顧棟樺　付琳琳　平金良

[摘要] 目的 研究caveolin-1腳手架樣結(jié)構(gòu)域（caveolin-scaffolding domain，CSD）多肽對HEp2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并探討其分子機(jī)制。 方法 CSD多肽和亂序多肽由人工合成得到，并在N'末端用生物素標(biāo)記。用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測CSD多肽在HEp2細(xì)胞中的滲透情況，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力，Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力；免疫印跡法檢測HEp2細(xì)胞中FAK蛋白的表達(dá)水平及磷酸化程度。 結(jié)果 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示CSD多肽能夠較好地進(jìn)入HEp2細(xì)胞內(nèi)；CSD多肽組HEp2細(xì)胞遷移能力明顯低于亂序組和空白對照組（P均<0.01），而亂序肽組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；CSD多肽組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯低于亂序組和空白對照組（P均<0.01），而亂序肽組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，CSD多肽組FAK相對磷酸化程度明顯低于亂序組與空白對照組（P均<0.01）。 結(jié)論 caveolin-1腳手架樣結(jié)構(gòu)域多肽可順利進(jìn)入HEp2細(xì)胞內(nèi)，而且可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，F(xiàn)AK磷酸化水平的下調(diào)可能是其中重要的分子機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] Caveolin-1；粘著斑激酶；多肽；鱗狀細(xì)胞癌；腫瘤浸潤

[中圖分類號] R73-3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）30-0029-04

Caveolin-1是人體細(xì)胞膜上重要的膜蛋白，它能夠和許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白結(jié)合，影響下游信號通路活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。在部分腫瘤的研究中，Caveolin-1基因的過表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長。Caveolin-1蛋白結(jié)構(gòu)中存在一個腳手架樣的區(qū)域（caveolin-scaffolding domain， CSD），CSD是caveolin-1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜蛋白生物學(xué)活性的重要區(qū)域，在細(xì)胞生命活動中發(fā)揮重要作用[1]。肽類藥物因其具有特異性的靶向作用，正逐漸成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)[2]。本研究通過人工合成CSD多肽，觀察其作用于喉鱗狀細(xì)胞癌HEp2細(xì)胞株后，對腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及培養(yǎng)條件

人喉鱗狀細(xì)胞癌HEp2細(xì)胞株購于美國ATCC公司，用含10%胎牛血清（hyclone公司，美國）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、飽和濕度。

1.2 CSD多肽的氨基酸序列與合成

CSD多肽氨基酸序列為DGI WKA SFT TFT VTK YWF YR，以同樣的氨基酸種類和數(shù)量隨機(jī)排列，并合成得到的亂序多肽做為陰性對照。多肽序列均由上海翱博生物科技有限公司合成，肽鏈N端連接生物素標(biāo)記，多肽作用于細(xì)胞的終濃度為4.0 μM。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測多肽的細(xì)胞滲透效能

HEp2細(xì)胞貼壁生長至細(xì)胞密度為70%時，加入CSD多肽孵育6 h后，棄去培養(yǎng)液，加入冷丙酮固定10，然后滴加堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的抗生物素抗體（工作濃度1：300；Jackson Immuno Research公司，美國），在濕盒內(nèi)37 ℃孵育2 h，用PBS沖洗后加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)（NBT/BCIP；Roche公司，瑞士）顯色。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取2×105 HEp2細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長至100%匯合時，換無血清培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組中加入CSD多肽，亂序多肽做為陰性對照組，無血清培養(yǎng)液為空白對照組。用移液器管嘴在細(xì)胞層輕輕劃出約1 mm寬的劃痕后繼續(xù)培養(yǎng)，在0、24 h、48 h時鏡下用Zeiss LSM Image Browser 3.1 軟件（Mississauge公司，加拿大）測量劃痕的寬度變化，細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)使用Biocoat Matrigel Invasion Chamber試劑盒（BD公司，美國），根據(jù)試劑盒說明書操作，步驟簡述如下：獲得約5×103 HEp2細(xì)胞，接種于上層小室中，加入無血清培養(yǎng)液至300 mL，實(shí)驗(yàn)組中加入CSD多肽，亂序多肽做為陰性對照組，無血清培養(yǎng)液為空白對照組，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用棉簽把表層的細(xì)胞抹去，加入4%多聚甲醛固定30 min，800 μL Giemsa染液染色20 min，取出膜片至顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個400倍視野計(jì)數(shù)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 免疫印跡法

