劉偉，任艷利，讓鳳菊，何曉燕，歐陽艷

（伊犁師范學(xué)院新疆維吾爾自治區(qū)普通高校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點實驗室，新疆伊寧835000）

準(zhǔn)噶爾山楂葉抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性

劉偉，任艷利，讓鳳菊，何曉燕，歐陽艷*

（伊犁師范學(xué)院新疆維吾爾自治區(qū)普通高校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點實驗室，新疆伊寧835000）

采用超聲提取不同月份準(zhǔn)噶爾山楂葉，系統(tǒng)溶劑萃取其醇提物得到環(huán)己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，分別測定其總黃酮含量，通過清除DPPH自由基、鐵離子還原能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性評價準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物的體外抗氧化活性及降血糖活性。結(jié)果表明，準(zhǔn)噶爾山楂葉各提取物均有不同程度的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中以總黃酮含量最高的乙酸乙酯部位（28.87mg/g）效果最佳，其對DPPH清除活性（IC50=0.026mg/mL）遠(yuǎn)強(qiáng)于陽性對照BHA（IC50=0.996mg/mL），α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC50=191.71 g/mL）高于陽性對照阿卡波糖（IC50= 1 044.32 g/mL）。各提取物體外抗氧化和降血糖活性與其總黃酮含量呈正相關(guān)性，說明黃酮類化合物為影響其活性的主要因素。

準(zhǔn)噶爾山楂葉；總黃酮；抗氧化；抑制-葡萄糖苷酶活性

糖尿?。―iabetes mellitus）是一種以胰島素分泌絕對不足（I型）或相對不足（II型，胰島素抵抗）而引起的以高血糖為主，伴有眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)系統(tǒng)的慢性損害等并發(fā)癥為特征的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]。近30年來，我國糖尿病發(fā)病率劇增，由1980年的1.0%到2010年的11.6%，患病人數(shù)超過1.5億[2]。Yang等研究表明我國糖尿病早期表現(xiàn)出更嚴(yán)重的胰島β細(xì)胞功能障礙，治療的關(guān)鍵是維持胰島β細(xì)胞功能和控制餐后血糖濃度[3]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可以競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，從而減緩淀粉和蔗糖等向葡萄糖的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而控制餐后血糖的水平[4]。此外，氧化應(yīng)激與糖尿病及其并發(fā)癥存在密切相關(guān)，應(yīng)用抗氧化治療可逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對組織的損傷，從而阻止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[5]。因此，開發(fā)具有清除自由基和控制餐后血糖的功能保健食品對我國II型糖尿病的防治具有重要的意義。

山楂（Crataegus pinnatifida）為薔薇科山楂屬落葉喬木，其果與葉皆可入藥[6-7]，具有悠久的藥用和食用歷史。葉希韻等[8]研究表明，山楂葉黃酮對防治小鼠糖尿病及其并發(fā)癥有積極的作用。準(zhǔn)噶爾山楂（Crataegus songorica）生于河谷或峽谷灌木叢中，分布于俄羅斯、伊朗等地，在中國僅分布于新疆伊犁地區(qū)[9]。目前，對準(zhǔn)噶爾山楂葉提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究鮮有報道。本文采用體外模型對準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物進(jìn)行抗氧化和降血糖活性初篩，以期發(fā)現(xiàn)基于抑制α-葡萄糖苷酶活性的降血糖活性成分，初步探索提取物總黃酮含量與活性之間的相關(guān)性，為準(zhǔn)噶爾山楂資源的利用與開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

準(zhǔn)噶爾山楂葉分別于7、8、9、10月采于新疆伊犁霍城縣大西溝，經(jīng)伊犁師范學(xué)院資源與生態(tài)研究所趙玉副教授鑒定為薔薇科準(zhǔn)噶爾山楂葉，洗凈，晾干后60℃烘干至恒重，粉碎過60目篩備用，樹葉標(biāo)本存放于伊犁師范學(xué)院資源與生態(tài)研究所。

