楊海艷, 鄭志鋒， 王 堃, 馬建鋒， 史正

(1.西南林業(yè)大學(xué) 材料工程學(xué)院, 云南 昆明 650224；2.北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083；3.國(guó)際竹藤中心， 北京 100102)

原子力顯微鏡在纖維素研究中的應(yīng)用

YANG Haiyan

(1.西南林業(yè)大學(xué) 材料工程學(xué)院, 云南 昆明 650224；2.北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083；3.國(guó)際竹藤中心， 北京 100102)

原子力顯微鏡(AFM)作為一種重要的表面成像技術(shù)，可在不同工作模式(接觸式、非接觸式和敲擊式等)下通過(guò)對(duì)探針與樣品表面作用力的監(jiān)測(cè)表征纖維素及其衍生物的大分子結(jié)構(gòu)特征和纖維素材料的表面形態(tài)特征。通過(guò)AFM觀測(cè)發(fā)現(xiàn)：在結(jié)構(gòu)上天然纖維素以纖維二糖為重復(fù)單元，結(jié)晶區(qū)內(nèi)單斜晶系和三斜晶系緊密相關(guān)并以1/4重復(fù)單元的錯(cuò)位排列；在細(xì)胞壁中，微纖絲之間通過(guò)半纖維素相連形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且分子微細(xì)結(jié)構(gòu)隨植物種類(lèi)、細(xì)胞壁區(qū)域的不同而變化。在纖維素的應(yīng)用研究中， AFM對(duì)纖維素基材料的研究起到了有效的推動(dòng)作用，為紙漿性能的提高、紙張保存、材料制備中反應(yīng)歷程和機(jī)理的探索提供了理論依據(jù)。

原子力顯微鏡；纖維素；細(xì)胞壁；結(jié)構(gòu)；應(yīng)用

世界范圍的環(huán)境惡化和能源緊缺問(wèn)題吸引了越來(lái)越多學(xué)者關(guān)注生物質(zhì)資源的研究與開(kāi)發(fā)利用，并致力于將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可取代化石資源的能源和化工原料產(chǎn)品。纖維素是生物質(zhì)資源中最重要的一類(lèi)天然高分子化合物，在植物細(xì)胞壁中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)35%～50%[1]，來(lái)源廣泛，儲(chǔ)量豐富，常常作為原料被廣泛地應(yīng)用于紡織工業(yè)、食品工業(yè)以及醫(yī)藥行業(yè)，因此，對(duì)纖維的結(jié)構(gòu)研究十分重要。對(duì)高分子化合物結(jié)構(gòu)研究的先進(jìn)技術(shù)，目前主要有核磁共振波譜(NMR)、X射線(xiàn)衍射(XRD)、掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)等等，但是這些技術(shù)的操作條件苛刻或樣品制備過(guò)程復(fù)雜，并不利于天然高分子化合物在生理狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)表征。原子力顯微鏡(AFM)是掃描探針顯微鏡(SPM)的一種，可在固體狀態(tài)下或溶液中通過(guò)探針與樣品表面作用力的監(jiān)測(cè)進(jìn)行樣品表面形態(tài)、分子結(jié)構(gòu)的分析。20世紀(jì)80年代后期，AFM開(kāi)始應(yīng)用于生物學(xué)中測(cè)定蛋白質(zhì)、磷質(zhì)生物膜和DNA等大分子的形態(tài)特征[2-4]，發(fā)展至今，AFM已可以將天然大分子生理狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)研究推進(jìn)到一個(gè)動(dòng)態(tài)的納米水平。AFM的這些發(fā)展，無(wú)疑為致力于纖維的微觀結(jié)構(gòu)研究的學(xué)者們提供了一種更為簡(jiǎn)潔有效的分析工具。由于植物化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，AFM在纖維素方面的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它生物材料。本文對(duì)AFM工作原理、天然纖維素和細(xì)胞壁纖維素在AFM下的形態(tài)，以及纖維素應(yīng)用研究中AFM的作用進(jìn)行總結(jié)，以期為AFM應(yīng)用于纖維素的研究，進(jìn)一步高效開(kāi)發(fā)、合理利用纖維素提供充實(shí)的理論依據(jù)。

