張婷　左雪枝　賴艷

摘 要：植物內(nèi)生真菌是指生活在健康植物組織內(nèi)但并不使寄主產(chǎn)生明顯侵染性狀的真菌，其代謝產(chǎn)物與宿主有著相同或者相似的生理活性。本研究利用顏色反應(yīng)和薄層層析法從油茶14株內(nèi)生真菌中篩選到一株具有產(chǎn)多酚能力的內(nèi)生真菌（CO-10）。同時(shí)結(jié)合核糖體基因居間序列（ITS）的序列相似性分析，確定菌株CO-10屬于曲霉屬真菌。

關(guān)鍵詞：顏色反應(yīng)；薄層層析；多酚；曲霉屬

中圖分類號(hào)：S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161132031

內(nèi)生真菌（Endophytic Fungi）是指存在于健康植物的莖干、葉片或葉柄等組織部位中，度過(guò)了全部或近全部生活周期而不使宿主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌[1]。內(nèi)生真菌長(zhǎng)期存在于宿主體內(nèi)，與宿主協(xié)同進(jìn)化，建立了良好的、互惠互利的共生關(guān)系。

油茶（Camellia oleifera）是我國(guó)特有的木本油料樹(shù)種，是一種常綠、闊葉的生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。關(guān)于油茶內(nèi)生真菌的研究剛剛起步，周生亮等[2]用免培養(yǎng)法對(duì)油茶葉片中的內(nèi)生真菌進(jìn)行研究，通過(guò)序列測(cè)定和比對(duì)確定了12個(gè)不同的分類操作單元，分屬于曲霉屬Asperillus、球腔菌科Mycosphaerellaceae、糞殼菌目Sordariales和蠟釘菌目Helotiales。 Zhang等[3]采用傳統(tǒng)方法從江西省林科院油茶園中選取了9株油茶健康植物進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。結(jié)果顯示油茶內(nèi)生真菌的種類涉及59個(gè)分類單元，其中芒果球座菌G.mangiferae為油茶內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種，青霉屬Penicillum、鏈格孢屬Alternaria、鐮孢屬Fusarium在油茶不同組織部位也常常出現(xiàn)。雖然這些研究結(jié)果均表明油茶的內(nèi)生真菌種類相當(dāng)豐富，但有關(guān)油茶內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物研究并未開(kāi)展。油茶除了主要產(chǎn)品茶油外，還可生成多種生理活性物質(zhì)，多酚就是其中一種。植物多酚具有抗氧化、延緩機(jī)體衰老、抑制糖尿病、高血壓等疾病發(fā)生的作用，具有可觀的應(yīng)用前景[4]。可是傳統(tǒng)的提取方式工序復(fù)雜，耗時(shí)耗力，效率不高，對(duì)環(huán)境污染大，且很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化連續(xù)性產(chǎn)出。鑒于此，我們對(duì)油茶內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，希望能找到一種能產(chǎn)多酚的植物內(nèi)生真菌，利用生物發(fā)酵的方式來(lái)替代傳統(tǒng)的化學(xué)浸提法，以實(shí)現(xiàn)更高效、更節(jié)省、更環(huán)保、更方便的連續(xù)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

新鮮的油茶組織采自湖北京山，帶回實(shí)驗(yàn)室在24h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。

1.2 內(nèi)生真菌的分離純化

按照周希等[5]的方法，將油茶組織洗凈，表面消毒后，切成小塊接種于PDA固體培養(yǎng)基上，在適當(dāng)條件下培養(yǎng)數(shù)天，進(jìn)行純化接種，將純化的菌株保存于PDA斜面培養(yǎng)基中，備用。

1.3 內(nèi)生真菌的發(fā)酵培養(yǎng)

1.3.1 液態(tài)發(fā)酵

取出保存的菌種活化，活化后進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。每個(gè)菌種接兩環(huán)于PDA液體培養(yǎng)基中，先靜置于28℃恒溫箱中12h左右，然后移至28℃恒溫?fù)u床上150r/min培養(yǎng)3～5d，注意定時(shí)觀察。

1.3.2 發(fā)酵液的處理

要分離菌和發(fā)酵液。對(duì)于菌絲生長(zhǎng)旺盛已形成大量菌絲球的菌液，直接抽濾，方便快捷；對(duì)于菌絲生長(zhǎng)不明顯或是沒(méi)用形成明顯菌絲體的菌液，可采用離心分離的方法，利用離心機(jī)4000r/min離心5min左右即可。

