蔣維++皮玉東++孔玉珊++秦王閣閣++劉士平++薛艷紅

摘要：以三峽河岸帶植物秋華柳（Salix variegata）為研究對(duì)象，分離了其在淹水脅迫前后不同部位的內(nèi)生細(xì)菌，在測(cè)定其總抗氧化能力的基礎(chǔ)上，對(duì)部分具高抗氧化能力的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了生物學(xué)鑒定。結(jié)果共分離獲得105株內(nèi)生細(xì)菌，其中淹水前共分離54株，淹水后共分離51株。分析表明秋華柳內(nèi)生細(xì)菌的多樣性程度較高，無明顯組織偏愛性，而且其豐富度和多樣性不會(huì)顯著受淹水脅迫影響?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，72 h是測(cè)定秋華柳內(nèi)生細(xì)菌總抗氧化能力的最佳時(shí)間，淹水脅迫后的內(nèi)生細(xì)菌抗氧化能力強(qiáng)，根部的內(nèi)生細(xì)菌抗氧化能力強(qiáng)。篩選出2株具強(qiáng)抗氧化能力的內(nèi)生細(xì)菌sar3和sar4，其發(fā)酵液的抗氧化值達(dá)到40 U/mL， 生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，這2株菌都是耐寒短桿菌（Brevibacterium frigoritolerans）。

關(guān)鍵詞：淹水脅迫；秋華柳（Salix variegata）；內(nèi)生細(xì)菌；抗氧化能力

中圖分類號(hào)：Q945.78；Q949.733 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）01-0083-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.021

The Effects of Flooding Stress on Antioxidant Capacity of

Endophytic Bacteria from Salix variegata

JIANG Wei， PI Yu-dong， KONG Yu-shan， QIN Wang-ge-ge， LIU Shi-ping， XUE Yan-hong

（College of Life Science and Pharmacy， Three Gorges University， Yichang 443002， Hubei， China）

Abstract： This experiment focused on the Salix variegata plants living in three gorges riparian zone. We isolated the endophytic bacteria from various tissues before and after flooding stress， and performed biological assay based on the total antioxidant capacity analysis. Totally， 105 endophytic bacteria were acquired， involving 54 before flooding and 51 after flooding. These bacteria showed high biodiversity and no obvious tissue preference. Furthermore， bacteria diversity and abundance would be almost unaffected by flooding. According to the antioxidant results， 72 hours maybe the best time to determine the activity. After flooding the total antioxidant capacity of the endophytic bacteria was much higher， and so did the bacteria from roots. sar3 and sar4 were screened for the potent antioxidant capacity， since the maximal value got nearly to 40 U/mL. Biological discern indicated that both be Brevibacterium frigoritolerans.

Key words： flooding stress； Salix variegata； endophytic bacteria； antioxidant capacity

秋華柳（Salix variegata）是一種楊柳科柳屬多年生植物，主要分布在中國(guó)云、貴、川、藏及長(zhǎng)江中上游的溪流與河谷的岸坡地上，是三峽庫區(qū)消落帶的一種優(yōu)勢(shì)灌木[1]。由于其根系非常發(fā)達(dá)，可長(zhǎng)時(shí)間忍受淹水脅迫，故秋華柳對(duì)水土保持有重要作用，是一種優(yōu)良的護(hù)堤、護(hù)岸樹種，也是庫區(qū)消落帶植被恢復(fù)與重建的主要物種之一[2]。大部分植物在水淹條件下由于供氧量減少，被迫進(jìn)行不完全氧化，將會(huì)導(dǎo)致OH-、O2-等氧化自由基的積累，從而引起膜脂發(fā)生過氧化，致使生長(zhǎng)發(fā)育受阻[3]?？墒乔锶A柳在長(zhǎng)江流域每年要承受4～6個(gè)月的淹水脅迫，長(zhǎng)期的低氧環(huán)境使其進(jìn)化出極強(qiáng)的抗氧化能力[1，2]。