1 原子力顯微鏡(AFM)工作原理

原子力顯微鏡(AFM)是表面成像技術(shù)中重要的進(jìn)展之一，其工作原理如圖1所示[5]。AFM通過(guò)光柵掃描帶有微小探針的彈性懸臂來(lái)獲得信息。探針針尖原子與樣品表面原子的相互作用力使懸臂產(chǎn)生偏差，并被光學(xué)檢測(cè)器記錄成像，但這個(gè)垂直偏差最大只有6 nm,超過(guò)這個(gè)范圍則不能使用AFM成像。

圖1 AFM原理圖[5]Fig.1 General principle of AFM[5]

根據(jù)樣品與探針的接觸情況，AFM的工作模式分為：接觸式、非接觸式和敲擊式等,其中接觸式應(yīng)用最為廣泛。在接觸模式下，樣品表面的形態(tài)特征可以采用2種掃描方式來(lái)構(gòu)建，恒高式即恒定高度下樣品以表面與探針相互作用力的變化來(lái)表征樣品表面形態(tài);恒力式即在恒定壓力下以樣品與探針之間的距離變化來(lái)表征樣品的表面形態(tài)。在成像過(guò)程中，檢測(cè)器與探針之間一直保持著連接，因此具有較高的分辨率，但會(huì)引起探針的磨損、污染以及低彈性樣品表面劃痕，同時(shí)還會(huì)由于環(huán)境中的水分在樣品和探針之間形成毛細(xì)力，引起粘合力的明顯提高而影響成像效果，甚至對(duì)軟性生物大分子造成損壞。流動(dòng)池的發(fā)明解決了環(huán)境中水分對(duì)成像效果的影響，使AFM在生物學(xué)上的應(yīng)用得到了突破。通過(guò)使用流動(dòng)池，可以在有水環(huán)境，或者模擬的生理環(huán)境中對(duì)生物分子進(jìn)行AFM檢測(cè)，同時(shí)還能通過(guò)改變鹽的濃度來(lái)研究其對(duì)構(gòu)象遷移產(chǎn)生的影響。

AFM的另一大重要突破就是非接觸模式的應(yīng)用，此項(xiàng)技術(shù)在高分子聚合物和生物大分子的結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)用廣泛。在非接觸模式下，探針始終保持在樣品上方，兩者之間的作用力為范德華力，遠(yuǎn)小于接觸模式下的排斥力，因此具有更高的靈敏度，但分辨率較低，且不適用于液體環(huán)境成像[6]。在敲擊模式和磁振蕩模式下，懸臂在掃描樣品的同時(shí)垂直振蕩，使探針與樣品間歇性地接觸，并記錄產(chǎn)生的摩擦力和橫向力，測(cè)量多糖分子或生物分子時(shí)，即使產(chǎn)生的力很小，也能被記錄并用于成像。此外，AFM通過(guò)探針的受力(樣品表面的范德華力、靜電力、氫鍵作用力和分子剪切力等)與位移的關(guān)系，還可以為樣品提供大量的物理性能參數(shù)[7]，如黏彈性、表面張力、電勢(shì)電位等，這些性能參數(shù)為天然高分子在更多領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可靠的理論依據(jù)。

雖然AFM在一些方面還存在著缺陷，如尖銳的探針在使用的過(guò)程中變鈍而影響其靈敏度須經(jīng)常更換；尖銳探針的固有寬度會(huì)產(chǎn)生“擴(kuò)展效應(yīng)”，使小于針尖物質(zhì)的測(cè)量值偏大[8]；測(cè)量一些黏度較大的物質(zhì)時(shí)，易引發(fā)針尖的污染而影響成像質(zhì)量，但AFM是基于原子之間的相互作用力而成像，這就使得操作條件能夠不受環(huán)境限制，同時(shí)也降低了對(duì)樣品的要求。而且，通過(guò)AFM可以得到皮牛頓級(jí)分辨率的作用力信息，以及納米級(jí)分辨率的圖像信息，能夠?yàn)楦鞣N化合物尤其是大分子的結(jié)構(gòu)形態(tài)研究提供可靠的依據(jù)。

2 AFM在纖維素研究中的應(yīng)用

2.1 天然纖維素

2.1.1 纖維素大分子結(jié)構(gòu) 纖維素是D-葡萄糖分子通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成的聚合物，由不同聚合度的分子組成，大量的羥基在分子間、分子內(nèi)形成復(fù)雜的氫鍵連接使纖維素聚集成為結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)的交錯(cuò)結(jié)合體系。天然纖維素的結(jié)晶格子常被稱(chēng)為纖維素I，每個(gè)結(jié)晶區(qū)(微晶體)長(zhǎng)度約100～200 nm。在天然纖維素的結(jié)晶區(qū)中存在著兩種形態(tài)，即：?jiǎn)涡本?Iβ)和三斜晶系(Iα)，其分子內(nèi)、分子間氫鍵的連接模式如圖2所示[9-10]。

