王 菲， 山顯彤， 張家境， 王戰(zhàn)勇

(遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001)

響應(yīng)面法優(yōu)化白花菜中黃酮類化合物的提取研究

王 菲， 山顯彤， 張家境， 王戰(zhàn)勇

(遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001)

采用超聲波輔助溶劑浸提法提取白花菜中的黃酮化合物，通過響應(yīng)面法優(yōu)化最佳提取條件?？疾靻我蛩?乙醇體積分數(shù)、液固比、超聲功率、超聲時間、水浴溫度、水浴時間和提取次數(shù))對白花菜黃酮得率的影響，在此基礎(chǔ)上，進行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗，分析并確定了最佳提取條件：乙醇體積分數(shù)65%、液固比(mL/g)32∶1、超聲功率30 W、超聲時間5 min、水浴溫度50 ℃、水浴時間40 min、提取次數(shù)1次。在最佳提取條件下，白花菜黃酮的實際得率為1.974 5 mg/g，與預(yù)期值十分接近。

白花菜； 黃酮類化合物； 提??； 響應(yīng)面法

花菜俗稱菜花，有白、綠兩種，白色的叫白花菜，是由甘藍演化而來，在《時代》雜志推薦的十大健康食品中位列第四名[1]。花菜是含有類黃酮較多的食物之一?；ú诵云轿陡?，對視力衰弱、肥胖、水腫以及預(yù)防動脈硬化都有療效，還具有開音止咳、清熱、利尿之功效。而生物類黃酮具有廣泛的生物活性作用，比如抗氧化、抗衰老、抗菌、抗輻射、抗腫瘤、抗白血病、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等[2-4]?，F(xiàn)今有些黃酮類成分已正式投入藥物生產(chǎn)，如槲皮素片、黃芩苷片和銀杏葉制劑等，所以提取具有較高生物活性的黃酮類化合物越來越重要。提取黃酮的傳統(tǒng)方法有浸提法、索氏提取法和回流法等，近年來在提取工藝方面出現(xiàn)了酶法提取、微波提取以及超聲提取等新方法[5-10]。本實驗采用超聲波輔助溶劑浸提法，利用超聲波的空化作用加速細胞壁的破碎，促使細胞胞內(nèi)黃酮的盡快溶出，大大縮短提取時間[11-12]，并通過單因素考察結(jié)合響應(yīng)面法對白花菜黃酮的提取工藝進行優(yōu)化。

1 實驗部分

1.1 實驗原料及藥品

實驗原料：白花菜，購于撫順。

實驗藥品：硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉，以上試劑均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑沈陽公司；蘆?。?00 g，分析純，購于合肥博美生物科技有限公司。

1.2 實驗方法及步驟

1.2.1 白花菜中黃酮類化合物的提取方法 精確稱取1.00 g干燥后的白花菜，用粉碎機將其粉碎，制成粉末樣品。將粉末樣品與乙醇溶液按設(shè)計的體積分數(shù)30%～100%和液固比(mL/g)10∶1～50∶1混合，在超聲功率10～50 W下超聲3～8 min，并在30～80 ℃水浴溫度下提取20～120 min，提取完成后將混合溶液在3 500 r/min臺式離心機下離心10 min，收集上清液，得到白花菜黃酮樣品。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13-16]，用分光光度計在510 nm波長處測定其吸光度，計算黃酮得率。

1.2.2 白花菜中黃酮得率的計算 黃酮得率的計算公式如下：

1.2.3 提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定 在單因素實驗中，考察乙醇體積分數(shù)、液固比、超聲功率、超聲時間、水浴溫度、水浴時間以及提取次數(shù)，對白花菜黃酮得率的影響，并在單因素實驗的基礎(chǔ)之上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法來優(yōu)化確定白花菜黃酮的最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對白花菜黃酮得率的影響

稱取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在液固比(mL/g)20∶1、超聲功率30 W、超聲時間5 min、水浴溫度50 ℃、水浴時間40 min的條件下，考察乙醇體積分數(shù)對白花菜黃酮得率的影響，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)對白花菜黃酮得率的影響

乙醇體積分數(shù)是影響提取效果的一個主要因素，一般情況下隨乙醇體積分數(shù)升高得率也會升高，但由圖1可以看出，白花菜黃酮的得率在乙醇體積分數(shù)30%～60%時呈直線上升，在乙醇體積分數(shù)60%～100%時，白花菜黃酮的得率逐漸減少，這是因為相似相溶原理，乙醇體積分數(shù)過高會溶出其他一些成分，因此，乙醇體積分數(shù)選定在50%～70%。

2.1.2 液固比對白花菜黃酮得率的影響 稱取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇體積分數(shù)50%、超聲功率30 W、超聲時間5 min、水浴溫度50 ℃、水浴時間40 min的條件下，考察液固比對白花菜黃酮得率的影響，實驗結(jié)果見圖2。

