賈學斌，鄒 燚，楊夢成，董全勝，孫云龍，孫 輝

(1. 黑龍江大學 建筑工程學院，150080 哈爾濱；2. 哈爾濱工業(yè)大學 市政環(huán)境工程學院，150090 哈爾濱)

寒冷地區(qū)含酚廢水的厭氧處理技術(shù)研究

賈學斌1，鄒 燚2，楊夢成2，董全勝2，孫云龍1，孫 輝2

(1. 黑龍江大學 建筑工程學院，150080 哈爾濱；2. 哈爾濱工業(yè)大學 市政環(huán)境工程學院，150090 哈爾濱)

針對北方寒冷地區(qū)酚類廢水處理效能低下，課題以苯酚廢水為研究對象，在低溫條件下，通過向原水中梯度增加苯酚質(zhì)量濃度，考察改進型高效厭氧反應(yīng)器對其的去除效能，同時采用PCR擴增、克隆文庫構(gòu)建、生物信息學與統(tǒng)計學分析等分析手段，探究適應(yīng)低溫條件下酚類廢水的優(yōu)勢菌群，結(jié)果表明，在溫度為10～150 ℃，純苯酚廢水進水時COD的去除率穩(wěn)定在50%，且馴化后B/C值由0.08增加到0.21，同比增加162.5%，基因分析得出系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢菌群是絮狀束毛球菌屬(Trichococcus sp.)，占細菌培養(yǎng)總數(shù)的68%.

低溫；苯酚；厭氧處理；優(yōu)勢菌群；PCR

目前苯酚廢水的處理方法主要有物化法和生物法兩種，物化法存在占地面積大、操作條件苛刻和處理效果不理想等問題，而生物降解法主要是利用微生物作用降解去除苯酚，具有成本低、運行相對簡單、無二次污染等優(yōu)勢，但苯酚對微生物有嚴重的毒性作用，常規(guī)的生物處理方法存在苯酚降解細菌生長緩慢，易大量流失等問題，嚴重影響了苯酚的處理效果[1].而且北方寒冷地區(qū)冬季氣溫很低,致使生化池水溫降至12 ℃左右，微生物降解速率(活性)明顯下降,使出水中的苯酚含量超標,給冬季污水廠的正常運行造成困難.因此本研究利用改進型EGSB反應(yīng)器(在傳統(tǒng)EGSB反應(yīng)器的污泥床區(qū)固定安裝有導流擾流裝置以及柔性纖維填料生物膜)處理含酚廢水，強化優(yōu)勢菌種的培養(yǎng)，同時通過PCR擴增技術(shù)，分離鑒定優(yōu)勢菌種，以期為高效厭氧反應(yīng)器大規(guī)模的應(yīng)用于含含酚廢水的高效處理提供理論和技術(shù)支撐[2-4].

1 實驗材料與方法

1.1 實驗用水水質(zhì)

原水：用葡萄糖配制進水實驗用原水，COD 質(zhì)量濃度控制在2 000 mg/L左右，pH值控制在6.8～7.2，溫度為10～150 ℃.

模擬苯酚廢水：苯酚從100 mg/L按5%的比例逐量增加至844.5mg/L(即純苯酚廢水進水).

1.2 實驗裝置圖

實驗裝置如圖1示，該試驗裝置為自制的升流式強制環(huán)流外循環(huán)反應(yīng)器，反應(yīng)器的反應(yīng)區(qū)增設(shè)了導流擾流裝置，有利于控制顆粒污泥床的膨脹度和泥水混合強度，提高傳質(zhì)效果，同時還在反應(yīng)區(qū)增加了柔性纖維填料，大大增加了系統(tǒng)的生物量.

1—進水桶；2—進水泵；3—轉(zhuǎn)子流量計；4—控制閥；5—回流泵；6—取樣口；7—取料口；8—保溫材料；9—污泥床區(qū)；10—污泥沉降區(qū)；11—三相分離器；12—水封瓶；13—閥門；14—CO2吸收瓶；15—馬氏瓶；16—量筒；17—出水桶圖1 升流式強制環(huán)流外循環(huán)反應(yīng)器示意圖

1.3 實驗方法

1.3.1 高效厭氧廢水處理器的運行

試驗用水為自配苯酚廢水，試驗接種污泥采用哈高科EGSB厭氧反應(yīng)器中的顆粒污泥，實驗過程中逐步提高進水中苯酚質(zhì)量濃度到設(shè)計苯酚質(zhì)量濃度，研究COD、苯酚、BOD的變化情況，其中COD 、BOD的測定參見《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》，苯酚的質(zhì)量濃度通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)進行測定.

1.3.2 基因組DNA提取和PCR擴增

對反應(yīng)器穩(wěn)定運行后的活性污泥樣品進行 16S rDNA 測序.按照上海華舜生物公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒的步驟提取篩選得到的活性污泥 DNA 后，用細菌通用引物BSF 8/27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和BSR 1525/1541：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′進行16S rRNA 基因擴增加.

