王忠江，隋 超，王澤宇，王麗麗，張 琪，吳 婧，李 巖

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小球藻對不同沼液添加量培養(yǎng)液的適應性及凈化效果

王忠江1，隋 超1，王澤宇1，王麗麗1，張 琪2，吳 婧1，李 巖1

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學工程學院，哈爾濱 150030；2. 中國科學院水生生物研究所，武漢 430072）

以成分相對簡單、未經(jīng)滅菌的秸稈厭氧發(fā)酵后沼液和BG11培養(yǎng)基的混合液為培養(yǎng)液，以FACHB-5號和FACHB-8號小球藻為藻種，利用人工氣候培養(yǎng)箱，在微藻培養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照強度為4 000 lx，24 h連續(xù)光照，通氣量為1.5 L/min，沼液添加比例為20%、30%和40%的條件下，系統(tǒng)研究秸稈厭氧發(fā)酵后沼液直接用于微藻養(yǎng)殖對微藻系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明：試驗采用的小球藻FACHB-8號藻種和FACHB-5號藻種均能較好地適應化學需氧量COD含量相對較高的秸稈厭氧發(fā)酵后沼液，但FACHB-8號藻種與FACHB-5號藻種相比對沼液的適應時間更短，適應能力更強；FACHB-8號藻種和FACHB-5號藻種均能較好的利用和轉(zhuǎn)化沼液中的有機污染物，各試驗組的COD去除率均大于90%，總氮去除率均大于96%，總磷去除率均大于92%。該研究可為沼液直接用于微藻養(yǎng)殖提供參考。

秸稈；氮；磷；微藻；沼液；生長速率；化學需氧量

0 引 言

微藻生物質(zhì)與其他陸生生物質(zhì)資源相比，具有光合作用效率高、生長速度快、不占耕地、產(chǎn)品附加值高等優(yōu)點[1-3]，近年來得到各國學者的關(guān)注，成為爭相研究的熱點。但微藻養(yǎng)殖過程需要向培養(yǎng)液中添加大量的N、P等營養(yǎng)成分[4-5]，極大地增加了微藻養(yǎng)殖的成本，成為制約微藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。與此同時近年來大中型沼氣工程在中國得到了迅速推廣，而且這些沼氣工程基本都是采用濕式厭氧發(fā)酵工藝，沼氣工程在產(chǎn)生新能源沼氣的同時也產(chǎn)生了大量的沼液廢水[6-7]，而這些沼液富含濃度較高的有機物，N、P等營養(yǎng)成分，以及種類繁多的微生物等[8-9]，如果處置不當將對環(huán)境造成潛在威脅，因此如何拓寬沼液的利用途徑及利用量引起越來越多人的關(guān)注。如果將沼氣厭氧發(fā)酵后富含N、P等營養(yǎng)成分的沼液作為微藻養(yǎng)殖的營養(yǎng)液不但可以在一定程度上解決沼液的處置問題[10-11]，同時還可以降低微藻養(yǎng)殖過程中補充氮源和磷源的成本[12-13]。但微藻在養(yǎng)殖過程中容易受到雜菌污染[14-15]，而沼氣發(fā)酵的原料種類眾多，不同發(fā)酵原料沼氣發(fā)酵后的沼液成分差別較大，如豬等畜禽的食物及消化道內(nèi)存在的大量病原微生物在畜禽糞便中大量殘留，此外由于目前規(guī)模化養(yǎng)殖場中各種化學添加劑的濫用，也使相對較多的重金屬殘留在畜禽糞便中，以這些畜禽廢棄物為原料進行沼氣發(fā)酵產(chǎn)生的沼液中存在大量的病原微生物等雜菌及重金屬，成分復雜，容易對微藻產(chǎn)生污染[16-17]，所以在前期研究中很多學者[18-19]均是將沼液滅菌后再進行微藻的養(yǎng)殖試驗，進而增加了微藻養(yǎng)殖成本，影響微藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的后續(xù)應用和推廣。因此本試驗針對以上問題，以成分相對簡單的秸稈厭氧發(fā)酵后的沼液為原料，在不滅菌的條件下，通過改變秸稈沼液不同添加比例來系統(tǒng)研究不滅菌秸稈沼液對微藻養(yǎng)殖的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沼液及預處理