圖2 液固比對白花菜黃酮得率的影響

從圖2中可以看出，白花菜黃酮的得率隨液固比的增大先是大幅提高而后小幅度降低，當液固比(mL/g)為35∶1時，黃酮的得率達到峰值，當液固比(mL/g)大于35∶1時，白花菜黃酮的得率有所降低?？紤]到增加乙醇溶液的體積會增加生產(chǎn)中的操作費用，故選擇液固比(mL/g)為30∶1～40∶1。

2.1.3 超聲時間對白花菜黃酮得率的影響 稱取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇體積分數(shù)50%、液固比(mL/g)20∶1、超聲功率30 W、水浴溫度50 ℃、水浴時間40 min的條件下，考察超聲時間對白花菜黃酮得率的影響，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時間對白花菜黃酮得率的影響

從圖3中可以看出，白花菜黃酮得率在超聲時間3～5 min逐漸增加，當超聲時間5～8 min時，白花菜黃酮得率逐漸減少。因為延長超聲時間會增加能源的消耗，使生產(chǎn)周期延長，增加操作費用，所以超聲時間選定4～6 min。

2.1.4 超聲功率對白花菜黃酮得率的影響 稱取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇體積分數(shù)50%、液固比(mL/g)20∶1、超聲時間5 min、水浴溫度50 ℃、水浴時間40 min的條件下，考察超聲功率對白花菜黃酮得率的影響，實驗結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對白花菜黃酮得率的影響

從圖4中可以看出，超聲功率對白花菜黃酮得率的影響不大，所以從節(jié)約能耗、提高效率的角度考慮，確定超聲功率為30 W。

2.1.5 水浴時間對白花菜黃酮得率的影響 稱取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇體積分數(shù)50%、液固比(mL/g)20∶1、超聲功率為30 W、超聲時間5 min、水浴溫度50 ℃的條件下，考察水浴時間對白花菜黃酮得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 水浴時間對白花菜黃酮得率的影響

從圖5中可以看出，白花菜黃酮的得率基本不受水浴時間影響，因此，根據(jù)實驗水浴時間對白花菜黃酮得率的影響結(jié)果及其他因素的綜合考慮，選定水浴時間40 min。

2.1.6 水浴溫度對白花菜黃酮得率的影響 稱取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇體積分數(shù)50%、液固比(mL/g)20∶1、超聲功率為30 W、超聲時間5 min、水浴時間40 min的條件下，考察水浴溫度對白花菜黃酮得率的影響，實驗結(jié)果見圖6。

圖6 水浴溫度對白花菜黃酮得率的影響

從圖6 中可以看出，水浴溫度對白花菜黃酮的得率的影響不顯著。因此，根據(jù)本實驗水浴溫度對白花菜黃酮得率的影響及其他因素的綜合考慮，選定水浴溫度為50 ℃。

2.1.7 提取次數(shù)對白花菜黃酮得率的影響 稱取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇體積分數(shù)50%、液固比(mL/g)20∶1、超聲功率為30 W、超聲時間5 min、水浴溫度50 ℃、水浴時間40 min的條件下，離心得到上清液，將得到的濾渣再重復(fù)提取3次，考察提取次數(shù)對白花菜黃酮得率的影響，實驗結(jié)果見圖7。

圖7 提取次數(shù)對白花菜黃酮得率的影響

從圖7中 可以看出，提取1次已將絕大部分黃酮提取出來，在第2次、第3次、第4次提取中，黃酮得率增加幅度比較小。考慮到提取次數(shù)增加會延長生產(chǎn)周期、增加生產(chǎn)成本，故以1次提取次數(shù)為宜。

通過以上單因素實驗確定，當乙醇體積分數(shù)50%～70%、液固比(mL/g)30∶1～40∶1、超聲時間4～6 min、超聲功率30 W、水浴溫度50 ℃、水浴時間40 min、提取次數(shù)1次時，白花菜黃酮的得率較高。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，結(jié)合單因素實驗結(jié)果，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，對影響白花菜黃酮的提取條件進行進一步優(yōu)化，從而獲得提取白花菜黃酮的最佳提取條件，實驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 實驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表1

根據(jù)對3個變量中心復(fù)合設(shè)計后所測得的在一定實驗條件下白花菜黃酮得率的實驗結(jié)果，并對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到響應(yīng)變量和實驗變量的關(guān)系，如下列二元多次方程所示：

Y=2.06+0.22A+0.20B-0.005 250C- 0.096AB-0.048AC-0.064BC- 0.48A2-0.27B2-0.32C2

R2=0.952 0

響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果

由表2可知，在本實驗所涉及范圍內(nèi)，該模型P值為0.000 8，小于0.01，極顯著。該模型決定系數(shù)R2=0.952 0，說明該模型與實際實驗擬合良好，誤差小，證明應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法得到的提取條件提取白花菜黃酮是可行的。失擬項的P值是0.129 4，大于0.05，不顯著，說明該方程擬合不足，檢驗不顯著，無其他因素顯著影響本試驗。從表2中可以看出，因素A即乙醇體積分數(shù)，對白花菜黃酮得率影響最為顯著(P<0.05)，因素B即液固比，對白花菜黃酮得率影響也很顯著(P<0.05)。