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、氯化鋁：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH：長城生物化學(xué)工程有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購自中國食品藥品檢定研究院（批號100080-201408）；α-葡萄糖苷酶（Yeast，EC 3.2.1.20）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖：購自阿拉丁試劑公司（上海）。

SpectraMax M2多功能讀板機(jī)：Molecular Devices，USA；UV-2550紫外可見分光光度計：日本島津分析儀器廠；XH-2008D智能溫控低溫超聲波催化合成儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；DD-5M型低速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)有限公司；FA2104電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；BAO-150AG型電熱恒溫干燥箱：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 準(zhǔn)噶爾山楂葉提取物制備

[10]的方法，精密稱取6.000 0 g備用準(zhǔn)噶爾山楂葉（采于7、8、9、10月），分別裝入可密閉的三頸燒瓶內(nèi)，按料液比1∶30（g/mL）加入60%乙醇溶液，在300W功率下，保持70℃超聲提取30min，提取2次，合并提取液，4 000 r/min離心10min，取上清液減壓濃縮干燥后得7月提取物（JulE）1.021 5 g、8月提取物（Aug E）0.947 2 g、9月提取物（Sep E）1.154 6 g、10月提取物（OctE）0.830 4 g。

根據(jù)測定結(jié)果，選取總黃酮含量最高的山楂葉進(jìn)行分級萃取。精密稱取6.000 0 g樣品按照上述方法超聲提取，合并離心后上清液減壓濃縮至無醇味，加水定容至合適體積，依次用等體積的環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，萃取余下的水溶液為水部分，回收溶劑后得環(huán)己烷部分（Cy E）0.073 6 g、乙酸乙酯部分（EA E）0.238 5 g、正丁醇部分（Bu E）0.322 1 g和水部分（W tE）0.232 7 g。

1.2.2 總黃酮含量測定

為避免含鄰二酚類化合物對總黃酮含量測定的干擾，參考文獻(xiàn)[11]的方法，采用AlCl3法分別測定準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物總黃酮含量。精密移取備用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別加入盛有5.0mL 60%乙醇溶液的25mL相同規(guī)格的容量瓶中，再加2.0mL 0.1mol/L氯化鋁溶液和1.0mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH=5.5），60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15min，于417 nm處測定吸光值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得y=27.462 x+0.000 6，R2=0.995 9，結(jié)果表明在濃度0.02mg/mL至0.06mg/mL范圍內(nèi)兩變量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。準(zhǔn)確吸取1.0mL配制的提取液，分別按照上述方法測定吸光度，并根據(jù)公式（1）計算總黃酮含量。

式中：Y為總黃酮含量，mg/g；k待測液與測試液體積之比；c為標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算所得濃度，mg/mL；V為測試液定容的體積，mL；m為稱取準(zhǔn)噶爾山楂葉質(zhì)量，g。

1.2.3 清除DPPH自由基試驗

參照文獻(xiàn)方法[12]并稍加修改：配制準(zhǔn)噶爾山楂葉提取物、萃取液、BHA待測液，逐級稀釋使用。將各供試樣品溶液分別移取20μL于10mL比色管中，另取0.6mmol/L的DPPH溶液1.0mL加入各比色管中，用無水乙醇定容至10mL，搖勻，在避光條件下靜置30 min后，于517 nm波長處測定吸光值，考慮山楂葉提取物自身吸光值的影響，配制未加DPPH溶液的對照組扣除其吸光值，每組樣品進(jìn)行3次平行試驗。DPPH·清除率按公式（2）計算：

