孫曉霞，黃經(jīng)春，王鸞鸞，王昕，侯麗

國家食品藥品監(jiān)督管理局 濟南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心 山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室，山東 濟南250101

不同振蕩速率制備陽性對照在醫(yī)療器械生物學評價中的應用

孫曉霞，黃經(jīng)春，王鸞鸞，王昕，侯麗

國家食品藥品監(jiān)督管理局 濟南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心 山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室，山東 濟南250101

醫(yī)療器械生物學評價中試驗樣品制備的標準化是保證其試驗結果具有可靠性和可比性的關鍵。為了進一步明確樣品制備過程中振蕩速率對浸提液溶出物的影響，本研究以國際標準ISO10993-12: 2007中推薦的陽性標準物質(zhì)(SPU-ZDEC)為試驗樣品，檢測了不同振蕩速度下浸提液的細胞毒性。結果表明，醫(yī)療器械生物學實驗中不同的樣品振蕩速率對檢測結果具有顯著影響，本研究對于今后標準制定中規(guī)定樣品制備的標準化問題提供可靠的實驗依據(jù)，有著重要的參考意義。

二乙基二硫代氨基甲酸鋅；細胞毒性；振蕩速率；恒溫培養(yǎng)振蕩器；酶標儀

引言

醫(yī)療器械生物學評價中在進行試驗以及解釋試驗結果時，應考慮器械在人體應用時的接觸性質(zhì)、程度、頻率、時間和條件等因素，此外，還要關注的一個重要因素即：試驗樣品的制備。試驗樣品的選擇和制備標準化是保證生物學評價試驗結果可靠性和可比性的關鍵一步。ISO10993-12:2007中規(guī)定樣品浸提應在攪拌或環(huán)流的條件下進行，即采用動態(tài)方法進行浸提，但并未詳細規(guī)定動態(tài)浸提的具體方法和參數(shù)（如轉速，旋轉方式等）。在實際檢驗工作中，不同的動態(tài)參數(shù)會直接影響檢測結果。由于細胞毒性試驗是目前公認的一種鑒別篩選生物相容性材料良好性的最敏感的體外試驗方法，故本實驗室對ISO10993-12: 2007（即GBT16886.12: 2005）中推薦的陽性標準物質(zhì)（ZDEC）以不同振蕩速率浸提并通過系列稀釋進行體外細胞毒性檢測，試驗結果表明不同的振蕩浸提速率對細胞毒性結果具有顯著影響。本研究為今后醫(yī)療器械生物學試驗樣品制備的標準化及相應國際標準的修訂提供了試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

含有0.1%二乙基二硫代氨基甲酸鋅（SPU-ZDEC）的聚氨酯薄膜，購自Hatano Research Institute/Food and Drug Safty Center, Japan。

1.2 陰性對照

高密度聚乙烯，購自Hatano Research Institute/Food and Drug Safety Center, Japan。

1.3 溶劑對照

不含試驗材料的MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）。

1.4 試驗方法

1.4.1 試劑與細胞

MEM培養(yǎng)基：賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司，批號：NWE0403。

胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：100517。

細胞：小鼠成纖維細胞系L929（購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所）。

1.4.2 主要儀器

會上，常務副總經(jīng)理楊瑞生、副總經(jīng)理劉江濤、馬朝輝分別就集團公司2018年農(nóng)資經(jīng)營、房地產(chǎn)項目開發(fā)及資金運作情況進行了詳細介紹，對下一步工作進行了認真部署。

恒溫培養(yǎng)振蕩器3臺，規(guī)格型號：ZHWY-100B，上海智誠分析儀器制造有限公司。

酶標儀，規(guī)格型號：MK3，熱電（上海）儀器有限公司。

1.4.3 樣品浸提液的制備

放置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中，振蕩頻率設置為60、90、120 rpm，溫度為（37±1）℃，時間為（24±2） h。第4份放置于37恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)（24±2） h。同時，陰性對照和溶劑對照以同樣方式處理。浸提結束后，用對照溶劑將試驗樣品的浸提液分別稀釋成如下濃度梯度：2%、4%、6%、8%、10%，以進行體外細胞毒性試驗[1-2]。

