韓靜 張繼州 鐘志鳳 胡娟

【摘要】目的：探討栝樓桂枝湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后肢體運動功能以及生長相關蛋白-43的作用。方法：SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和栝樓桂枝湯組各7只，線栓法制作大鼠腦缺血再灌注模型，栝樓桂枝湯組于造模后給予栝樓桂枝湯治療，每日1次，連續(xù)14d。分別于造模后1d、3d、7d和14d采用改良神經功能缺損評分（mNSS）、平衡木平衡試驗（BeamBalance）、足失誤試驗評價神經功能恢復狀況；采用免疫熒光組織化學方法檢測腦缺血周邊區(qū)GAP-43的表達。結果：栝樓桂枝湯可顯著降低腦缺血損傷大鼠的mNSS評分、降低BeamBalance評分，減小足失誤比率（P<005）。栝樓桂枝湯組GAP43陽性細胞數較模型組顯著升高（P<005）。結論：栝樓桂枝湯可促進腦缺血損傷大鼠肢體功能的恢復，該活性可能與其增加腦組織GAP-43蛋白的表達相關。

【關鍵詞】栝樓桂枝湯；腦缺血；肢體功能；GAP-43

【中圖分類號】R285【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）02-0044-03

Abstract：

Keywords：

缺血性腦卒中以高發(fā)病率、高致殘率、高復發(fā)率己成為嚴重威脅人類生命與健康的主要疾病之一，超過三分之二的缺血性腦卒中患者遺留有不同程度的后遺癥，嚴重影響生活質量[1]。目前，針對缺血性腦卒中后遺癥尚無有效治療藥物，因此，研發(fā)可改善因腦缺血損傷所致的肢體障礙的藥物具有重要的臨床意義與應用前景。

栝樓桂枝湯出自張仲景《金匱要略》，用于治療太陽病引起的痙攣及內傷雜病中出現的抽搐、發(fā)痙、手足蠕動等，福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)院在臨床實踐中將該方運用于治療腦卒中后肢體痙攣，重用栝樓根，取其清熱生津、柔潤筋脈之效，取得了顯著的療效[2-3]。本研究在大鼠腦缺血再灌注模型上觀察栝樓桂枝湯對大鼠肢體功能障礙的作用，并通過觀察該方對腦組織生長相關蛋白-43（Growth Associated Protein-43，GAP-43）表達的作用探討栝樓桂枝湯治療腦缺血的作用機制。

1動物與材料

11動物SD大鼠，雄性，280～300g，共21只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（許可證號SCXK（滬）2015-0002），光暗周期12/12 h（光照時間8：00～20：00）下飼養(yǎng)，自由飲食。

12材料中藥飲片天花粉（批號：16031）、桂枝（批號：160402）、芍藥、甘草（批號：160401）、大棗（批號：160401）購自福建中醫(yī)藥大學附屬國醫(yī)堂。兔抗GAP-43抗體（批號：ab16053，Abcam公司），免疫熒光封閉液、抗熒光淬滅封片劑等購自碧云天生物技術公司，其余試劑為國產分析純。

2方法

21[JP2]大鼠局灶性腦缺血再灌注模型采用線栓法制作大腦中動脈閉塞/再灌注模型[4]。10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉動物，鈍性分離右側頸總動脈（Common Carotidartery， CCA）、頸外動脈（External Carotidartery， ECA）和頸內動脈（Internal Carotid Artery， ICA），分別電凝ECA分支枕動脈和甲狀腺上動脈。在距CCA分叉大約1cm處結扎ECA近心端，電凝遠心端。夾閉CCA，在ECA殘端距CCA分叉3mm處剪一小口，將MCAO線栓經ECA插入ICA，線栓頭端距CCA分叉處約18mm，此時進線有輕微阻力，栓線正好插至顱內的大腦前動脈，堵住大腦中動脈（MCA）開口，制成MCAO模型。造模后2h，以半劑量10%水合氯醛再次麻醉動物，拔出線栓，結扎ECA殘端。術后20～25℃條件下飼養(yǎng)大鼠，自由進食水。假手術組除不在頸內動脈插入線栓外，其余步驟與上述相同。[JP]

模型制作后按Longa神經功能缺失5分制評分標準[5]進行神經功能評分，評1～3分者為模型成功納入標準。評分標準：0分：無明顯神經缺損癥狀，活動正常；1分：提尾懸空時不能完全伸展左側前爪；2分：行走時身體向偏癱的左側轉圈，即追尾征；3分：行走時向偏癱的左側傾倒；4分：不能自發(fā)行走或清醒障礙。

22中藥煎煮方法及動物分組給藥栝樓桂枝湯煎劑由天花粉30g，桂枝9g，芍藥15g，甘草6g，生姜9g，大棗12 枚組成。按藥典方法進行顯微鑒定和指標性成分含量測定，符合藥典標準方可使用。中藥飲片放入電藥鍋加入去離子水，以水面超過藥物3～5cm為宜，浸泡40min后煎煮；先用武火燒開，再用文火煎熬20min；煎煮2次，合并2次煎液濃縮。根據動物體表面積等效劑量表計算，大鼠的灌胃劑量為生藥量5g/kg體重。

SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和栝樓桂枝湯組，每組7只，按上述方法造模，栝樓桂枝湯組于再灌注后即刻灌胃給予栝樓桂枝湯，每日1次，連續(xù)給藥14d，模型組和假手術組灌胃給予等體積生理鹽水。