式中：A0為DPPH溶液定容后的吸光度；A1為不同濃度的樣品溶液添加DPPH溶液定容后的吸光度；A2為不同濃度的樣品溶液定容后的吸光度。

1.2.4 還原能力測定

參照文獻(xiàn)方法[12]并稍加修改：分別量取系列濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL）的各提取物、萃取液、BHA 2.5mL于10mL比色皿中，分別加入2.5mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH=6.6）和2.5 mL鐵氰化鉀（1%）。將混合物放置到50℃的水浴中保溫20min后，加2.5mL三氯乙酸，3 000 r/min離心10min，取2.5mL上清液分別加入2.0mL蒸餾水和0.5 mL氯化鐵溶液（0.1%），以乙醇溶液做空白試驗，測定混合物在700 nm處的吸光度，每組樣品進(jìn)行3次平行試驗。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參照文獻(xiàn)[13]的方法稍作修改，96孔板中分別加入50μL不同濃度的溶于甲醇和0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.8，精確稱取8.66 g K2HPO4和6.85 g KH2PO4溶解于超純水中，并定容至1 L）的被測試樣品，50μL磷酸鹽緩沖液和40μL 0.25 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，37℃恒溫孵育10 min后加入40μL 5mmol/L pNPG溶液，立即于405 nm波長下測定其OD值（S0min），反應(yīng)5min后相同波長條件下測定其OD值（S5min），加入相同體積的甲醇磷酸鹽緩沖液作為空白對照，阿卡波糖為陽性對照。按照公式（3）計算抑制率：

式中：C0為加入緩沖液代替樣品的空白對照0 min時的OD值；C5空白對照5min時的OD值；S0為加入測試樣品0min時的OD值；S5為加入測試樣品5min時的OD值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并計算抑制率、清除率，根據(jù)抑制率和濃度采用FORECAST函數(shù)計算IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物總黃酮含量測定結(jié)果準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物總黃酮含量見圖1。

圖1 準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物總黃酮含量Fig.1 Total flavonoids of different extracts of Crataegus songorica leaves

藥理學(xué)研究表明，山楂葉對心腦血管和消化系統(tǒng)具有重要的藥用價值，其主要活性成分為黃酮類化合物。因此試驗對準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物中總黃酮含量進(jìn)行測定。由圖1可知，7月到10月期間采摘準(zhǔn)噶爾山楂葉所含總黃酮沒有顯著性差異，其中8月份采摘樣品總黃酮含量最高，為14.97mg/g。有文獻(xiàn)[14]報道光照能夠強(qiáng)烈的影響植物的初生代謝、植物細(xì)胞生長及次生代謝產(chǎn)物積累。推測原因新疆伊犁地區(qū)8月日照時間最長，紫外線輻射強(qiáng)度大，影響了準(zhǔn)噶爾山楂正常的生理活動，促使其局部組織或器官合成較多的黃酮類化合物，以利于自身的保護(hù)。對8月采集樣品進(jìn)行分級萃取，所得樣品中EAE總黃酮含量最高，為28.87mg/g，Bu E總黃酮含量次之，提示準(zhǔn)噶爾山楂葉萃取物中富含中等極性黃酮類化合物。Cy E和WtE總黃酮含量較少，各萃取相總黃酮含量存在顯著性差異。

2.2 準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物清除DPPH自由基活性

準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物清除DPPH自由基活性見圖2。

在多種快速評估抗氧化活性的方法中，清除DPPH自由基模型與其它方法相比更為廣泛使用。由圖2可知，在測試質(zhì)量濃度內(nèi)，各提取物活性呈現(xiàn)出濃度依賴性，且清除DPPH自由基活性差異顯著。其活性順序為EA E>Bu E>Aug E>Jul E>Oct E>Sep E>BHA> Cy E>WtE。其中EA E（IC50=0.026mg/mL）和Bu E（IC50=0.084mg/mL）對DPPH自由基清除活性較強(qiáng)，遠(yuǎn)高于陽性對照BHA（IC50=0.996mg/mL），而Cy E和WtE清除能力相對較弱。結(jié)合圖1可知，總黃酮含量較高的EA E和Bu E比其它提取物清除DPPH自由基的能力強(qiáng)，不同月份提取物的清除能力與其總黃酮含量存在一定的正相關(guān)性。