近年來研究表明，許多高等植物的內(nèi)生菌可幫助宿主應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫環(huán)境，如病蟲害、干旱、高溫、低營(yíng)養(yǎng)和高鹽脅迫等[4，5]。特別是處于特殊生境下的植物，其體內(nèi)的內(nèi)生菌在協(xié)助寄主度過脅迫期中發(fā)揮著重要作用，如從海洋植物紅樹林中分離的內(nèi)生菌，可提高植物對(duì)鹽堿的抵抗能力[6]；從沙漠地區(qū)麻黃中分離的內(nèi)生菌Chaetomium chiversii，可顯著提高擬南芥對(duì)高溫和干旱的耐受能力[7]。此外，內(nèi)生菌還可提高宿主植物對(duì)氧化脅迫的抵抗能力，增強(qiáng)對(duì)逆境的適應(yīng)性[8，9]。Huang等[8]從29種傳統(tǒng)中草藥中分離出了292種不同形態(tài)類型的內(nèi)生真菌，65%以上的內(nèi)生真菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)室從同是三峽河岸帶植物的疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）中分離到163株內(nèi)生真菌，大多數(shù)都顯示出較強(qiáng)的抗氧化能力[9]。

為了探討秋華柳的內(nèi)生細(xì)菌是否也具有抗氧化能力，在秋華柳水淹脅迫前后共分離了105株內(nèi)生細(xì)菌，在分析其分布規(guī)律后，利用總抗氧化試劑盒分析了其在胞外的抗氧化能力，并將一些代表性菌株進(jìn)行了生物學(xué)鑒定，研究結(jié)果一方面為探究?jī)?nèi)生細(xì)菌協(xié)助秋華柳抗氧化脅迫的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，另一方面對(duì)新型抗氧化劑的篩選與研發(fā)有一定的積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料

秋華柳采集自湖北宜昌胭脂壩；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，加水至1 000 mL，調(diào)pH至7.2～7.4；次氯酸鈉溶液（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；液氮（宜昌藍(lán)天氣體有限公司）；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細(xì)菌Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；引物 F8和R1492（生工生物工程（上海）股份有限公司）；dNTP、10×PCR buffer、ExTaq酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）；T-AOC試劑盒（南京建成生工生物科技有限公司）。

潔凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、PH-030A型培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、MyCycler PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司）、GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）、DYCP-31DN型水平電泳儀（北京市六一儀器廠）、UV752N紫外可見分光光度計(jì)（海佑科儀器儀表有限公司）、CH-AS恒溫振蕩器（國(guó)華電器有限公司）。

1.2 秋華柳內(nèi)生細(xì)菌的分離

2014年5月和10月，在長(zhǎng)江湖北宜昌段的胭脂壩，分別對(duì)淹水前（5月）和淹水后（10月）健康秋華柳植株的根、莖、葉取樣，共取15株樣品，每株間隔30 m以上。將樣品用洗潔精和清水洗凈后短時(shí)在4 ℃冰箱保存。

取淹水脅迫前后秋華柳植株的葉、根、莖各組織，切成0.5 cm×0.5 cm大小的塊，先用75%乙醇漂洗60 s，然后用無菌水沖洗5次，再用3%的次氯酸鈉漂洗60 s，最后再用無菌水沖洗5次。將最后一次漂洗材料用過的無菌水涂布于LB平板上，37 ℃培養(yǎng)2 d，觀察有無菌落生長(zhǎng)，確保所分離的內(nèi)生細(xì)菌不是來自于樣品表面[10]。

經(jīng)表面消毒后的組織塊接種于固體LB培養(yǎng)基中，每個(gè)平皿接種4個(gè)組織塊，5次重復(fù)，37 ℃靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)1～2 d后，挑取植物組織周圍的菌落轉(zhuǎn)接入LB斜面上，經(jīng)純化后即得內(nèi)生細(xì)菌。根據(jù)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落形態(tài)、大小、顏色等特征挑取不同的單菌落，再利用平板劃線法進(jìn)行純化，得到的單菌落用甘油于-86 ℃保存。

將純化的菌株接種到培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)1～2 d后，觀察菌落大小、顏色、邊緣、質(zhì)地、滲出物等指標(biāo)，并進(jìn)行革蘭氏染色和顯微形態(tài)觀察。