1.3.3 克隆文庫構(gòu)建

將目的基因片段進行PCR擴增之后，進行產(chǎn)物純化，純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中，涂平板，隨機挑取克隆進行轉(zhuǎn)化子鑒定.每個樣品挑取50個陽性轉(zhuǎn)化子利用ABI 3730測序儀測序.

1.3.4 生物信息學與統(tǒng)計學分析

16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫通過BLAST功能進行比對分析.進化樹構(gòu)建和分類單元(OTU)分析使用軟件phylip-4.0進行，通過Jukes-Cantor計算方法，以Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)進化樹，自展評估1 000次.

2 結(jié)果與討論

2.1 馴化過程中COD去除效能

逐漸增加進水中苯酚質(zhì)量濃度主要是強化對反應(yīng)器內(nèi)顆粒污泥的馴化，篩選出能夠降解苯酚廢水的優(yōu)勢菌種，顆粒污泥馴化分為三個階段：首先在不改變原進水COD質(zhì)量濃度的前提下，按5%的比例逐量增加苯酚廢水；然后按糖廢水∶苯酚廢水為1∶1的比例進水；第三階段為純苯酚廢水進水.

圖2為馴化過程中進水COD質(zhì)量濃度和COD去除率的變化情況，由圖2可見，馴化過程中反應(yīng)器進水的COD質(zhì)量濃度一直維持在2 000 mg/L上下.隨著馴化過程的進行，反應(yīng)器的COD去除率持續(xù)降低，由85%降到了50%；在第一階段，去除率由85%降到76%，下降了9%，占總下降去除率的25.7%，COD去除率平均每天下降0.64%；在第二階段剛開始時，COD去除率降幅最快，去除率由76%降到53%，占總下降去除率的65.7% ， COD去除率平均每天下降1.64%；在馴化的第三階段，產(chǎn)氣量平穩(wěn)，去除率由53%降到50%左右，占總下降去除率的8.6% ， COD去除率平均每天下降0.37%；出水COD穩(wěn)定在1 000 mg/L左右，COD去除率維持到了50%左右.由于苯酚對顆粒污泥具有毒性，隨著苯酚質(zhì)量濃度的增大，其對顆粒污泥的毒性也逐漸增強，故初期COD去除率高，隨后逐漸降低，最后穩(wěn)定在50%左右，這也是顆粒污泥對苯酚逐漸適應(yīng)的一個過程，即降解苯酚的優(yōu)勢菌種緩慢形成的一個過程[5].

圖2 進出水COD質(zhì)量濃度和COD去除率

2.2 苯酚質(zhì)量濃度對苯酚去除率的影響

從圖3可以看出，在前 6 d，苯酚去除率比較低，在 10%左右，這是因為長期用葡萄糖培養(yǎng)的顆粒污泥幾乎沒有降解苯酚的能力，而COD 去除率達 80%左右.第8天開始苯酚去除率逐漸上升，說明污泥逐漸具備了降解苯酚的能力.在第二階段，苯酚去除率快速提高，在第28天達到45%，而COD去除率去除率由76%降到53%，說明顆粒污泥對苯酚的適應(yīng)性增強，苯酚降解菌開始大量繁殖，污泥的苯酚去除活性變強.29 d開始將進水苯酚質(zhì)量濃度提高到844.5 mg/L(即純苯酚廢水)，經(jīng)過一段時間的適應(yīng)苯酚去除率穩(wěn)定在 50%左右，COD去除率也穩(wěn)定在 50%左右.說明厭氧顆粒污泥馴化成功[6]，系統(tǒng)具備了較好的降解苯酚作用.

圖3 進出水苯酚質(zhì)量濃度和苯酚去除率

2.3 馴化前后出水可生化性分析

通常以BOD5/CODMn(即B/C值)衡量污水的可生化性，一般B/C低于0.2時，則認為該污水的可生化性差.本實驗用苯酚廢水的B/C值僅為0.08，可生化性極差，微生物難以分解利用，常規(guī)的污水處理工藝難以保證苯酚的去除效果[7].

本實驗通過改進傳統(tǒng)EGSB反應(yīng)器，強化了水力循環(huán)效果，增強厭氧酸化效果，將部分難以降解的有機物分解為易降解的小分子物質(zhì)，有效提高出水的可生化性，如表1示.馴化前B/C值為0.08，馴化后B/C值為0.21，同比增加了162.5%，可生化性大大提高，該類污泥微生物在厭氧環(huán)境不但能夠較好的適應(yīng)苯酚的能力，優(yōu)勢菌種不斷增長繁殖，而且能起到降解和轉(zhuǎn)化作用.

