陳 嫚，許官學(xué)

·綜 述·

干細(xì)胞源性外泌體在心血管疾病中的研究進(jìn)展

陳 嫚，許官學(xué)

外泌體；干細(xì)胞移植；心血管疾??；綜述

近年來，干細(xì)胞源性外泌體作為非細(xì)胞體系對心肌細(xì)胞的修復(fù)作用逐漸被大家認(rèn)知。由于經(jīng)皮冠狀動脈介入治療及外科旁路移植手術(shù)的發(fā)展，急性心肌梗死(acute myocardial infarction， AMI)患者的存活率顯著提高。然而，功能性心肌細(xì)胞丟失所致的心室重塑使幸存的AMI患者最終發(fā)展為心力衰竭(心衰)，遠(yuǎn)期預(yù)后不容樂觀。剩余心臟組織有限的增殖及分化能力使得心臟結(jié)構(gòu)再生面臨極大挑戰(zhàn)，心臟移植仍然是難治性心衰的最佳治療手段。研究者為改善AMI及缺血性心衰患者的預(yù)后做了諸多嘗試，其中干細(xì)胞移植被認(rèn)為是治療心血管疾病最具前景的方法。目前已有大量基于動物模型的研究證實了多種干細(xì)胞移植的有效性，其中包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞(cardiac progenitor cells, CPC)、胚胎干細(xì)胞等[1-6]。新近研究發(fā)現(xiàn)，相比直接增殖分化為心臟譜系細(xì)胞，AMI后移植的干細(xì)胞通過旁分泌效應(yīng)對梗死后心臟的保護(hù)作用更加明顯[7]。干細(xì)胞源性外泌體作為非細(xì)胞治療策略在心血管領(lǐng)域掀起了研究熱潮[8]，其對心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及對心臟的保護(hù)作用逐漸被人們認(rèn)知，本文復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)綜述如下。

1 外泌體的生物學(xué)特征

1.1 概念與起源 外泌體是在研究正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞脫落小體時首次提出，數(shù)年后Johnstone等[9]在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中首次分離提純。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)除了腫瘤細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞等細(xì)胞外，心臟譜系細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、CPC、胚胎干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等均可釋放外泌體。目前多認(rèn)為外泌體來源于細(xì)胞膜向內(nèi)出芽所形成的細(xì)胞核內(nèi)體，細(xì)胞核內(nèi)體進(jìn)一步包裹胞漿內(nèi)mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)諸如此類的遺傳物質(zhì)，形成包含腔內(nèi)小體的細(xì)胞核內(nèi)體(多泡體)，多泡體與細(xì)胞膜融合并通過胞吐方式釋放至細(xì)胞外環(huán)境，最終形成外泌體[10]。

干細(xì)胞源性外泌體具有與其母體干細(xì)胞相似的生物功能，包含有大量與其功能相關(guān)的遺傳物質(zhì)[11-12]。其中，miRNA是近年來受到廣泛關(guān)注的一種內(nèi)源性高度保守的小分子非編碼單鏈RNA，可在mRNA水平及蛋白翻譯過程中調(diào)節(jié)多種疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[13]。研究顯示，外泌體內(nèi)miRNA的含量明顯高于在母體干細(xì)胞中的含量，且據(jù)母體干細(xì)胞特性，外泌體內(nèi)會出現(xiàn)某種特定miRNA聚集現(xiàn)象[14]。外泌體作用于受體細(xì)胞后，可經(jīng)向受體細(xì)胞或組織傳遞特異性遺傳物質(zhì)，進(jìn)而改變受體細(xì)胞或組織的生物學(xué)特征[15]。

1.2 生物學(xué)特征 外泌體是直徑介于30～100 nm的膜狀小體，并且外泌體質(zhì)膜及其內(nèi)部富含大量與其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，目前研究較為明確的有：①轉(zhuǎn)膜蛋白和融合蛋白(Rab GTPases、flotillin、膜聯(lián)蛋白)；②細(xì)胞內(nèi)源性蛋白(Alix、TSG101)；③整合素和4次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)，熱休克蛋白(HSP70、HSP90)；④脂質(zhì)相關(guān)蛋白和磷脂酶；⑤與外泌體母細(xì)胞性質(zhì)密切相關(guān)的特異性蛋白[16]。

2 外泌體與干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)