1.3 菌株發(fā)酵液的總抗氧化性測(cè)定

將菌株用LB液體培養(yǎng)基活化，然后將發(fā)酵菌懸液先用紗布過濾，濾液10 000 r/min離心10 min，將所獲得的上清液按照T-AOC總抗氧化試劑盒介紹的方法反應(yīng)后在520 nm處測(cè)定吸光值，3次重復(fù)[9]；以空白培養(yǎng)基作對(duì)照。

總抗氧化活力計(jì)算公式：

T-AOC（U/mL）=■

式中，ODU為測(cè)定管吸光度值，ODC為對(duì)照管吸光度值，N為反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（反應(yīng)液總體積/取樣量），n為樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

為確定菌株的最佳抗氧化時(shí)間，隨機(jī)選取秋華柳淹水前后來自根、莖、葉不同部位的4株菌，每24 h測(cè)定一次總抗氧化能力。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)鑒定

依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）[11]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]進(jìn)行生理生化指標(biāo)的檢測(cè)。將形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)與16S rDNA測(cè)序同時(shí)進(jìn)行。將內(nèi)生細(xì)菌活化培養(yǎng)后，按照細(xì)菌基因組DNA試劑盒介紹的方法提取總DNA，然后以總DNA為模板，以F8：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R1492：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為引物擴(kuò)增其16S rDNA序列[13]。反應(yīng)體系共20 μL：模板DNA 1.0 μL，正向引物（20 pmol/L） 1.0 μL，反向引物（20 pmol/L）1.0 μL，dNTP mixture 2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，10×Buffer 2 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存[13]。

將擴(kuò)增獲得的DNA片段用PCR純化試劑盒回收，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，重復(fù)2次，然后在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，用MAGE 5.0軟件做系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋華柳淹水前后不同部位內(nèi)生細(xì)菌的分布

經(jīng)過平板劃線法對(duì)秋華柳淹水前后不同部位的內(nèi)生細(xì)菌分離、純化后，共獲得105株內(nèi)生細(xì)菌（圖1）。淹水前共分離得到54株，其中19株來自于根，21株來自于莖，14株從葉中分離獲得。在淹水后的秋華柳中共分離得到51株內(nèi)生細(xì)菌，其中根19株，莖15株，葉17株。結(jié)果表明秋華柳在淹水前后內(nèi)生細(xì)菌的總量變化不大，說明淹水脅迫對(duì)秋華柳內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量影響不明顯。此外，秋華柳根、莖、葉各個(gè)器官中都含有內(nèi)生細(xì)菌，分布比較均勻，說明秋華柳的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)組織的偏愛性不強(qiáng)。

2.2 淹水前后內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征

根據(jù)細(xì)菌分類指導(dǎo)手冊(cè)[11，12]，按照菌落濕度、菌落顏色、革蘭氏染色和顯微形態(tài)等指標(biāo)（圖2），可將淹水前后秋華柳分離的105株內(nèi)生細(xì)菌劃歸為16類（表1），初步表明秋華柳內(nèi)生細(xì)菌的多樣性程度較高。

從表1可以看出，秋華柳的內(nèi)生細(xì)菌主要集中在菌落表面濕潤(rùn)呈黃色的這一類中，有44株，占總數(shù)的41.90%；其次是菌落表面干燥呈白色的一類，有22株，占總數(shù)的20.95%。說明這兩類細(xì)菌在秋華柳組織內(nèi)為優(yōu)勢(shì)菌株，對(duì)其內(nèi)生環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性。淹水前的秋華柳分離得到14類內(nèi)生細(xì)菌，淹水后得到12類，說明大多數(shù)種類的內(nèi)生細(xì)菌在淹水前后都存在，而且從整個(gè)數(shù)量來說也變化不大，表明淹水脅迫對(duì)秋華柳內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和豐富性的影響可能不大。

不管是淹水脅迫前還是淹水脅迫后，秋華柳內(nèi)生細(xì)菌中革蘭氏陽性菌都比革蘭氏陰性菌多（圖3）。淹水前革蘭氏陽性菌33株，革蘭氏陰性菌21株；淹水后革蘭氏陽性菌29株，革蘭氏陰性菌22株。革蘭氏陽性菌可能比革蘭氏陰性菌對(duì)淹水脅迫敏感一些，因?yàn)檠退蟾锾m氏陰性菌的數(shù)量幾乎沒有變化，而陽性菌減少了4株，但是淹水脅迫本身不會(huì)很大程度上改變革蘭氏陽性菌或陰性菌的分布。

