2.2 RT-PCR

1.2.2.1 總RNA的提取 取250 μL病料懸液加上750 μLRNA裂解液，顛倒混勻6次～8次，室溫放置10 min。12 000 r/min、4℃離心5 min后吸上清600 μL至新1.5 mL EP管中，加上三氯甲烷150 μL，振蕩混勻，室溫放置5 min。12 000 r/min、4℃離心15 min。然后吸上清600 μL至新1.5 mL EP管中，加入等量的異丙醇，在-20冰箱放置1 h，12 000 r/min、4℃離心10 min。棄掉上清，向管中加入1 mL 75 mL/L乙醇。7 500 r/min、4℃離心5 min。棄上清，干燥(將管倒置自然干燥)最后加入20 μL DEPC水混勻。

1.2.2.2 PCR引物 參考CDV Onderstepoort(AF305419)株基因序列， 利用Primer Premier 5軟件在CDV H基因兩端的相對保守區(qū)設計1對擴增H基因編碼區(qū)的特異性引物，擴增長度為1 921 bp。引物由青島擎科生物公司合成，用DEPC水稀釋到20 μmol/L，放在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CDV-H-F(7075-7095):5′-AACAATGCTCT- CCTACCAAGA-3′

CDV-H-R(8975-8895):5′-AATGCTAGAG- ATGGTTAATT-3′

1.2.2.3 RT-PCR擴增目的條帶 以病毒總RNA為模板，應用特異引物擴增CDV H基因片段。RT-PCR反應的總體系為20 μL，其中dd H2O 5.5 μL,5×Reverse Transcriptase M-MLV buffer 4 μL,dNTP 2μL,上、下游引物各1 μL,RRI 0.5 μL,M-MLV 1 μL，RNA模板5 μL。反轉錄條件:42℃ 1 h，72℃10 min。PCR反應體系為25 μL，其中RT產物2 μL，dd水 8.5 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaqEX Taqversion2.0 12.5 μL。PCR反應條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，52℃ 1 min，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃結束反應。

1.2.3 CDV H基因的克隆與鑒定 PCR產物經電泳后，切下特異性條帶，用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit回收，按常規(guī)方法與pMD18-T載體進行連接，基因與載體的比例為4∶1，反應體系為10 μL，16℃過夜然后并轉化到感受態(tài)E.coliDH5α細胞中，涂布于含Amp(100 mg/L)的LB平板培養(yǎng)，待長出單菌落后挑單菌落接種于含100 μg/mL Amp的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。菌液進行PCR鑒定，選取陽性克隆子送至青島擎科測序，并利用DNA Star軟件對所測定的H基因全長cDNA的核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行編輯，與疫苗株Onderstepoort、CDV3株和CDV野毒株進行了序列分析、同源性比對、系統(tǒng)進化分析、N連接糖基化位點分析及抗原位點預測分析。

2 結果

2.1 CDV H基因的PCR擴增

以提取的病毒RNA為模板，用所設計的引物進行PCR反應擴增H基因，所獲得的PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳呈單一條帶，大小與預期1 921 bp相符(圖1)。將該毒株命名為Rong(2016)。

M.DNA標準DL 2 000;1.PCR產物

2.2 重組質粒的PCR鑒定

連接轉化之后挑單菌落進行菌液PCR鑒定，得到了約為1 921 bp大小的片段，證明所挑取的克隆為正確的重組轉化子(圖2)。

M.DNA標準DL 5 000 1.陽性PCR結果;2、3.陰性PCR結果M.DNA Marker DL 5 000 1.Positive PCR results;2，3.Negative PCR results

2.3 Rong(2016) H序列分析

2.3.1 核苷酸同源性分析 將Rong(2016)與疫苗株和國內外各種犬瘟熱病毒分離株進行序列分析和同源性比對。H基因核苷酸序列與野毒株同源性為89.1%～98.0%，其中與2006年日本得到的毒株095Cr 同源性最高達到了98.0%，其次是2009年在中國貉體內分離到的HeB(09)3，同源性為97.7%，與疫苗株Onderstppoort株、CDV3同源性分別為90.5%和90.9%(表1)。

2.3.2 推導氨基酸序列分析 氨基酸序列與野毒株同源性為85.4%～97.5%，與疫苗株Onderstepoort、CDV3核苷酸序列同源性分別為89.1%和90.8%(表1)。

表1 Rong(2016)H基因與參考株H基因核苷酸和氨基酸同源性分析

注：右上角為核苷酸比對結果，左下角為氨基酸比對結果。數(shù)字代表的毒株分別為：1.Rong(2016)；2. 00-2601；3. 007Lm；4. 9L；5. 14-CO 12；6. 48-05；7. 095Cr；8. 324-03；9.Argentina 24；10.CDV3；11.HeB(09)3；12.HLJ1；13.NJ(11)2；14.Onderstepoort。

Note:The comparison of nucleotides is in the upper right, the comparison of amino acids is in the bottom left.The digits show different strains: 1.Rong(2016)；2. 00-2601；3. 007Lm；4. 9L；5. 14-CO 12；6. 48-05；7. 095Cr；8. 324-03；9.Argentina 24；10.CDV3；11.HeB(09)3；12.HLJ1；13.NJ(11)2；14.Onderstepoort.