2.3 準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物還原能力

準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物還原能力見圖3。

大多數(shù)化合物的還原能力可以看作是其潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)。由圖3可知，在測定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，除Cy E和WtE外，其余各提取物還原能力均強(qiáng)于對照BHA。其中EA E和Bu E表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力，顯著高于其它提取物。不同月份提取物表現(xiàn)出與BHA相近的還原能力，且還原能力隨著濃度的增大而不斷增大，量效關(guān)系較為明顯。

2.4 準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性

準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性見表1。

圖2 準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物清除DPPH自由基活性Fig.2 DPPH scavenging activity of different extracts of Crataegus songorica leaves

圖3 準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物還原能力Fig.3 Reducing power of different extracts of Crataegus songorica leaves

表1 準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性Table1 α-glucosidase inhibitory activity of different extracts of Crataegus songorica leaves

由表1可知，在同一濃度下，準(zhǔn)噶爾山楂葉不同月份提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性順序為：Aug E> Sep E>Jul E>Oct E，其中Aug E（IC50=478.72μg/mL），活性高于陽性對照阿卡波糖（IC50=1 044.32μg/mL）。對8月份山楂葉分級萃取物進(jìn)行活性測定，其中Cy E和WtE活性較弱，未能計算其IC50值。EA E（IC50= 191.71μg/mL）和Bu E（IC50=305.22μg/mL）對α-葡萄糖苷酶抑制活性遠(yuǎn)高于陽性對照阿卡波糖，表明EA E和Bu E富集了抑制α-葡萄糖苷酶的有效成分。結(jié)合圖1可知，總黃酮含量較高的EA E、Bu E和Aug E表現(xiàn)出更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2.5 各提取物質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響見圖4。

圖4 準(zhǔn)噶爾山楂葉不同提取物質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.4 Effects of concentration of different extracts from Crataegus songorica leaves on α-glucosidase inhibitory activity

由圖4可知，當(dāng)供試質(zhì)量濃度小于1 000μg/mL時，各提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性與濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，即抑制率隨著質(zhì)量濃度升高而逐漸增大，其中活性較好為總黃酮含量較高的EA E、Bu E和 Aug E。在質(zhì)量濃度為1 000μg/mL時，三者對α-葡萄糖苷酶抑制率分別為70.52%、96.70%、85.57%，遠(yuǎn)高于阿卡波糖活性（47.85%），此后三者抑制率隨著濃度增大變化不顯著。其余各提取物在測試濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出與阿卡波糖相近的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

3 結(jié)論

大量的研究表明自由基與人類一百多種疾病的發(fā)生有關(guān)[15]。自由基具有很強(qiáng)的氧化能力，適量的自由基通過信息調(diào)控維持機(jī)體的氧化應(yīng)激和氧化還原的平衡。糖尿病發(fā)生后，人體在高血糖刺激下，產(chǎn)生過量的自由基增加氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和死亡[16]，促進(jìn)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。本文對準(zhǔn)噶爾山楂葉不同醇提物和萃取物的體外抗氧化活性和降血糖活性進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，總黃酮含量較高的EA E、Bu E和Aug E具有強(qiáng)氧化活性的同時也表現(xiàn)出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，而總黃酮含量較低的Cy E和WtE體外降血糖和抗氧化活性均較弱。說明準(zhǔn)噶爾山楂葉的主要降血糖成分為黃酮類化合物，這與有關(guān)報道一致[17]。其中乙酸乙酯萃取物具有較好的開發(fā)天然抗糖尿病藥物的潛力，其具體活性成分追蹤分離和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]American Diabetes Association.Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J].Diabetes Care,2014,37(S1):S81-S90

[2]Ma RCW,Lin X,JiaW.Causes of type 2 diabetes in China[J].The Lancet Diabetes&Endocrinology,2014,2(12):980-991

[3]Yang W,Weng J.Early therapy for type 2 diabetes in China[J]. The Lancet Diabetes&Endocrinology,2014,2(12):992-1002