2.3 淹水前后內(nèi)生細(xì)菌的抗氧化能力分析

為了測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌的總抗氧化能力大小，先隨機(jī)挑選了4株菌sbr2、sbr3、sbl3和sas5，根據(jù)不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液的抗氧化能力來判斷其最佳發(fā)酵時(shí)間（圖4）。結(jié)果表明，不同內(nèi)生細(xì)菌的最佳抗氧化時(shí)間略有不同，但大致的最佳抗氧化時(shí)間表現(xiàn)出了一致性。72 h前總抗氧化性值隨時(shí)間而增大，72 h后總抗氧化性值隨時(shí)間變化而減小，故確定72 h為測(cè)定菌株的最佳抗氧化性時(shí)間。

將淹水前后秋華柳不同部位共105株內(nèi)生細(xì)菌，培養(yǎng)72 h后測(cè)定其發(fā)酵液的抗氧化能力（表2）。從表2可以看出，不同內(nèi)生細(xì)菌的抗氧化能力差異很大，但是都明顯高于對(duì)照（2.34 U/mL）。最高值來自淹水脅迫后根部篩選的1株菌，達(dá)到41.90 U/mL，遠(yuǎn)比文獻(xiàn)[10]報(bào)道的要高，說明秋華柳中的內(nèi)生細(xì)菌具有極強(qiáng)的抗氧化活力。

淹水前細(xì)菌的平均抗氧化性值為5.66 U/mL，淹水后細(xì)菌的平均抗氧化性值為6.34 U/mL（圖5）。而且不管是根、莖還是葉，淹水后秋華柳內(nèi)生細(xì)菌的抗氧化能力明顯高于淹水前，說明淹水脅迫將會(huì)影響秋華柳內(nèi)生細(xì)菌的抗氧化活性，誘導(dǎo)高抗氧化活性內(nèi)生細(xì)菌的出現(xiàn)。這一結(jié)果也表明秋華柳可能通過高抗氧化活性內(nèi)生細(xì)菌來應(yīng)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的淹水脅迫。

高抗氧化活性的細(xì)菌具有明顯的組織偏愛性。不管是在淹水前還是在淹水后，高抗氧化活性的內(nèi)生細(xì)菌都主要出現(xiàn)在秋華柳的根部，莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的抗氧化能力次之，葉部最小，說明根部?jī)?nèi)生細(xì)菌對(duì)秋華柳抗氧化活性的影響最大。

2.4 部分典型內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)鑒定

將2株高抗氧化活性的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生物學(xué)鑒定。形態(tài)觀察表明，sar3和sar4均可在LB固體培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)，sar3菌落呈淡黃色，菌落大小適中，邊緣整齊，表面細(xì)濕光滑，細(xì)菌桿狀，革蘭氏染色為陽性。sar4也呈淡黃色，邊緣呈暗紅色，菌落大而呈圓形，邊緣呈鋸齒狀，表面干燥且不光滑，細(xì)菌桿狀，革蘭氏染色亦為陽性。其生理生化指標(biāo)見表3。

3 小結(jié)

試驗(yàn)從三峽河岸帶植物秋華柳的根、莖和葉中共分離出105株內(nèi)生細(xì)菌，其中淹水前共分離得到54株，淹水后共分離得到51株。根據(jù)形態(tài)觀察，內(nèi)生細(xì)菌的多樣性程度較高，共可分為16類，且對(duì)組織的偏愛性不強(qiáng)。秋華柳內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和類型對(duì)淹水脅迫并不敏感，說明淹水脅迫不會(huì)顯著影響秋華柳內(nèi)生細(xì)菌的豐富度和多樣性。

72 h是測(cè)定秋華柳內(nèi)生細(xì)菌總抗氧化能力的最佳時(shí)間。淹水脅迫后的內(nèi)生細(xì)菌比淹水前具有更強(qiáng)的抗氧化能力，根部的內(nèi)生細(xì)菌較其他部位具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)分析和16S rDNA測(cè)序分析，對(duì)2株抗氧化能力最強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示它們都是耐寒短桿菌，是一類潛在的抗氧化劑資源。

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