試驗采用的沼液取自東北農(nóng)業(yè)大學生物質(zhì)能源實驗室，沼氣發(fā)酵的原料為稻稈，發(fā)酵時間為30 d，沼液的初始化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）為21 015.28 mg/L、揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）為937 mg/L、pH值為9.2、總氮質(zhì)量濃度為803.53 mg/L、總磷質(zhì)量濃度為62.74 mg/L、氨氮質(zhì)量濃度為689.90、濁度為2374 NTU。沼氣發(fā)酵后的剩余物經(jīng)孔徑0.075 mm尼龍標準篩去除大顆粒物，再經(jīng)10 000 r/min去除小顆粒物獲得本試驗所用沼液，之后儲存于4 ℃冰箱內(nèi)備用，沼液的氨氮質(zhì)量濃度為621.71 mg/L、總氮質(zhì)量濃度為741.72 mg/L、總磷質(zhì)量濃度為59.77 mg/L、化學需氧量（COD）為18 626.92 mg/L。

1.1.2 藻種

試驗所用的藻種為蛋白核小球藻（）與普通小球藻（），均由中國科學院水生生物研究所提供，藻種編號為FACHB-5（5號藻種）和FACHB-8（8號藻種）。

1.2 試驗方法及條件

藻種采用沼液和BG11培養(yǎng)基的混合液進行培養(yǎng)，BG11培養(yǎng)基的配方見文獻[20]，沼液的添加比例分別為20%、30%和40%，試驗采用的藥品均為分析純。利用人工氣候培養(yǎng)箱（OBY-Q600-SEI，常州歐邦電子有限公司）進行微藻培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照強度為4 000 lx，24 h連續(xù)光照，同時利用旋渦式氣泵（HG-180，臺灣亞士霸電機集團有限公司）向微藻培養(yǎng)液通入空氣，通氣量為1.5 L/min，空氣在進入培養(yǎng)液前經(jīng)0.2m濾膜過濾。

試驗容器為1 000 mL三角瓶，內(nèi)裝600 mL培養(yǎng)液，在未調(diào)節(jié)pH值條件下將對數(shù)期藻種各100 mL分別加入各組培養(yǎng)液中，每組2個重復，進行批式培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為12 d，每天取樣測OD680、pH值，每隔1 d取樣，在10 000 r/min條件下離心，測定上清液中氨氮、總氮、總磷和COD。

1.3 成分指標測定

生物量測定采用光密度法[21]。光密度法：取小球藻藻液，用紫外可見分光光度計（型號T6新世紀北京普析通用儀器有限責任公司）測定其在680 nm吸收波長下的光密度OD680，以此衡量小球藻在培養(yǎng)過程中的相對生長量。原料沼液的濁度采用分光光度法測定680 nm下的吸光值[22-23]，培養(yǎng)液的COD測定采用重鉻酸鹽法，參照GB11914-1989《水質(zhì)化學需氧量的測定重鉻酸鹽法》[24]；總氮和氨氮采用凱式定氮法（Kjeldahl method）測定[25]，所用儀器為全自動凱式定氮儀（KjeltecTM2300 FOSS丹麥），總磷測定采用鉬酸銨分光光度法，參照GB11893- 1989《水質(zhì)總磷的測定鉬酸銨分光光度法》[26]。采用Excel2003進行數(shù)據(jù)處理；采用Design-Expert 8.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微藻生長狀況

圖1為2種藻種在不同沼液添加比例下的生長曲線，從上圖可以看出，當沼液添加比例在20%～40%范圍內(nèi)5號藻種和8號藻種均未出現(xiàn)明顯的抑制作用，而且6個試驗組的整體變化趨勢一致，即試驗前期（前2天）小幅上升，第2天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間均無顯著性差異。之后（2～ 7 d）開始快速上升，第6天，5號藻種與8號藻種在沼液添加量為20%時無顯著性差異；沼液添加量為30%時的差異達到顯著水平（<0.05）；添加量為40%時的差異達到極顯著性水平（<0.01），后期逐漸趨于穩(wěn)定，第11天，5號藻種與8號藻種在沼液添加量為20%與30%時無顯著性差異；沼液添加量為40%時的差異達到顯著水平（<0.05），試驗結(jié)束時各試驗組培養(yǎng)液的OD680值已經(jīng)由試驗開始時的0.1～0.2上升到1.4～2.0，這說明添加沼液未對5號藻種和8號藻種產(chǎn)生明顯的抑制。從圖中還可以看出，前6天8號藻種的OD680值均高于5號藻種，說明8號藻種對沼液的適應期較短，可以在較短的時間內(nèi)迅速適應添加沼液的生長環(huán)境。此外從圖1中還可以看出，添加沼液比例較小時，進入穩(wěn)定期后，5號藻種和8號藻種的OD680值差別較小，而當沼液添加比例較大時，8號藻種的OD680值始終高于5號藻種，這說明在本試驗條件下8號藻種與5號藻種相比對高濃度沼液的適應能力更強。