圖2 Iα和Iβ纖維素分子內(nèi)和分子間的氫鍵連接模式[9-10]Fig.2 Hydrogen-bonding patterns in cellulose Iα and Iβ[9-10]

1998年，Baker等[11]利用AFM掃描結(jié)晶纖維素發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是Iα纖維素還是Iβ纖維素，真正的重復(fù)單元都是纖維二糖而并非葡萄糖。在整個(gè)結(jié)晶區(qū)內(nèi)，單斜晶系和三斜晶系緊密相聯(lián)，在排列上有1/4個(gè)重復(fù)單元的錯(cuò)位，如圖3所示。經(jīng)過(guò)熱處理后，熱亞穩(wěn)型的三斜晶系可以轉(zhuǎn)化成為穩(wěn)定的單斜晶系[12-13]。此外，由于纖維素本身含有極性羥基使其表面帶有負(fù)電荷，因此AFM觀測(cè)時(shí)所選用的基體表面的電荷性質(zhì)對(duì)纖維素在AFM下的形態(tài)也有著重要的影響。在基體帶有陽(yáng)離子時(shí)，纖維素舒展地附著于表面；當(dāng)基體表面帶有負(fù)電荷時(shí)，纖維素則會(huì)形成緊湊的球形結(jié)構(gòu)存在于表面[14]。

2.1.2 纖維素在植物細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu) 2006年，王小青等[15]詳細(xì)敘述了AFM在木材細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及木材表面形態(tài)與力學(xué)性質(zhì)研究中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)木材細(xì)胞中聚合物的排列方式對(duì)力學(xué)性能影響很大，其中微纖絲的排列方式引起了廣大研究人員的興趣。

圖3 AFM下的結(jié)晶纖維素表面形態(tài)[11]Fig.3 AFM topography images of the crystal cellulose[11]

圖4 典型的初生壁表面AFM成像[17]Fig.4 AFM image of the typical primary cell wall surface structure[17]

在自然界中，纖維素的分子鏈之間通過(guò)氫鍵連接組成原細(xì)纖維，原細(xì)纖維組成微細(xì)纖維，微細(xì)纖維組成細(xì)纖維，最后構(gòu)成了細(xì)胞壁中的纖維素。Yan等[8,16]發(fā)現(xiàn)在初生壁和次生壁的邊界區(qū)域，微纖維絲之間通過(guò)直徑約為5～10 nm的半纖維素分子聯(lián)接，形成一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，少量的木質(zhì)素也呈球形無(wú)規(guī)則地隨機(jī)分布于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上。Ding等[17]用AFM觀測(cè)到，雖然細(xì)胞壁中細(xì)纖維呈規(guī)整的平行排列，但大纖維則會(huì)分散排列在細(xì)胞壁表面，如圖4所示。此外，纖維素的結(jié)構(gòu)形態(tài)在不同種類(lèi)的植物或同一植物不同類(lèi)型細(xì)胞中也存在著很大的差異。Yu等[18]利用AFM成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)麥稈細(xì)胞中，由于生長(zhǎng)過(guò)程中表皮細(xì)胞對(duì)外界壓力抵抗有著重要作用，微纖維在表皮細(xì)胞的排列比薄壁細(xì)胞更為規(guī)則有序；在一些藻類(lèi)植物的纖維素中還存在著類(lèi)似于微纖維的扭曲結(jié)構(gòu)[19]。