表1 厭氧污泥與苯酚廢水接觸實驗數(shù)據(jù)

類別馴化前馴化后COD/(mg·L-1)BOD/(mg·L-1)B/CCOD/(mg·L-1)BOD/(mg·L-1)B/C累計產(chǎn)氣量/mL反應(yīng)器2120169．60．081484318．80．21134．3

圖4 由Neighbor-Joining法繪制的系統(tǒng)進化樹圖

2.4 耐酚及降解酚類微生物的篩選及鑒定

由Neighbor-Joining法繪制的系統(tǒng)進化樹(圖4)可以看出，b01，b11，b18等34個菌株的16SrDNA序列與Trichococcus sp.同源性的最大相似數(shù)為99%；b07菌株的 b16SrDNA序列與Propionigenium sp.同源性的最大相似數(shù)為89%；b23，b47的16SrDNA序列與Clostridium sp.同源性的最大相似數(shù)為99%、93%；b28的16SrDNA序列與Citrobacter sp.同源性的最大相似數(shù)為99%；b38，b44的16SrDNA序列與Bacteroidetes sp.同源性的最大相似數(shù)為86%、97%；b43的16SrDNA序列與Endophytic bacteriumsp.同源性的最大相似數(shù)為95%；b49的16SrDNA序列與Syntrophobacter sp.(產(chǎn)乙酸桿菌屬)同源性的最大相似數(shù)為88%，基本上可以確定這些菌株就是上述菌種[8-10].

該耐酚活性污泥系統(tǒng)中的微生物最主要的細菌Trichococcus sp.，占細菌培養(yǎng)總數(shù)的68%，如圖5所示，該菌革蘭氏陽性，不運動，不生芽孢.在液體培養(yǎng)基中形成絮狀.在固體培養(yǎng)上有彎曲的鏈.兼性厭氧.化能異養(yǎng)，發(fā)酵型，生長緩慢.從各種碳水化合物類產(chǎn)酸，接觸酶陽性，氧化酶陰性，吲哚陰性，不還原硝酸鹽，MR陽性[11].

圖5 耐酚細菌的優(yōu)勢菌群分析

此外，經(jīng)過耐酚富集培養(yǎng)實驗中存在有產(chǎn)酸5株4個菌種：Syntrophobacter sp.、Propionigenium sp.、Clostridium sp.、Citrobacter sp.雖然占的個數(shù)比例較少，但顯得格外受關(guān)注，除了本身能夠耐受酚類的毒害之外，有可能與Trichococcus sp.及大量的其他Uncultured Bacteroidetes sp.在低溫環(huán)境下，經(jīng)誘導酶的作用，進行共代謝，這些產(chǎn)酸細菌能夠?qū)⒎宇愇镔|(zhì)的甲基、醛基及羥基轉(zhuǎn)化為有機酸，破解酚類苯環(huán)結(jié)構(gòu)以化解毒性和降解有機物[12-13].

3 結(jié) 論

在低溫條件下，通過改進EGSB工藝去除苯酚廢水效能研究，得出以下幾點結(jié)論：

1)當進水苯酚為100 mg/L時，COD去除率達到85%，隨著苯酚質(zhì)量濃度的增高COD去除率逐漸降低至50%左右；同時馴化前B/C值為0.08，馴化后B/C值為0.21，同比增加了162.5%，可生化性大大提高.

2)隨著苯酚質(zhì)量濃度的升高，顆粒污泥逐漸對苯酚廢水得以適應(yīng)，苯酚去除率逐漸提高，當純苯酚(844.5 mg/L)進水時，去除率控制在50%左右.

3)通過分類進化樹確定被苯酚馴化后的優(yōu)勢菌群是絮狀束毛球菌屬(Trichococcus sp.)，占細菌培養(yǎng)總數(shù)的68%，與一般發(fā)現(xiàn)的桿菌屬不同.針對北方寒冷地區(qū)情況,篩選出的高效低溫苯酚降解菌，能夠切實有效地改善低溫條件下污水生物處理的效果.因此，開發(fā)菌劑推廣使用，對于處理含酚廢水不僅具有一定的理論意義，而且具有重大的工程應(yīng)用價值和廣闊的市場前景.

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Study on anaerobic treatment of phenolic wastewater in cold area

JIA Xue-bin1, ZOU Yi2, YANG Meng-cheng2, DONG Quan-sheng2, SUN Yun-long1, SUN Hui2

(1. School of Civil Engineering, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2.School of Municipal Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)

Since phenol wastewater treatment efficiency was low in cold areas of northern China. Therefore, there is an urgent need to search for novel strategies for phenolic wastewater treatment. The experiment, with phenolic wastewater as the object of the research, was performed in a gradient of increasing phenol-containing raw water in low temperature to evaluated removal efficiency of modified high-rate anaerobic apparatus. Dominant bacteria was separated and identified. It was shown that COD removal rate was up to 50% for pure phenol wastewater (844.5 mg/L) when the temperature varied from 10 °C to 15 °C and B/C value increased from 0.08 to 0.21 after domestication with a rise of 162.5%.The results of genetic analysis suggested that the Trichococcus sp. was dominant bacteria accounting for 68% of the total bacterial.

low temperatures; phenol; anaerobic; dominant microflora; PCR

2016-05-10.

賈學斌(1972-)，男，博士，副教授，碩士研究生導師，研究方向：污水及工業(yè)廢水厭氧處理.

X703

A

1672-0946(2017)01-0033-04