圖1 微藻的生長曲線

2.2 pH值

圖2為兩種藻種在不同沼液添加比例溶液pH值的變化情況，從圖2可以看出，6個試驗組的pH值變化規(guī)律基本一致，即試驗前期（前3天）小幅下降，第2天，5號藻種與8號藻種在沼液添加量為20%時的差異達到顯著性水平（<0.05）；添加量為30%時無顯著性差異；添加量為40%時的差異達到顯著性水平（<0.05），之后（3～6 d）開始快速下降，第6天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間均無顯著性差異。第6天時培養(yǎng)液的pH值已經(jīng)由試驗開始時的9.0～9.2下降到8.3～8.5。后期又開始逐漸上升，第11天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間均無顯著性差異。試驗結(jié)束時各組培養(yǎng)液的pH值已經(jīng)回升到8.6～8.8。這與各試驗組的OD680值變化規(guī)律相對應，這是因為藻類在培養(yǎng)液中存在多種形態(tài)氮時，優(yōu)先利用氨態(tài)氮[27]，而藻細胞利用氨分子，使得培養(yǎng)液中H+濃度增加，pH值在微藻培養(yǎng)的前期出現(xiàn)下降，之后隨著氨態(tài)氮含量降低，微藻開始利用培養(yǎng)液中的硝態(tài)氮，同時沼液中有機酸徹底降解，培養(yǎng)液的pH值開始逐漸上升[20]。

2.3 總氮

圖3為2種藻種在不同沼液添加比例環(huán)境下溶液中總氮的變化情況，從圖3可以看出，6個試驗組的總氮變化規(guī)律基本一致，即試驗前期（前2天）小幅下降，第2天5號藻種與8號藻種在沼液添加量為20%與40%時均無顯著性差異；沼液添加量為30%時的差異達到極顯著性水平（<0.01），之后（2～10 d）開始快速下降，第6天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間差異均達到極顯著水平（<0.01）。后期逐漸趨于穩(wěn)定，第11天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間均無顯著性差異。試驗結(jié)束時沼液添加量20%組、30%組和40%組的培養(yǎng)液中總氮含量由試驗開始時的180、215和297 mg/L下降到6、8和12 mg/L，降幅分別達到97%、96%和96%，這說明利用沼液養(yǎng)殖微藻可以取得非常好的去除沼液中氮素的效果，充分實現(xiàn)沼液的資源化和無害化。從圖3中還可以看出當沼液添加比例為較低的20%時，5號藻種和8號藻種2組在整個試驗過程中總氮的差別非常小，而當培養(yǎng)液中沼液添加比例增加到30%和40%時，8號藻種培養(yǎng)液中總氮的含量在試驗過程的大部分時間內(nèi)均低于對應的5號藻種，而且在試驗前期8號藻種的培養(yǎng)液中的總氮含量下降速度明顯快于5號藻種，這與圖1中的OD680值的變化規(guī)律相對應。

圖2 pH值的變化

圖3 總氮的變化

2.4 氨氮

圖4為2種藻種在不同沼液添加比例環(huán)境下溶液中氨氮的變化情況，從圖4可以看出，6個試驗組的氨氮變化規(guī)律基本一致，即試驗前期（前10天）始終處于下降趨勢，之后開始逐漸趨于穩(wěn)定，整體變化規(guī)律與總氮基本一致，試驗結(jié)束時各試驗組培養(yǎng)液的氨氮含量由開始時的148～249 mg/L下降到0～7 mg/L，期間第2天，5號藻種與8號藻種在沼液添加量為20%與30%時均無顯著性差異；沼液添加量為40%時的差異達到顯著性水平（<0.05），第6天，5號藻種與8號藻種在沼液添加量為30%時無顯著性差異；沼液添加量為20%和40%時的差異均達到顯著性水平（<0.05），第11天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間的差異均達到極顯著水平（<0.01）。這主要是因為沼液中氮的主要存在形式為氨態(tài)氮，且微藻優(yōu)先利用的也是氨態(tài)氮。