2.2.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸分析結(jié)果做出響應(yīng)曲面圖和等高線圖，以判斷3個因素對黃酮得率的影響，進而推測出自變量與因變量二者之間的關(guān)系，結(jié)果見圖8—10。

(a) 響應(yīng)面3D圖

(b) 等高線圖

如圖8所示，當超聲時間一定時，液固比保持不變，隨乙醇體積分數(shù)的升高，白花菜黃酮得率增加，當乙醇體積分數(shù)達到一定值時，黃酮得率又有所降低；乙醇體積分數(shù)不變，隨液固比的增長，白花菜黃酮得率緩慢上升至穩(wěn)定。由此可以推斷出，在超聲時間一定的條件下，適當范圍內(nèi)的增加乙醇體積分數(shù)和液固比有助于提高黃酮得率。

(a) 響應(yīng)面3D圖

(b) 等高線圖

如圖9所示，當液固比一定時，保持超聲時間不變而增加乙醇體積分數(shù)，白花菜黃酮的得率呈上升趨勢，當乙醇體積分數(shù)增加到一定值時，隨超聲時間增加黃酮得率降低；保持超聲時間不變而增加乙醇體積分數(shù)，白花菜黃酮的得率逐漸增加，到達一定值后黃酮得率逐漸降低。由此表明，在液固比一定的情況下，適當范圍內(nèi)的乙醇體積分數(shù)和超聲時間有利于黃酮的提取。

(a) 響應(yīng)面3D圖

(b) 等高線圖

如圖10所示，當乙醇體積分數(shù)一定時，液固比不變，隨超聲時間的增加，黃酮得率增加，但超聲時間增加到一定值時，黃酮得率有所降低。超聲時間不變時，白花菜黃酮得率隨液固比的增加而升高至穩(wěn)定。

根據(jù)響應(yīng)面分析軟件的預(yù)測，得到白花菜黃酮的最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)64.27%、液固比(mL/g)32.30∶1、超聲時間4.90 min，黃酮得率理論預(yù)測值為1.922 4 mg/g。為檢驗試驗結(jié)果是否與實際一致，按照以上試驗結(jié)果進行驗證試驗?？紤]到實際操作的便利，將提取條件修正為：乙醇體積分數(shù)65%、液固比(mL/g)32∶1、超聲時間5 min。在此條件下進行3次平行試驗，得到白花菜黃酮實際平均得率為1.974 5 mg/g，與理論預(yù)測值相接近，可見該模型能較好地模擬和預(yù)測試驗中黃酮的得率。

3 結(jié) 論

采用超聲輔助溶劑浸提法結(jié)合單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實驗，提取白花菜黃酮的最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)65%、液固比(mL/g)32∶1、超聲功率為30 W、超聲時間5 min、水浴溫度50 ℃、水浴時間40 min、提取次數(shù)1次。通過響應(yīng)面優(yōu)化法得到的提取條件準確、可靠，具有實際應(yīng)用價值。

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(編輯 宋官龍)

Optimization on the Extraction Conditions of Flavonoids from Cauliflower Using Response Surface Methodology

Wang Fei, Shan Xiantong, Zhang Jiajing, Wang Zhanyong

(CollegeofChemistry,ChemicalEngineeringandEnvironmentalEngineering,LiaoningShihuaUniversity,FushunLiaoning113001,China)

The flavonoids was extracted from cauliflower by using ultrasonic-assisted solvent and the response surface methodology was used to optimize the extraction conditions. Firstly, the effects of different extraction factors (ethanol concentration, liquid-material ratio, ultrasonic power, ultrasonic time, bath temperature, bath time and extraction times) on flavonoids yield were studied. And then, Box-Behnken response surface optimization test was carried on the basic of singer factor test result. The optimal conditions were as follows: 65% ethanol, liquid-solid ratio 32∶1 mL/g, ultrasonic power 30 W, ultrasonic time 5 min, bath temperature 50 ℃, bath time 40 min, and extraction time 1. Under this optimum conditions, the actual yield of flavonoids was 1.974 5 mg/g, and it was very close to the prediction value.

Cauliflower; Flavonoids; Extraction; Response surface methodology

1672-6952(2017)01-0018-06

投稿網(wǎng)址：http://journal.lnpu.edu.cn

2016-05-12

2016-06-29

遼寧省高等學(xué)校杰出青年學(xué)者成長計劃項目(LJQ2014040)。

王菲(1982-)，女，博士，講師，從事食品生物技術(shù)研究；E-mail：107806708@qq.com。

TS209

A

10.3969/j.issn.1672-6952.2017.01.004