細(xì)胞分為三組，實(shí)驗(yàn)組中加入CSD多肽，亂序多肽做為陰性對照組，無血清培養(yǎng)液為空白對照組，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，HEp2細(xì)胞用含有磷酸化酶抑制劑的蛋白裂解液處理，得到細(xì)胞總蛋白，蛋白用BCA法測定濃度，取60 μg蛋白行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉后加入一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗后加入HRP標(biāo)記的二抗（工作濃度1：2000，Santa Cruz公司，美國），目的蛋白條帶的顯示使用ECL試劑盒（pierce公司，美國），按照說明書步驟操作曝光顯影，目的條帶用Pro analyzer 4.0軟件進(jìn)行分析。一抗：小鼠抗人Phospho-FAK（Tyr397）及FAK單克隆抗體（Bioscience公司，美國），工作濃度1∶1000；小鼠抗人β-actin單克隆抗體（Sigma公司，美國），工作濃度1∶1000。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSD多肽能夠滲透進(jìn)入HEp2細(xì)胞內(nèi)

免疫細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，在CSD多肽處理的HEp2細(xì)胞中，經(jīng)NBT/BCIP顯色，顯微鏡下可看到HEp2細(xì)胞胞質(zhì)中顯現(xiàn)出藍(lán)紫色顆粒（圖1），說明CSD多肽能夠透過細(xì)胞膜有效滲入到細(xì)胞內(nèi)部。

2.2 CSD多肽對HEp2細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CSD多肽組、亂序肽組和空白對照組的48 h細(xì)胞遷移率分別為（15.11±3.09）%、（66.45±5.24）%和（68.13±5.73）%，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=116.77，P<0.01）；CSD多肽組細(xì)胞遷移能力明顯低于亂序肽組和空白對照組（P均<0.01），而亂序肽組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

2.3 CSD多肽對HEp2細(xì)胞侵襲能力的影響

細(xì)胞體外侵襲能力檢測結(jié)果顯示，CSD多肽組、亂序肽組及空白對照組每高倍視野侵襲的細(xì)胞數(shù)分別為（131.38±43.42）、（373.51±56.24）和（384.39±53.68），三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.14，P<0.01）；CSD多肽組細(xì)胞侵襲能力明顯低于亂序肽組和空白對照組（P均<0.01），而亂序肽組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

2.4 CSD多肽對HEp2細(xì)胞FAK磷酸化的影響

免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，CSD多肽組、亂序肽組與空白對照組的FAK相對磷酸化程度（磷酸化FAK蛋白量/總FAK蛋白量）分別為（0.23±0.02）、（0.43±0.04）、（0.45±0.03），三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.20，P<0.01），CSD多肽組明顯低于空白對照組與亂序肽組（P均<0.01），亂序肽組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CSD多肽組、亂序肽組、空白對照組的總FAK蛋白表達(dá)量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.052，P>0.05）。見圖4。

3 討論

人體細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在一個小凹樣結(jié)構(gòu)，稱為caveolea，caveolea在細(xì)胞生命活動中非常重要。Caveolin-1是caveolae的主要功能蛋白，大小為21～24 kD，caveolin-1蛋白由178個氨基酸構(gòu)成，其N端第82～101氨基酸殘基是其重要功能區(qū)域，具有一個腳手架樣結(jié)構(gòu)（caveolin-scaffolding domain，CSD），這個CSD結(jié)構(gòu)可以和許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白結(jié)合，并調(diào)節(jié)其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，最終影響細(xì)胞的生物學(xué)行為[1]。