2.5 總磷

圖5為2種藻種在不同沼液添加比例環(huán)境下溶液中總磷的變化情況，從圖5可以看出，6個試驗組的總磷變化規(guī)律基本一致，即試驗前期（前4天）小幅下降，第2天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間均無顯著性差異。之后（4～10 d）開始快速下降，第6天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間均無顯著性差異。后期開始逐漸趨于穩(wěn)定，第11天5號藻種與8號藻種在沼液添加量為20%時無顯著性差異；沼液添加量為30%和40%時的差異均達到顯著性水平（<0.05），試驗結(jié)束時沼液添加量20%組、30%組和40%組的培養(yǎng)液中總磷含量由試驗開始時的14、19和24 mg/L下降到2 mg/L以下，降幅均達到92%以上，這說明利用沼液養(yǎng)殖微藻也可以較好的去除沼液中的磷素。從圖5中還可以看出當沼液添加比例為較低的20%和30%時，5號藻種和8號藻種兩組在整個試驗過程中總磷的差別很小，而當培養(yǎng)液中沼液添加比例增加到40%時，8號藻種培養(yǎng)液中總磷的含量從試驗第4天開始中后期均低于對應的5號藻種，并一直維持到試驗結(jié)束，這說明8號藻種更適合高濃度的沼液環(huán)境，對總磷的消耗速度更快。

圖4 氨氮的變化

2.6 COD

本試驗使用的沼液為稻桿厭氧發(fā)酵后沼液，稻桿沼氣發(fā)酵時的TS濃度為10%（這個濃度在濕法發(fā)酵中是比較高的），沼氣發(fā)酵時間為30 d（發(fā)酵時間主要是參照目前以秸稈為原料的大型沼氣工程常采用的物料發(fā)酵時間），停止沼氣發(fā)酵時發(fā)酵系統(tǒng)仍有沼氣產(chǎn)生，說明仍有有機物未被降解和利用，但考慮到微藻產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖以后采用的沼液必須適應大型沼氣工程排出沼液的相關(guān)特性，同時也是要探討COD值較高的沼液對微藻養(yǎng)殖的影響情況，所以在沼氣發(fā)酵30 d后即停止了沼氣發(fā)酵過程，并收集發(fā)酵后沼液作為后續(xù)微藻養(yǎng)殖的氮磷營養(yǎng)源。

圖6為2種藻種在不同沼液添加比例溶液COD的變化情況，從圖6可以看出，6個試驗組的COD變化規(guī)律基本一致，即試驗前期（前4天）小幅下降，第2天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間均無顯著性差異。之后（4～8 d）開始快速下降，第6天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間均無顯著性差異。后期逐漸趨于穩(wěn)定，第11天5號藻種與8號藻種（在沼液添加量為20%、30%和40%時）之間均無顯著性差異。試驗結(jié)束時沼液添加量20%組、30%組和40%組的培養(yǎng)液中COD含量由試驗開始時的4 500、6 993和9 336 mg/L下降到160、400和540 mg/L，降幅分別達到96%、94%和94%。COD含量的下降一方面是由于微藻代謝過程可以較好地利用和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中的氮磷等有機污染物[28]，使培養(yǎng)液的COD含量下降；另一方面是由于微藻養(yǎng)殖過程中通入的空氣中含有氧氣，這些氧氣提高了沼液中帶入的好氧和兼氧微生物以及空氣中的好氧微生物的活性，加速了培養(yǎng)液中有機物的降解，也導致了COD含量的下降。所以上述2個過程的共同作用才使培養(yǎng)液中COD含量出現(xiàn)了大幅下降。

圖6 COD的變化

3 結(jié) 論

1）本試驗采用的FACHB-8藻種和FACHB-5藻種均能較好地適應成分相對簡單，化學需氧量COD含量相對較高的未經(jīng)滅菌的秸稈厭氧發(fā)酵后沼液，但FACHB-8藻種與FACHB- 5藻種相比對沼液的適應時間更短，適應能力更強。