1.4.4 試驗方法

按照ISO10993-5: 2009（GBT16886.12: 2003）醫(yī)療器械生物學評價體外細胞毒性試驗MTT法進行試驗[3-7]。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)ISO10993-5: 2009（GBT16886.12: 2003）醫(yī)療器械生物學評價體外細胞毒性試驗8.5細胞毒性測定部分，利用試驗樣品浸提液光密度平均值（OD570e）和溶劑對照組光密度平均值（OD570b），通過如下公式進行結果分析：

1.5 統(tǒng)計學分析

每組實驗至少重復3次，所有實驗結果都以平均值±標準差的形式展示。

2 結果

2.1 不同振蕩速度的ZDEC浸提液對細胞毒性試驗的影響

將培養(yǎng)24 h的L929細胞，棄去培養(yǎng)上清，分別加入制備的樣品浸提液、陰性對照及溶劑對照，每組6復孔，100μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新鮮含血清培養(yǎng)基，通過MTT摻入法檢測570 nm的吸光度（參照波長650 nm）。與溶劑對照組相比，當樣品制備的振蕩速度為0（即靜止浸提）時，隨著ZDEC浸提濃度的增加OD570/650數(shù)值改變不明顯，然而，經(jīng)過振蕩浸提后，隨著ZDEC浸提濃度的增加OD570/650數(shù)值顯著降低，說明振蕩后的ZDEC浸提物能夠抑制L929細胞增殖，且這種增殖抑制作用具有濃度依賴性（表1）。同時，試驗結果顯示：樣品制備時，ZDEC浸提濃度為2%、4%、6%時，60 rpm相比于靜止浸提液的OD570/650數(shù)值無明顯差異，隨著浸提濃度的增加（8%和10%）60 rpm浸提液的OD570/650數(shù)值明顯降低，但是仍大于90 rpm和120 rpm的OD數(shù)值；90 rpm相較于120 rpm浸提也得到了類似60 rpm和靜止浸提的變化，即120 rpm浸提液（8%和10%）的OD570/650數(shù)值明顯降低，其它濃度差異不明顯。此外，相較于溶劑對照組，陰性對照組的OD數(shù)值無顯著改變。

2.2 不同振蕩速度的ZDEC浸提液進行細胞毒性試驗的IC50值分析

同時，分析不同振蕩速度的ZDEC浸提液對細胞存活率的影響（圖1），也可以得到與表1相一致的結果。靜止浸提后，改變ZDEC浸提濃度不會影響細胞存活率；然而振蕩浸提后，隨著ZDEC浸提濃度的增加細胞的存活率越低，浸提液對細胞的增殖抑制效應越明顯。此外，在相同的ZDEC浸提濃度下，不同振蕩速率(60、90、120 rpm)對細胞的增殖抑制效應不明顯。通過各組細胞存活率所得到的抑制率，根據(jù)文獻中推薦的方法來計算相應的IC50值[8-10]，見圖2，也進一步證實上述試驗結果。

2.3 不同振蕩速度的ZDEC浸提液細胞毒性形態(tài)學分析

結合ISO 10993-5：2009 (GBT16886.12: 2003) 浸提液細胞毒性形態(tài)學定性分級，顯微鏡下顯示，浸提介質(zhì)對照組和陰性對照組的細胞形態(tài)良好，增殖明顯（圖3）。而試驗樣品浸提組，相同ZDEC濃度下，隨著振蕩速度的提高，L929細胞明顯皺縮，增殖被抑制，細胞毒性級別明顯增大。