將分離好的發(fā)酵液倒入梨形分液漏斗，等體積加入乙酸乙酯加蓋充分振蕩，靜置萃取過(guò)夜。分離兩相，取上層清夜，即乙酸乙酯相；將菌體經(jīng)由120℃烘箱烘干，加滅菌石英砂研磨成粉狀，用適量乙酸乙酯浸提過(guò)夜后，4000r/min離心5min分離。將液相與同種菌的發(fā)酵液的乙酸乙酯相合并后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，得到的膏狀物質(zhì)。用5mL甲醇溶解，分裝到4個(gè)1.5mLEP管中，4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 篩選及鑒定

1.4.1 篩選

用酒石酸亞鐵顏色反應(yīng)進(jìn)行初篩，用薄層層析法進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩時(shí)，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，展層劑為苯和乙醇的混合物，展層后噴灑顯色劑（醋酸-亞硝酸鈉-氫氧化鈉）檢測(cè)。

1.4.2 菌株的鑒定

鑒定采用分子鑒定，用CTAB法提取真菌的基因組

DNA，擴(kuò)增反應(yīng)所用引物為ITS-1（5- TCCGTAGGTG-

AACCTGCGG-3）和ITS-4（5-TCCTCCGCTT-ATTGTATGC-3）[6]。擴(kuò)增、克隆后送取適量陽(yáng)性克隆子的菌液送武漢博奧生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)定的序列以NCBI GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中的相似序列比對(duì)分析，再用MEGA軟件進(jìn)行聚類分析，根據(jù)聚類分析圖確定分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

油茶組織塊在接著3d后，組織塊邊緣就有菌絲長(zhǎng)出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，長(zhǎng)出的菌絲種類逐漸增多，在每一次觀察到有新菌絲長(zhǎng)出時(shí)，都及時(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)接、純化，最后共得到14株形態(tài)不同的內(nèi)生真菌菌株，這14株內(nèi)生真菌菌株的編號(hào)及菌落特征如表1所示。

2.2 篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)酒石酸亞鐵顏色反應(yīng)初篩顯示僅CO-10反應(yīng)后呈現(xiàn)藍(lán)色，提示可能含有多酚類物質(zhì)。復(fù)篩結(jié)果如圖1所示，對(duì)初篩出的菌株發(fā)酵提取物和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照進(jìn)行薄層層析，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)樣品有一個(gè)與標(biāo)準(zhǔn)樣遷移率相同的斑點(diǎn)，說(shuō)明樣品中可能含有茶多酚。

2.3 分子鑒定

菌株CO-10提取基因組DNA后，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為630bp的擴(kuò)增片段。以鏈格孢屬菌株（Alternaria sp.）為外群，按照NJ（neighbor-joining）法所構(gòu)的聚類分析圖如圖2所示。CO-10與曲霉屬的菌株聚為一支，自信值為100，從而判斷CO-10屬曲霉屬Aspergillus.

3 討論

內(nèi)生真菌存在于植物體內(nèi)，通常能產(chǎn)生與植株相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，張海龍等[7]從銀杏中篩選出了2株具有產(chǎn)黃酮化合物能力的內(nèi)生真菌，徐慧超等[8]從甘草中篩選出了一株內(nèi)生真菌RE7，從其發(fā)酵液中分離得到了甘草次酸；吳曉民等[9]從珍貴藥用植物高山紅景天中得到了一株可產(chǎn)紅景天苷的內(nèi)生真菌G5；正是由于內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生各種各樣的抗腫瘤、抗氧化、抗菌等作用的生理活性物質(zhì)，引起了無(wú)數(shù)研究者的熱情。