2）FACHB-8藻種和FACHB-5藻種均能較好的利用和轉(zhuǎn)化沼液中的有機污染物，在培養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照強度為4 000 lx，24 h連續(xù)光照，通氣量為1.5 L/min的試驗條件下培養(yǎng)12 d后，各試驗組溶液中的COD去除率均大于90%，總氮去除率均大于96%，總磷去除率均大于92%。

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Adaptation ofto culture liquid with different biogas slurryadding proportion and its purified effect

Wang Zhongjiang1, Sui Chao1, Wang Zeyu1, Wang Lili1, Zhang qi2, Wu Jing1, Li Yan1

(1.150030,;2.430072,)

This study mainly focused on the following problems like the higher cost of adding nitrogen and phosphorus in chlorella culture; the delayed and ineffective use of biogas slurry containing rich nutrient elements just as nitrogen, phosphorus, and so on after anaerobic fermentation; the easily contaminated microalgae caused by undesired microbes in microalgae culture; the higher cost of microalgae culture due to the biogas slurry pretreatments like sterilization and so forth when biogas slurry was serving as the culture medium; etc. The culture medium was the mixture of BG11 medium and biogas slurry from straw by anaerobic fermentation for 30 days. The biogas slurry fermented from straw was non-sterilized and relatively simple in composition. The algae species FACHB-5 and FACHB-8 chlorella were used. An artificial climate incubator was also used, in which the temperature for microalgae culture was kept at (26±1)℃, the light intensity was 4 000 lx, the light time was 24 hours continuously, and the ventilation volume was 1.5 L/min. In the experiment, the total nitrogen at the beginning was 180, 215 and 297 mg/L respectively in the experimental medium groups. The addition content of biogas slurry was 20%, 30% and 40% separately; and the results showed that the total nitrogen content of culture liquid was reduced to 6, 8 and 12 mg/L with the different biogas slurry treatments (20%, 30% and 40%), respectively, and the removal rate of total nitrogen was more than 96%. The total phosphorus content at the beginning was 14, 19 and 24 mg/L respectively in the experimental medium groups with the addition of biogas slurry was 20%, 30% and 40%, separately; At the end of the experiment, they reduced to less than 2 mg/L, and the removal rate of total phosphorus was more than 92%. Chemical oxygen demand (COD) content at the beginning was 4 500, 6 993 and 9 366 mg/L respectively, in the experimental medium groups with the addition of biogas slurry was 20%, 30% and 40%, and at the end of the experiment they reduced to 160, 400 and 540 mg/L respectively, the removal rate of COD was more than 90%. The experimental results showed that both FACHB-5 and FACHB-8 algae species could well adapt to biogas slurry which was relatively high in COD content from straw by anaerobic fermentation, and could well make the use of and remove the organic pollutants from biogas slurry. Compared with FACHB-5 algae species, FACHB-8 algae species needed shorter time to adapt, and had stronger adaptability to biogas slurry. What’s more, there was a strong correlation between the degradation of organic pollutants and the growth of chlorella in every experimental medium group. The study may lay a theoretical foundation for the application of biogas slurry which will be directly used in microalgae culture, and may have the magnificent significance for large-scale microalgae culture.

straw; nitrogen; phosphorus; microalgae; biogas slurry; growth rate; chemical oxygen demand

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.03.030

Q938

A

1002-6819(2017)-03-0221-06

2016-03-09

2016-12-28

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2014AA022001）；國家自然科學基金（51406032）；教育部留學回國人員科研啟動基金（20131792）；黑龍江省博士后科研啟動基金資助項目（LBH-Q10148）聯(lián)合資助

王忠江，男（漢族），黑龍江哈爾濱人，教授，博士，2011年赴美國俄亥俄州立大學研修，主要從事農(nóng)業(yè)生物環(huán)境與能源工程領(lǐng)域研究。 哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學工程學院，150030，E-mail：neauwzj@126.com

王忠江，隋 超，王澤宇，王麗麗，張 琪，吳 婧，李 巖. 小球藻對不同沼液添加量培養(yǎng)液的適應性及凈化效果[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2017，33(3)：221－226. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.03.030 http://www.tcsae.org

Wang Zhongjiang, Sui Chao, Wang Zeyu, Wang Lili, Zhang qi, Wu Jing, Li Yan.Adaptation ofto culture liquid with different biogas slurryadding proportion and its purified effect[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(3): 221－226. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.03.030 http://www.tcsae.org