2.3.3 系統(tǒng)進化分析 參考毒株分別來自America1、America2、Arctic-like、Asia1～4、South America2～3、European、European wildlife、Rockborn-like、Africa等13個基因型，將測得的H基因序列與參考毒株核苷酸序列構建系統(tǒng)進化樹， Rong(2016)與HeB(09)3、HLJ(07)1在同一個分支上，屬于Asia-1(圖3)。

2.4 N糖基化位點與部分毒株和疫苗株的比較

用糖基化位點預測網站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/對Rong(2016)推導的氨基酸進行N糖基化位點的預測，并與其他毒株做比較。本試驗所得序列氨基酸與野毒株特有的309-411中的N連接糖基化位點，與其他野毒株相比較在542處多了1個N連接糖基化位點(表2)。

表2 Rong(2016)N連接糖基化位點與部分毒株和疫苗株的比較

圖3 基于CDV H基因核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化發(fā)生樹

2.5 H蛋白抗原表位分析結果

利用Protean分子生物學軟件，對本試驗中得到的H蛋白進行抗原表位分析發(fā)現(xiàn)，Rong(2016)與其他野毒株和疫苗株相比，在525-550 aa處多了1個抗原表位(圖4)。

圖4 Rong(2016)與野毒株和疫苗株抗原表位比對

3 討論

基于H蛋白基因序列構建系統(tǒng)發(fā)生樹可將犬瘟熱病毒分13個不同的基因型[4-6]。本試驗在進行氨基酸和核苷酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析時，采用的不同參考株是文獻報道的發(fā)現(xiàn)新病毒并進行分型時常用的參考毒株，有很強的參考價值和實際意義。犬瘟熱病毒基因型的差異與病毒的地區(qū)分布有直接關系，在我國主要流行的是Asia-1型，本次從貉子體內分離的病毒也屬于Asia-1型。

H蛋白潛在的N基化位點的增加可能會使CDV的毒力增強[11]。本試驗得到的病毒H糖基化位點比一般野毒株還要多1個N連接糖基化位點，所以可以推測其毒性相較于其他野毒株毒性可能會更強，研究表明近年來我國山東等地區(qū)毛皮動物中發(fā)生CD，可能與該變異株的流行有關[12]。CDV與SLAM受體結合的重要區(qū)域包括H蛋白542-544位的氨基酸[13]，它的變化會影響病毒入侵細胞、致病性等，而本試驗得到的H蛋白中在542-544 aa正好形成了一個新的N連接糖基化位點，這或許導致CDV H蛋白的中和表位改變，使得病毒對疫苗株誘導的中和抗體的中和作用產生逃避。另一方面，得到的H蛋白在 525-550 aa間多了1個抗原表位，新毒株在抗原性和毒力上發(fā)生了變異，能夠逃避疫苗免疫的保護，可能是臨床免疫失敗的原因。有研究表明疫苗株和野毒株膜蛋白抗原表位是不同的[14]。因此選擇新分離的當?shù)亓餍兄曜鳛镃DV疫苗毒株尤為重要。

近年來，貉、水貂、狐貍等毛皮動物養(yǎng)殖場頻繁發(fā)生犬瘟熱，本試驗的實驗動物是榮成某養(yǎng)殖場送檢的貉，經了解本養(yǎng)殖場免疫過犬瘟熱疫苗但是還是發(fā)生了犬瘟熱，本試驗研究了從貉體內分離的CDV H基因個方面的變化，其抗原區(qū)域和N糖基化位點都比疫苗株多， 加強對臨床上犬瘟熱疫苗免疫失敗的原因探究，有助于保護毛皮動物。另外，研發(fā)純度高、安全性好、不含病原成分不能引起動物染病且誘導動物產生細胞免疫和體液免疫的新型疫苗刻不容緩。

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Cloning and Sequence Analysis of Canine Distemper Virus Hemagglutinin Gene from Raccoon Dog

JIAO Xu-na,WU Jia-qi,LI Bei-ying,YAN Xiao-min,HUANG Juan,SHAN Hu

(CollegeofAnimalScience&VeterinaryMedicine,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong,266109,China)

In order to detect canine distemper virus (CDV) and analysis the genetic variation of hemagglutinin gene(H),samples were collected from a CDV-suspected raccoon dog and subjected to amplification of H gene by the method of reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),PCR amplicon was cloned and sequenced,and the sequence of H gene was analyzed.The results indicated that the racoon dog was infected with CDV strain.The homologies of nucleotide and amino acid among sequence obtained from this experiment and reference strains are 89.1%-98.0% and 85.4%-97.5%,respectively.the CDV strain belong to Asia-1 wild strain based on phylogenetic analysis,the analysis of N-glycosylation sites showed that there was a more N-glycosylation site at the 524th amino acid,and there was a more antigenic epitope at 525-550 aa compared to other strains.

Canine distemper virus; hemagglutinin gene(H); N-glycosylation; phylogenetic analysis

2016-06-27

國家自然科學基金項目(31472196)；青島農業(yè)大學應用型人才培養(yǎng)特色名校工程2015年大學生科技創(chuàng)新項目

焦緒娜(1990-)，女，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事動物傳染病防制與生物制品學研究?！魍蓉暙I作者 *通訊作者

S852.659.5；Q789

A

1007-5038(2017)02-0022-06