本研究利用常規(guī)的組織分離法分離來(lái)自湖北京山油茶樣品中的內(nèi)生真菌，油茶組織經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒后共分離到14株形態(tài)不一的內(nèi)生真菌，說(shuō)明在油茶的不同組織部位均有內(nèi)生真菌分布。對(duì)分離到的內(nèi)生真菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，濃縮發(fā)酵液，并用極性有機(jī)溶劑萃取。由于多酚中的羥基與鐵離子螯合可生成藍(lán)紫色的絡(luò)合物，因此用酒石酸亞鐵進(jìn)行顏色反應(yīng)初篩，初篩結(jié)果顯示CO-10可能具有產(chǎn)多酚物質(zhì)的能力。多酚類物質(zhì)的種類很多，在復(fù)篩中以沒(méi)食子酸做標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)CO-10的代謝物種是否有與沒(méi)食子酸結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)存在，層析結(jié)果顯示在CO-10的層析斑點(diǎn)中具有與沒(méi)食子酸一樣遷移率的斑點(diǎn)，說(shuō)明菌株CO-10能產(chǎn)生與沒(méi)食子酸結(jié)構(gòu)相似的多酚類物質(zhì)。

分子鑒定已成為真菌分類的一種有力的和必不可少的方法。在DNA標(biāo)記中，ITS區(qū)域是最常用于物種鑒定的，它被認(rèn)為是真菌的條形碼，已成功地鑒定了70%的真菌[10]。本研究對(duì)菌株CO-10的分子鑒定結(jié)果顯示其屬于曲霉屬Aspergillus，在陳可可等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)曲霉屬真菌能控制后發(fā)酵過(guò)程，能改變普洱茶中茶多酚的組成與含量，但是對(duì)于其具體作用機(jī)制并未作出明確解釋。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)其原因可能是由于曲霉屬真菌具有產(chǎn)多酚類物質(zhì)的能力，也可能是由于曲霉屬真菌能夠產(chǎn)多酚形成過(guò)程中的一些酶類，從而促進(jìn)了物質(zhì)向某一特定方向的轉(zhuǎn)化過(guò)程。

內(nèi)生真菌作為一種新開(kāi)發(fā)的微生物資源，具有微生物生長(zhǎng)和繁殖快速、培養(yǎng)簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，且能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，有望突破植物資源缺乏、再生周期長(zhǎng)等限制，成為天然活性化合物生產(chǎn)的新途徑。因此，在后續(xù)的研究中，還需測(cè)定菌株CO-10產(chǎn)多酚類物質(zhì)的能力，并選取一定的方法提高其產(chǎn)量，加快育種工作。

參考文獻(xiàn)

[1]徐亞軍.植物內(nèi)生菌資源多樣性研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（24）：149-152.

[2]Zhou SL，Yan SZ，Wu ZY，et al.Detection of endophytic fungi within foliar tissues of Camellia oleifera based on rDNA ITS sequences[J].Mycosystem，2013，32（5）：819-830.

[3]張林平，張揚(yáng)，王舒，等.油茶不同部位的內(nèi)生真菌組成及多樣性分析[J].林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2013，27（6）：101-105.

[4]陳亮，李醫(yī)明，陳凱先，等.植物多酚類成分提取分離研究進(jìn)展[J].中草藥，2013，44（11）：1501-1508.

[5]周希，張婷，張苗，等.油茶內(nèi)生真菌的分離[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（16）：8958-8959.

[6]劉紫英.產(chǎn)黃酮成分的綬草內(nèi)生真菌的鑒定[J].菌物學(xué)報(bào)， 2011，30（1）：133-137.

[7]張龍海，李善春，盧維浩，等.銀杏內(nèi)生真菌多樣性與產(chǎn)黃酮類物質(zhì)真菌的分離和鑒定[J].土壤，2015，47（1）：135-141.

[8]徐慧超，孫婷媛，翟李欣，等.產(chǎn)甘草次酸內(nèi)生真菌RE7的鑒定及抑菌活性研究[J].中國(guó)新藥雜志，2016，25（1）：102-117.

[9]吳曉民，任謂明，楊信東，等.高山紅景天內(nèi)生真菌的分離及產(chǎn)紅景天苷菌株的篩選[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（11）：2769-2772.

[10]Chen J，Zhang LC，Xing YM，et al. Diversity and taxonomy of endophytic Xylariaceous Fungi from medicinal plants of Dendrobium （Orchidaceae）[J].PLOS ONE，20138（3）：e58268.

[11]陳可可，張香蘭，朱宏濤，等.曲霉屬真菌在普洱茶后發(fā)酵中的作用[J].云南植物研究，2008，30（5）：624-628.

作者簡(jiǎn)介：張婷（1980-），女，碩士，講師，主要從事：微生物資源利用研究。