研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細(xì)胞株的caveolin-1表達(dá)處于低水平狀態(tài)，增加caveolin-1的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤的凋亡[3，4]。一些腫瘤的臨床病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌[5]、肝細(xì)胞性肝癌[6]、結(jié)腸腺癌[7]的癌細(xì)胞中caveolin-1的表達(dá)水平越低，腫瘤患者的預(yù)后越差。因此許多學(xué)者認(rèn)為caveolin-1基因可能是一個抑癌基因。但是，有其他一些研究卻得出了相反的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)caveolin-1的高表達(dá)與腫瘤的惡性生物學(xué)行為相關(guān)[8]， 例如， 在肺大細(xì)胞癌中，caveolin-1表達(dá)越高，病人的預(yù)后越差[9]，增加caveolin-1基因的表達(dá)可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌[10]和胰腺癌細(xì)胞株[11]生長和轉(zhuǎn)移能力。因此，caveolin-1很可能在不同的條件下發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。

Ortiz等[12]在黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)caveolin-1蛋白第14位酪氨酸殘基的磷酸化能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而不能發(fā)生磷酸化的突變caveolin-1基因（Y14F-CAV1基因）卻不具有這樣的促進(jìn)功能。許多研究表明前列腺癌中caveolin-1基因處于高表達(dá)的狀態(tài)，而且caveolin-1的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度正相關(guān)[13，14]，而用caveolin-1腳手架結(jié)構(gòu)域氨基酸序列人工合成多肽（CSD肽），并且用CSD多肽作用于前列腺癌細(xì)胞，卻能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，并且減少腫瘤組織內(nèi)新生血管的生成[15]。因此，有理由推測，caveolin-1蛋白的CSD區(qū)域是其發(fā)揮抑制腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵部位，當(dāng)其N端氨基酸殘基磷酸化后，caveolin-1蛋白可能由于分子構(gòu)象的改變而使CSD的功能受到了抑制。如果能夠使CSD結(jié)構(gòu)處于持續(xù)的活性狀態(tài)，很可能就可以充分發(fā)揮CAV1的抗腫瘤的功能。

喉鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部腫瘤中的常見類型，研究表明，caveolin-1基因的過表達(dá)可以抑制喉鱗癌細(xì)胞株HEp2細(xì)胞的生長能力[16]，而且低表達(dá)caveolin-1基因的頭頸部鱗癌更容易發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[17]，表明caveolin-1在喉鱗癌中可能具有抑制腫瘤的作用。本研究中，我們?nèi)斯んw外合成得到了CSD多肽，并且作用于HEp2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSD多肽能夠順利進(jìn)入HEp2細(xì)胞內(nèi)，說明CSD多肽具有較好的滲透性。用CSD多肽處理HEp2細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力下降了77.82%，侵襲能力下降了65.82%，均被明顯抑制，而亂序肽并無明顯抑制效果，表明用外源性的CSD多肽在體外能夠抑制HEp2細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，具有一定的潛在臨床應(yīng)用前景。

CSD多肽能夠與細(xì)胞內(nèi)的許多生物活性蛋白結(jié)合，并影響相關(guān)的信號通路活性。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多因素參與的復(fù)雜過程，許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中發(fā)揮重要的作用。粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是蛋白酪氨酸激酶超家族中的一員，很多腫瘤中FAK的表達(dá)升高，目前的研究表明其表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，F(xiàn)AK能夠發(fā)生磷酸化并被激活，從而通過激活相關(guān)的信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[18，19]。因此，我們檢測了HEp2細(xì)胞中FAK磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)用CSD多肽處理HEp2細(xì)胞后，F(xiàn)AK相對磷酸化水平下降了48.89%。在一項(xiàng)黑色素瘤的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)caveolin-1能夠通過下調(diào)黑色素瘤B16F10 細(xì)胞株FAK的磷酸化水平， 抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[20]。FAK磷酸化水平的下降可能是CSD多肽抑制HEp2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制，但CSD多肽通過何種分子機(jī)制影響FAK的磷酸化水平還需要深入研究。

綜上所述，本研究體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CSD多肽能夠順利進(jìn)入HEp2細(xì)胞內(nèi)，并能夠抑制HEp2細(xì)胞的遷移和侵襲能力，F(xiàn)AK磷酸化水平的下調(diào)可能是其中重要的分子機(jī)制，CSD多肽的抑制腫瘤的功能及具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Sohn J，Brick RM，Tuan RS. From embryonic development to human diseases：The functional role of caveolae/caveolin[J]. Birth Defects Res C Embryo Today，2016，108（1）：45-64.