2.2 纖維素的工業(yè)應(yīng)用

2.2.1 制漿造紙 造紙工業(yè)是纖維素應(yīng)用中的一個(gè)重要領(lǐng)域，AFM對(duì)制漿工藝的改善起著重要作用。AFM對(duì)各工段漿料纖維表面的觀測(cè)發(fā)現(xiàn)：高溫蒸煮使原料中大量物質(zhì)溶出并以薄層(主要成分為半纖維素、提取物、熔融木質(zhì)素)和顆粒(主要為未熔融木質(zhì)素)形式附著于纖維表面；經(jīng)漂白后纖維表面附著物含量降低，但殘留附著物的主要成分受漂白劑種類(lèi)的影響，過(guò)氧化氫和連二亞硫酸鹽影響半纖維素和提取物，而臭氧主要影響木質(zhì)素[20-24]。因此，AFM的應(yīng)用有助于制漿工藝的優(yōu)化和紙漿性能的提高。此外，AFM在紙張的性能研究中也起著重要作用。Coluzza等[25]利用AFM研究了老化處理和氧化處理對(duì)濾紙的影響，結(jié)果表明：雖然未經(jīng)處理的樣品和老化、氧化處理的樣品表面高度呈高斯分布，但老化、氧化處理后，纖維素聚合度降低，這為紙張的保存提供了有力的理論依據(jù)。

2.2.2 纖維素材料 隨著科技的發(fā)展，纖維素的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，改性技術(shù)也越來(lái)越成熟。經(jīng)處理、改性后可制成各種基于纖維素的材料，如酯化纖維素、羧甲基纖維素、納米纖維素和纖維素膜等。AFM液體環(huán)境中成像的優(yōu)勢(shì)，使學(xué)者能夠探尋纖維素基材料制備過(guò)程中的反應(yīng)歷程及機(jī)理。Cetin等[26]利用AFM監(jiān)測(cè)碳酸鉀催化棉毛纖維與醋酸乙烯的反應(yīng)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，最初只有表面的纖維素羥基被改性，而隨著時(shí)間的增加，結(jié)晶區(qū)的纖維素才會(huì)發(fā)生反應(yīng)，最后生成具有小尺寸和低結(jié)晶度的纖維素材料，且在四氫呋喃中有很好的穩(wěn)定性。為了提高纖維素的反應(yīng)速度和效率，不少學(xué)者嘗試將纖維素溶解再生破壞結(jié)晶結(jié)構(gòu)后再進(jìn)行改性利用，在溶解再生過(guò)程中，通過(guò)AFM可觀察到隨著結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化，纖維素形態(tài)也發(fā)生了巨大變化，且不同的溶劑體系對(duì)纖維形態(tài)的影響也不盡相同。Yan和Liang等利用AFM技術(shù)研究纖維素在氫氧化鈉/硫脲體系中溶解時(shí)發(fā)現(xiàn)[27-28]，隨著氫氧化鈉與纖維素羥基之間的不斷反應(yīng)，纖維素被潤(rùn)脹，然后分離成許多微纖絲或者納米纖維的碎片，最后溶解于體系中，結(jié)合掃描電鏡和元素分析發(fā)現(xiàn)，在這個(gè)過(guò)程中氫氧化鈉分子深入到了纖維素聚合物的中心，而硫脲則更多地分布在纖維素表面。Yan等[29]還發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用氯化鋰/N,N-二甲基乙酰胺體系溶解纖維素時(shí)，纖維素在溶液中呈現(xiàn)出具有流蘇的膠體狀結(jié)構(gòu)，隨著溶劑的蒸發(fā)聚合物濃度增加，膠狀結(jié)構(gòu)聚集成為不規(guī)則的碎片結(jié)構(gòu)。

基于纖維素的膜材料是纖維素應(yīng)用的另一個(gè)重要領(lǐng)域。在膜的制備過(guò)程和性能檢測(cè)中，Tabe-Mohammadi和Liu利用AFM發(fā)現(xiàn)[30-31]溶劑的性質(zhì)和聚合物的濃度對(duì)生成的醋酸纖維素膜表面結(jié)構(gòu)有重要影響,必須選擇具有合適沸點(diǎn)的溶液才能既保證聚合物形成穩(wěn)定濃厚的膜結(jié)構(gòu)，又能使溶劑完全揮發(fā)，而聚合物的濃度則決定膜的厚度和微孔膜的孔徑等，同時(shí)也就決定了膜的通量和選擇性。然而，AFM成像范圍小，且掃描速度慢，容易產(chǎn)生膜材料表面形態(tài)的熱漂移，這在一定程度上限制了AFM在膜材料中的深入應(yīng)用。