表1 不同振蕩速度的ZDEC浸提液進行細胞毒性試驗對細胞OD值的影響

結合ISO 10993-5：2009 最新修訂草案[3]中規(guī)定的浸提液細胞毒性形態(tài)學定性分級，顯微鏡下顯示，浸提介質(zhì)對照組(Cell-blank)和陰性對照組(Cell-NC)的細胞形態(tài)良好、增殖明顯，細胞毒性為0級（圖3）。而試驗樣品組，靜止浸提時各組細胞生長良好、增殖明顯，無毒性反應（細胞毒性為0級）；同時，振蕩浸提組，濃度為2%和4%的細胞毒性亦為0級，60 rpm浸提時6%浸提液稀釋組＜20%的細胞圓縮死亡，顯示輕微毒性反應(細胞毒性為1級)，90 rpm和120 rpm浸提時6%浸提液稀釋組的死亡細胞明顯增多，胞漿內(nèi)顆粒增多(細胞毒性為2級)，除此之外的60、90、120 rpm其余浸提液稀釋組(8%和10%)均顯示明顯的細胞皺縮、增殖抑制現(xiàn)象，顯示為重度毒性反應，細胞毒性均為4級。

圖1 不同振蕩速度的ZDEC浸提液對細胞存活率的影響

圖2 不同振蕩速度的ZDEC浸提液進行細胞毒性試驗的IC50值分析

圖3 顯微鏡觀察ZDEC浸提液的細胞毒性

3 討論

在醫(yī)療器械生物學試驗過程中，標準化的試驗樣品制備是保證生物學評價試驗結果具備可靠性和可比性的關鍵。在ISO10993-12:2007 (GBT16886.12: 2005) 中規(guī)定，浸提是模擬器械正常使用過程中通過評價可瀝濾材料對病人和使用者的一種模擬產(chǎn)品適用條件的處理方法。浸提是一個復雜的過程，受時間、溫度、表面積與體積比、浸提介質(zhì)以及材料的相平衡的影響。人體在使用醫(yī)療器械以達到臨床診斷/治療的過程中，機體(或血液)的運動會導致該器械在體內(nèi)的代謝及其毒性作用發(fā)生改變，因此，不能采用靜息浸提的方式來評價醫(yī)療器械的細胞毒作用。盡管，ISO10993-12:2007 (GBT16886.12: 2005) 中10.3.6規(guī)定樣品浸提應在攪拌或環(huán)流的條件下進行，但并未詳細規(guī)定動態(tài)浸提的具體方法和參數(shù)（如轉速，旋轉方式等）。然而，對于醫(yī)療器械的檢測，統(tǒng)一的計量單位、標準化的測量或檢測方法是實現(xiàn)正確測量的必要條件。本文以ISO10993-12:2007 中推薦的陽性標準物質(zhì)(SPU-ZDEC)為實驗材料，以不同振蕩速率浸提該實驗材料，通過檢測各浸提液的細胞毒性，分析水平振蕩浸提的振蕩速率對SPU-ZDEC的可瀝濾物及其細胞毒作用的影響，以探討樣品制備過程中的不同振蕩速率對評價醫(yī)療器械引起細胞毒性反應的意義。

體外細胞毒性試驗廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評價，其目的是評價醫(yī)療器械引起細胞毒性反應的潛在可能性，這種方法不僅可以快速、靈敏、有效地對供試品的體外細胞生物學行為作出判斷，而且還有助于對一種醫(yī)療器械是否有必要采用昂貴的體內(nèi)實驗作出科學的判定。本研究中選用國際通用的陽性標準物質(zhì)(SPU-ZDEC)作為研究對象，通過不同振蕩速率浸提后，用MTT摻入法檢測各浸提液的細胞毒性。按照ISO10993-5: 2009 (GBT16886.12: 2003)，由于含血清的細胞培養(yǎng)基既能支持細胞生長，又能做為極性和非極性浸提介質(zhì)，故在本次研究中，我們選擇含血清的細胞培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)。根據(jù)ISO10993-12:2007 (GBT16886.12: 2005)中的樣品制備原則，按0.1 g/mL浸提比例進行制備，選擇適用于細胞毒性試驗的（37±1）℃，（24±2）℃條件，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中完成振蕩浸提。實驗結果顯示，振蕩浸提能增加SPU-ZDEC的細胞毒性，60 rpm浸提時的細胞毒性明顯大于靜止浸提而小于90 rpm浸提，并且120 rpm浸提時的細胞毒性大于90 rpm浸提但增加毒性作用不明顯。這一結果提示，在進行細胞毒性試驗的樣品制備時，不僅要看試驗樣品的材料、特性，與人體的接觸程度和接觸時間，樣品制備的時間和溫度，還要考慮樣品制備過程中振蕩速率這一重要因素。本文通過水平振蕩的方式觀察振蕩浸提對細胞毒性的影響，此外對于其它的環(huán)流或攪拌等動態(tài)浸提方式而引起的細胞毒作用有待進一步實驗解決。