23動物神經行為學評價于大鼠腦缺血再灌注后第1天、3天、7天、14天4個時間點，采用mNSS評分、平衡木平衡試驗和足失誤試驗，對動物神經行為學表現進行評分。

231mNSS評分參照文獻[6]進行改良神經損傷嚴重程度評分法（Modified Neurological Severity Score，mNSS），mNSS評分包含了對運動、感覺、反射及平衡的全面評價，最低分0分，最高分14分。0分為神經功能正常；1～5分為神經功能輕度損害；6～9分為神經功能中度損害；10～14分為神經功能重度損害。

232平衡木平衡試驗平衡木平衡試驗評價動物肢體的協(xié)調和平衡能力，動物放置在1根寬15cm，長30cm，高于地面30cm的木條[6]上，觀察動物在其上的行為表現，評分為0～6分。0分：保持平衡穩(wěn)定狀態(tài)；1分：抓緊平衡木邊緣；2分：抓緊平衡木并1只腳從平衡木落下；3分：抓緊平衡木，并且2只腳從平衡木上落下，或在平衡木旋轉（>60s）；4分：試圖在平衡木上保持平衡，但落下（>40s）；5分：試圖在平衡木上保持平衡，但落下（>20s）；6分：落下：沒有試圖保持平衡或抓住平衡木（<20s）。得分越高神經損傷越嚴重。

233足失誤試驗足失誤試驗[7]是評價動物前肢定位功能的行為學實驗，實驗動物被放置在1個45 cm×30 cm，高于地面25cm的網格平板上，網格的尺寸是25 cm×25 cm，生理情況下，動物在網格上行進時會將它們的爪子放在網格線的交叉處，當病理條件下，動物無法正確放置它們的爪子，前肢會掉落在網格中。當爪子掉落或滑落在網格線之間，被記錄為1次足失誤，記錄3min內，雙側前肢行走步數及其中左側前肢的足失誤次數，以足失誤次數占總的前肢行走步數的百分比表示足失誤評分。

24免疫熒光化學染色及圖像分析最后一次行為學評價結束后，各組取5只動物，10%水合氯醛麻醉，經心臟灌注4%多聚甲醛，取腦，經20%、30%蔗糖梯度脫水后，制作30μm冠狀冰凍切片。采用漂片法進行GAP-43免疫熒光染色，切片經001MPBS洗滌后，在山羊血清中室溫封閉1h，然后抗GAP-43抗體（1∶400）中4℃孵育過夜，隨后在熒光標記二抗中37℃避光孵育1h。最后將切片裱于玻片，用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡400倍鏡下觀察并拍照，各組每例動物均拍攝2張腦片，每張切片拍攝5個不重疊的隨機視野，計數各視野的平均陽性細胞數。

25統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行數據處理，計量資料用均數加減標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析及LSD-t檢驗，P< 005表示差異有統(tǒng)計學意義。

3結果

31栝樓桂枝湯改善腦缺血再灌注大鼠神經行為學評分大鼠腦缺血再灌注后，神經功能減弱，mNSS評分顯著增加（P<001），給予栝樓桂枝湯，于腦缺血再灌注后1d起即可顯著降低mNSS評分（P<005），改善神經行為學功能（見表1）。平衡木測試和足失誤測試是評價動物平衡和肢體協(xié)調能力的測試，結果見表2、3，栝樓桂枝湯組動物在各個時間點的BeamBalance評分均低于模型組（P<005），腦缺血再灌注后1d、3d和7d，栝樓桂枝湯組動物足失誤的比率低于模型組（P<005），表明栝樓桂枝湯可改善腦缺血動物肢體平衡力和肢體的協(xié)調性。

32栝樓桂枝湯對腦缺血周邊腦皮質GAP-43表達的影響免疫熒光組織化學染色結果顯示，GAP-43陽性標記主要分布于神經細胞胞體和突起的胞質中，假手術組僅有少量GAP-43陽性染色分布。模型組GAP-43陽性細胞數顯著多于假手術組（P<001），而給予栝樓桂枝湯治療可增加GAP-43的免疫熒光強度，陽性細胞數顯著增加（P<005）。

表4栝樓桂枝湯對腦組織GAP-43表達的影響（x±s）

組別例數GAP-43陽性細胞數

假手術組52086±388

模型組54134±1106#

栝樓桂枝湯組5566±779*

注：與模型組比較，*P<005；與假手術組比較，#P<001。

4討論

研究采用mNSS、平衡木平衡、足失誤試驗等多種神經行為學評價手段，觀察了栝樓桂枝湯對腦缺血再灌注大鼠神經行為和肢體障礙康復的作用，結果顯示栝樓桂枝湯可顯著改善腦缺血所致的神經行為功能障礙，改善動物平衡力和肢體協(xié)調性，表明了栝樓桂枝湯對腦缺血損傷具有神經保護作用。

GAP-43是神經組織特異性磷酸蛋白，分布于神經元、再生的雪旺細胞和神經膠質細胞，對于神經系統(tǒng)發(fā)育過程的軸突生長和突觸形成具有重要的促進作用，被認為是神經元軸突生長發(fā)育和可塑性的分子標記物[8]。研究顯示[9]，在腦缺血損傷時，GAP-43的表達增高與內源性神經再生相關。本研究顯示，大鼠腦缺血再灌注損傷14d后，腦組織缺血周邊皮質GAP-43的表達顯著高于假手術組，給予栝樓桂枝湯后觀察到，大鼠腦缺血周邊區(qū)腦皮質GAP-43的表達顯著升高，這一結果表明栝樓桂枝湯可促進腦缺血損傷后的軸突生長發(fā)育和突觸可塑性，這可能是栝樓桂枝湯改善腦缺血后肢體功能障礙的機制之一。

參考文獻

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（編輯：梁志慶）