[4]Kim K T,Rioux L E,Turgeon SL.Alpha-amylase and alpha-glu cosidase inhibition is differentially modulated by fucoidan obtained from Fucus vesiculosus and Ascophyllum nodosum[J].Phytochemistry,2014,98:27-33

[5]Khan R A,Khan M R,Sahreen S,et al.Assessment of flavonoids contents and in vitro antioxidant activity of Launaea procumbens[J]. Chemistry Central Journal,2012,6(1):1-11

[6]龐文悅,王蓮,張榮泉.山楂葉總黃酮生物活性研究近況進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2014,35(13):134-136

[7]劉家蘭,徐曉玉.山楂的藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2009,40 (S1):63-66

[8]葉希韻,張隆,沈菊,等.山楂葉總黃酮對糖尿病小鼠糖脂代謝的影響[J].中草藥,2005,36(11):1683-1686

[9]羊海軍,崔大方.中國天山野果林種子植物組成及資源狀況分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報,2003,12(2):39-45

[10]劉偉,何曉燕,陳文強(qiáng),等.響應(yīng)面優(yōu)化野生櫻桃李葉總黃酮的超聲輔助提取工藝[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015,27(10):1765-1770

[11]劉偉,高紅艷,李紫薇,等.野生櫻桃李葉總黃酮含量測定方法比較研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,38(1):192-197

[12]劉偉,李紫薇,陳文強(qiáng),等.新疆野生櫻桃李枝、葉不同萃取部位抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2016,37(3):119-122

[13]趙堂彥,孟茜,王琴,等.鷹嘴豆水提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究[J].食品研究與開發(fā),2016,37(5):4-7

[14]諸姮,胡宏友,盧昌義,等.植物體內(nèi)的黃酮類化合物代謝及其調(diào)控研究進(jìn)展[J].廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2007,46(S1):136-143

[15]Gutteridge JM C.Free-radicals in disease processes-a compilation of cause and consequence[J].Free radical research communications,1993,19(3):141-158

[16]McCord JM.The evolution of free radicals and oxidative stress[J]. The American Journal of Medicine,2000,108(8):652-659

[17]季芳,肖國春,董莉,等.藥用植物來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2010,35(12):1633-1640

Antioxidant and Alpha-glucosidase Inhibitory Activity of Crataegus songorica Leaves

LIU Wei，REN Yan-li，RANG Feng-ju，HE Xiao-yan，OUYANG Yan*
（University and College Key Lab of Natural Product Chemistry and Application in Xinjiang，Yili Normal University，Yining 835000，Xinjiang，China）

Crataegus songorica leaves collected in different months were extracted by ethanol then partitioned by system solvents with different polarity.The total flavonoids in the ethanol extract，cyclohexane fraction，ethyl acetate fraction，n-butanol fraction and water fraction were measured and the antioxidant activity and in vitro hypoglycemia activity were assayed by scavenging activity of DPPH radicals，reducing power and anti-α-glucosidase activity.The results showed that different extracts from Crataegus songorica leaves all exhibited different degree of antioxidant activity and anti-α-glucosidase activity，among which ethyl acetate fraction showed strong activity.The ethyl acetate fraction had 28.87mg/g of total flavonoids and its IC50of DPPH assay was 0.026mg/mL while the IC50of anti-α-glucosidase activity was 191.71 g/mL，it was far higher than that of the positive control BHA（IC50=0.996mg/mL）and acarbose（IC50=1 044.32 g/mL）.The antioxidant and antiα-glucosidase activities of the extracts were positively correlated to their total flavonoids，it showed that flavonoids were main factors for the activities.

Crataegus songorica leaves；total flavonoids；anti-oxidantion；anti-α-glucosidase activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.005

2016-05-14

伊犁師范學(xué)院重點科研計劃項目（2015YSZD02）

劉偉（1985—），男（漢），實驗師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分研究。

*通信作者：歐陽艷（1965—），女（漢），教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分研究。