IC50值是指細胞活性抑制50%時抑制劑的濃度，也有學者將其用于醫(yī)療器械細胞毒性試驗中標準參照材料的選擇[11-13]。本研究中，我們通過細胞毒性試驗中細胞存活率所得到的抑制率，計算了不同振蕩速度的SPU-ZDEC浸提液的IC50值，60 rpm浸提的IC50值為10.45%，90 rpm浸提的IC50值為7.47%，120 rpm浸提的IC50值為6.73%（圖2）。此外，通過顯微鏡下觀察不同振蕩速度浸提液的細胞毒性（圖3）。結果表明，定量分級評價與定性評價之間具有良好的相關性。然而，IC50值一般用于評價單一化合物的細胞毒性反應，醫(yī)療器械浸提液多為混合物，因此需要對其適用性進行驗證[14-16]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，振蕩浸提有助于醫(yī)療器械和材料中潛在的毒性成分釋放發(fā)揮細胞毒作用，浸提過程中增加振蕩速率會增強材料的細胞毒作用，這一結果為今后標準制定中規(guī)定樣品制備的標準化問題提供可靠的實驗依據(jù)，有著重要的參考意義。

[1] ISO10993-12-2007,Biological evaluation of medical devices-Part 12: Sample preparation and reference materials[S].

[2] GB/T16886-12-2005,醫(yī)療器械生物學評價-第12部分:樣品制備與參照樣品[S].

[3] ISO10993-5-2009.Biological evaluation of medical devices-Part 5:Tests for in vitro cytotoxicity[S].

[4] GB/T 16886-5-2003.醫(yī)療器械生物學評價-第5部分:體外細胞毒性試驗[S].

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本文編輯 蘇欣

Preparation of Positive Control with Different Oscillation Rate in the Application of Medical Devices Biological Evaluation

SUN Xiao-xia, HUANG Jing-chun, WANG Luan-luan, WANG Xin, HOU Li
Key Lab of Biological Evaluation of Medical Devices of Shandong Province, Jinan Quality Supervision and Inspection Center for Medical Devices, State Food and Drug Administration, Jinan Shandong 250101, China

Standardization of test sample preparation is key to ensuring a reliable and comparable test results in biological evaluation of medical devices. In order to further clarify the effect of oscillation rate during soluble material extraction, we tested the positive standard material of SPU-ZDEC recommended by ISO10993-12: 2007 and detected the cytotoxicity of extract with different oscillation rate. Results showed that different sample oscillation rates have significant impacts on test results in biological tests of medical devices. This study provided a reliable experimental basis for the standardization of sample preparation, which is of great reference meaning.

SPU-ZDEC; cytotoxicity; oscillation rate; constant shaking incubator; microplate reader

R197.39

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.02.002

1674-1633(2017)02-0005-04

2016-11-10

山東省自然科學基金青年基金項目（ZR2014CQ041）；國家重點研發(fā)計劃課題（2016YFC1103202；2016YFC1103205）。

王瑾曄，教授。

通訊作者郵箱：jinyewang@sjtu.edu.cn