干細(xì)胞移植被認(rèn)為是治療心血管疾病最具前景的方法，既往研究認(rèn)為干細(xì)胞主要通過直接分化為心肌細(xì)胞而發(fā)揮效應(yīng)。然而van Berlo等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)心臟固有干細(xì)胞直接分化成新心肌細(xì)胞的比例為0.003%或更低，并對CPC的直接分化效應(yīng)產(chǎn)生了質(zhì)疑。此外，有實驗結(jié)果顯示，向大鼠梗死心肌內(nèi)注射CPC培養(yǎng)液亦可減少心肌瘢痕組織，主要作用機制為外源性CPC通過旁分泌HGF、IGF-1、VEGF、β-FGF、SDF-1等細(xì)胞因子，以募集固有CPC并促進(jìn)其遷移、生存、增殖、分化，發(fā)揮促進(jìn)血管新生和抗凋亡的作用，從而改善心臟功能[18]。Lai等[19]通過分子體積、電鏡觀察、超速離心、質(zhì)譜分析以及生化研究等方法，從干細(xì)胞培養(yǎng)液中提取出外泌體，并證實干細(xì)胞源性外泌體能夠有效減少小鼠AMI后的心肌梗死面積。新近研究發(fā)現(xiàn)，特異性去除CPC培養(yǎng)液中的外泌體可明顯減弱其對心臟的保護(hù)效應(yīng)[20]。同樣的，去除外泌體可減少缺血預(yù)處理所調(diào)控缺血再灌注區(qū)的冠狀動脈灌流量[21]。這些研究均表明外泌體是干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)及缺血預(yù)處理心臟細(xì)胞的活性組分。目前，外泌體作為干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的典型代表，在調(diào)控細(xì)胞信號傳遞、調(diào)節(jié)疾病生物學(xué)行為中的作用受到廣泛關(guān)注。

3 干細(xì)胞源性外泌體在心血管疾病中的研究

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體(mesenchymal stem cells derived exosomes， MSC-exosomes) 大量臨床前研究已證實MSC-exosomes在治療心血管疾病中的效果。Arslan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，人胚胎干細(xì)胞源性間充質(zhì)干細(xì)胞(human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells, ESC-MSCs)內(nèi)包含有與外泌體高度吻合的直徑為50～100 nm的微小顆粒；向缺血再灌注小鼠模型輸入外泌體可明顯減少AMI面積；進(jìn)一步將ESC-MSCs中提取的外泌體注入AMI小鼠模型中發(fā)現(xiàn)其心功能明顯改善。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AMI后心臟組織中ATP及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平顯著升高，然而用外泌體處理后其活性氧水平降低；并進(jìn)一步證明經(jīng)外泌體處理后心臟組織中磷水解磷酸化AKT及糖原合成酶激酶-3顯著升高，而c-jun氨基末端激酶顯著降低[19]。Bian等[23]證明MSC-exosomes可明顯減少AMI兔模型心肌梗死面積，促進(jìn)梗死周圍新生血管形成，改善心臟功能。Yu等[24]首先發(fā)現(xiàn)在MSCs中過表達(dá)鋅指轉(zhuǎn)錄因子-4(GATA1 binding factor-4， GATA-4)，然后再把提取的外泌體作用于AMI兔模型，發(fā)現(xiàn)MSC GATA-4-exosomes可明顯減少心肌梗死面積；并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MSC GATA-4-exosomes內(nèi)富含大量miRs，特別是miR-19a，其含量比在MSC-exosomes中多；并證明miR-19a可下調(diào)磷酸酶及PTEN進(jìn)而激活抗凋亡的AKT及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶。Feng等[25]發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理小鼠MSC-exosomes內(nèi)含有大量miR-22，當(dāng)AMI時富含miR-22的外泌體可經(jīng)下調(diào)甲基化CpG結(jié)合蛋白-2發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡作用。