[2] 張自強(qiáng)，楊曉峰，劉杰昊. 肽類藥物在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J]. 國際腫瘤學(xué)雜志，2015，42（1）：52-55.

[3] Zhang K，Yang G，Wu W，et al. Decreased expression of caveolin-1 and e-cadherin correlates with the clinicopathologic features of gastric cancer and the EMT process[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov，2016，11（2）：236-244.

[4] Quann K，Gonzales DM，Mercier I，et al. Caveolin-1 is a negative regulator of tumor growth in glioblastoma and modulates chemosensitivity to temozolomide[J]. Cell Cycle，2013，12（10）：1510-1520.

[5] 黃杰，廖湘暉，彭麗嬌. 窖蛋白-1和埃茲蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（6）：1281-1282.

[6] 王冰，王欣，徐明麗. 窖蛋白-1和RhoE在肝癌癌變過程中表達(dá)及其臨床意義[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014， 31（8）：1805-1807.

[7] Lili Nimri，Hossei Barak，Lutz Graeve，et al. Restoration of caveolin-1 expression suppresses growth，membrane-type-4 metalloproteinase expression and metastasis-associated activities in colon cancer cells[J]. Mol Carcinog，2013， 52（11）：859-870.

[8] Gupta R，Toufaily C，Annabi B. Caveolin and cavin family members：Dual roles in cancer[J]. Biochimie，2014，107（Pt B）：188-202.

[9] Han F，Zhang J，Shao J，et al. Caveolin-1 promotes an invasive phenotype and predicts poor prognosis in large cell lung carcinoma[J]. Pathol Res Pract，2014，210（8）：514-520.

[10] Diaz-Valdivia N，Bravo D，Huerta H，et al. Enhanced caveolin-1 expression increases migration，anchorage-independent growth and invasion of endometrial adenocarcinoma cells[J]. BMC Cancer，2015，15（1）：1-11.

[11] 黃陳，張坤東，吳衛(wèi)東，等. caveolin-1與胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究[J]. 中華普通外科雜志，2014，29（7）：545-547.

[12] Ortiz R，Díaz J，Díaz N，et al. Extracellular matrix-specific caveolin-1 phosphorylation on tyrosine 14 is linked to augmented melanoma metastasis but not tumorigenesis[J].Oncotarget，2016，7（26）：40571-40593.

[13] Sugie S，Mukai S，Yamasaki K，et al. Significant association of caveolin-1 and caveolin-2 with prostate cancer progression[J]. Cancer Genomics Proteomics，2015，12（6）：391-396.

[14] 曾永威，盧桂堯，高婉儀，等. Caveolin-1、P63及CK34βE12在59例前列腺癌中的表達(dá)及意義[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2013 42（14）：1589-1592.

[15] Tahir SA，Park S，Thompson TC. Caveolin-1 regulates VEGF-stimulated angiogenic activities in prostate cancer and endothelial cells[J]. Cancer Biol Ther，2009，8（23）： 2286–2296.

[16] 顧棟樺，唐峰，王震，等. Caveolin-1對喉鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)特性的影響[J]. 中華腫瘤雜志，2007，29（5）：329-333.

[17] Jung AC，Ray AM，Ramolu L，et al. Caveolin-1-negative head and neck squamous cell carcinoma primary tumors display increased epithelial to mesenchymal transition and prometastatic properties[J]. Oncotarget，2015，6（39）：41884-41901.

[18] Lee BY，Timpson P，Horvath LG，et al. FAK signaling in human cancer as a target for therapeutics[J]. Pharmacol Ther，2015，146：132-149.

[19] Yoon H，Dehart JP，Murphy JM，et al.Understanding the roles of FAK in cancer： Inhibitors，genetic models，and new insights[J]. J Histochem Cytochem，2015，63（2）：114-128.

[20] Trimmer C，Whitaker-Menezes D，Bonuccelli G，et al. CAV1 inhibits metastatic potential in melanomas through suppression of the integrin/Src/FAK signaling pathway[J]. Cancer Res，2010，70（19）：7489-7499.

（收稿日期：2016-08-05）