納米材料的優(yōu)良性能吸引了眾多學(xué)者的眼球，納米纖維素更是憑借其卓越的機(jī)械性能、化學(xué)性質(zhì)以及生物可降解性被稱(chēng)為“綠色”納米材料，其表面大量的羥基也為各種功能基團(tuán)的引入提供了良好的條件。Lahiji等[32]利用AFM在跳躍模式下對(duì)木材纖維素的單個(gè)納米微晶結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)形態(tài)、黏性、彈性以及硬度進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：每個(gè)纖維素納米微晶體縱向各點(diǎn)的硬度和黏度一致。Aulin等[33]還通過(guò)AFM發(fā)現(xiàn)在電荷穩(wěn)定的纖維素凝膠溶液中，陰離子纖維素和陽(yáng)離子纖維素的微纖絲能通過(guò)靜電力和空間排斥力的協(xié)同作用分層堆積自組裝形成薄膜(見(jiàn)圖5),根據(jù)體系中微晶纖維素的類(lèi)型，膜的黏性和厚度都有差異，自組裝形成的分層填積聚合物濃度越大，膜越厚。

圖5 云母表面納米纖維素多層結(jié)構(gòu)在敲擊模式下的高度圖和相位圖[33]Fig.5 Height and phase images of the multilayer films on silica under tapping mode of AFM[33]

此外，AFM探測(cè)結(jié)果表明：溶液性質(zhì)對(duì)纖維素的分子形態(tài)具有顯著影響。羧甲基纖維素在溶液中的螺旋狀結(jié)構(gòu)比在水中伸展得更長(zhǎng)；溶液中不同的陽(yáng)離子會(huì)使羧甲基纖維素呈現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)，如在Ni2+中為纖絲狀聚合物，在Na+中呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[34-35]。

3 結(jié) 語(yǔ)

纖維素是自然界存在最為廣泛的一種天然大分子，但纖維素大分子的應(yīng)用受到其復(fù)雜結(jié)構(gòu)的限制。AFM作為一個(gè)超微結(jié)構(gòu)分析工具，其應(yīng)用為纖維素的結(jié)構(gòu)研究提供了重要信息。AFM圖像信息顯示，纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜性不僅在于天然纖維素大分子存在非結(jié)晶區(qū)和結(jié)晶區(qū)兩種形態(tài)，結(jié)晶區(qū)內(nèi)還存在單斜晶系和三斜晶系。此外，在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中，半纖維素在微纖絲之間相互交連形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而木質(zhì)素則隨機(jī)分布在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，兩者一起將纖維素有效地包裹起來(lái)。目前，纖維素廣泛應(yīng)用于造紙、食品、材料等領(lǐng)域，在纖維素基化學(xué)品、材料研究中，AFM能夠?yàn)槠涔に噧?yōu)化、反應(yīng)機(jī)理探索、自組裝行為研究提供依據(jù)，AFM的應(yīng)用必將促進(jìn)纖維素的資源開(kāi)發(fā)。

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Application of Atomic Force Microscope in Cellulosic Ivestigation

YANG Haiyan1, ZHENG Zhifeng1, WANG Kun2, MA Jianfeng3, SHI Zhengjun1

(1.College of Material Engineering,Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2.College of Material Science and Technology,Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 3.International Centre for Bamboo and Rattan, Beijing 100102, China)

Atomic force microscope (AFM) plays an important role in the surface imaging technologies. The basic principle of AFM is the measurement of the force between a sharp tip and sample surface. In order to profile the structure characteristics of biopolymers, AFM can work under contact mode, non-contact mode and tapping mode, respectively. High-resolution images of cellulose from AFM show that cellobiose is the repeat unit of cellulose, and triclinic and monoclinic crystal systems naturally exist in the same microfibril of cellulose with a displacement of adjacent chains by a quarter of cellobiose units. In cell wall, fibers contact with each other by hemicelluloses to form a network. However, the structure of fiber ranges with variety of plants and cell wall region. Furthermore, AFM promotes the application research on cellulose. The results from AFM images are important for improving of pulp properties, paper conservation, and exploration of reaction mechanism.

atomic force microscope; cellulose; cell wall; structure; application

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.01.002

2016- 06-17

云南省科技廳基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目(2015FD023)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31260165,31560195)

楊海艷 (1986— ),女,重慶人，講師,博士，主要從事生物質(zhì)資源化利用方面的研究

*通訊作者：史正軍，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物資源化利用方面的研究工作;E-mail：shizhengjun1979@163.com。

TQ35

A

0253-2417(2017)01- 0014- 07

楊海艷,鄭志鋒，王堃,等.原子力顯微鏡在纖維素研究中的應(yīng)用[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2017，37(1)：14-20.