3.2 心臟干細(xì)胞源性外泌體(cardiac progenitor cells derived exosomes， CPC-exosomes) Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠CPC-exosomes可顯著抑制缺血再灌注損傷小鼠模型心肌細(xì)胞的凋亡。此外Barile等[27]證明，人CPC-exosomes可明顯抑制大鼠AMI后心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)梗死心肌周圍新生血管形成，改善AMI后心臟功能；進(jìn)一步研究證明，CPC-exosomes內(nèi)富含miR-210、miR-132及miR-146a-3p，其強大的抗心肌細(xì)胞凋亡和促血管生成效應(yīng)，與高表達(dá)的miRNA激活下游靶蛋白ephrin A3、PTP1b及RasGaP-p120密切相關(guān)。Ibrahim等[28]在AMI小鼠模型的研究中也發(fā)現(xiàn)，CPC-exosomes可抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)新生血管形成，改善心臟功能；并證明CPC-exosomes含有豐富的miR-146a，其主要通過miR-146a發(fā)揮心臟保護(hù)效應(yīng)。此外，研究證明CPC-exosomes可改變成纖維細(xì)胞分泌活性，可使成纖維細(xì)胞分泌更多的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及血管內(nèi)皮生長因子，明顯改變成纖維細(xì)胞內(nèi)miR的組分；向AMI大鼠模型心臟中移植CPC-exosomes預(yù)處理的成纖維細(xì)胞，可明顯改善其心臟泵血功能、增加血管生成密度及減少瘢痕組織面積[29]。新近研究發(fā)現(xiàn)缺氧可促進(jìn)小鼠CPC-exosomes的釋放并改變其內(nèi)遺傳物質(zhì)的構(gòu)成，缺氧的CPC-exosomes作用于缺血的心臟組織后可顯著降低組織生長因子、波形蛋白、I型及Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺氧的CPC-exosomes miR-17、miR-199a、miR-210及miR-292表達(dá)增高，并且這些miR可作用于涉及纖維化通路的靶基因發(fā)揮心功能保護(hù)作用[30]。Ong等[31]經(jīng)基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HIF-1的CPC所分泌的外泌體含有大量具有心臟保護(hù)作用的miR-126及miR-210，且通過向受體Sca1+CPC傳遞miR-126及miR-210，使Sca1+CPC內(nèi)促存活激酶激活，進(jìn)一步降低代謝能量需求，提高Sca1+CPC對缺氧的耐受能力，改善AMI后Sca1+CPC移植的效果。

3.3 胚胎干細(xì)胞源性外泌體(embryonic stem cells derived exosomes， ESC-exosomes)及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞源性外泌體(induced pluripotent stem cells derived exosomes， iPS-exosomes) Arslan等[22]在ESC-exosomes的研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體具有促進(jìn)心臟增生反應(yīng)的特異能力。ESC-exosomes富含脂質(zhì)相關(guān)蛋白flotillin-1、多能性mRNA 轉(zhuǎn)錄本及miRNA-290；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可通過向受體細(xì)胞傳遞外泌體內(nèi)容物促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活及提高血管生成能力；AMI后心肌內(nèi)注入ESC-exosomes可通過促進(jìn)血管生成進(jìn)一步增強心臟細(xì)胞增生能力，顯著改善心臟功能；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)向AMI小鼠模型注入ESC-exosomes后可促進(jìn)新生血管形成，提高心肌細(xì)胞存活率，減少心肌梗死面積；進(jìn)一步證實ESC-exosomes可促進(jìn)CPC存活及增殖，并發(fā)現(xiàn)ESC-exosomes含有大量miR-294、miR-294，可使CPC細(xì)胞周期向S期發(fā)展，說明ESC-exosomes主要通過向靶細(xì)胞傳遞miR-294等特異性miRs進(jìn)一步發(fā)揮促細(xì)胞增殖及存活效應(yīng)。

Wang等[32]證明，iPS-exosomes在缺血損傷狀態(tài)下可通過傳遞miR-21及miR-210促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，體外研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，iPS-exosomes可通過抑制caspase 3/7的激活從而抑制過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下H9C2心肌細(xì)胞凋亡；此外，iPS-exosomes處理缺血再灌注損傷的大鼠心臟組織24 h后發(fā)現(xiàn)，TUNEL+/肌鈣蛋白I+的心肌細(xì)胞數(shù)量顯著下降。提示iPS-exosomes對缺血再灌注損傷狀態(tài)下心肌細(xì)胞具有保護(hù)效應(yīng)。

4 展望

外泌體作為干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的重要組成，可向靶細(xì)胞傳遞特異性miRNAs、mRNAs及蛋白，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖及血管生成效應(yīng)。本文眾多文獻(xiàn)均證實了外泌體在心肌梗死后可對抗心肌缺血所致的心肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖受限，并經(jīng)促新生血管形成、抑制心臟纖維化等途徑改善心臟泵血功能。外泌體的這些特性使其有望成為AMI后心肌再生修復(fù)治療的新策略。盡管目前外泌體用于治療心血管疾病的臨床試驗還未進(jìn)行，但其用于腫瘤患者的免疫療法已經(jīng)開始I期臨床試驗，業(yè)已證明有良好的應(yīng)用安全性[33-34]。相信不久的將來，干細(xì)胞源性外泌體治療心血管疾病的有效性及安全性將得到證實,為心血管疾病患者帶來福音。

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563003 貴州 遵義，遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

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R617

A

1002-3429(2017)07-0107-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.07.033

2016-12-28 修回時間：2017-05-12)