楊良權(quán)，婁歡歡，周東光，李明雷

(1.河北省秦皇島市婦幼保健院乳腺科，河北 秦皇島 066000；2.河北省秦皇島市開發(fā)區(qū)醫(yī)院外科，河北 秦皇島 066004)

·論 著·

不同分子分型乳腺癌新輔助化療對TopⅡα蛋白表達的影響

楊良權(quán)1，婁歡歡2，周東光1，李明雷1

(1.河北省秦皇島市婦幼保健院乳腺科，河北 秦皇島 066000；2.河北省秦皇島市開發(fā)區(qū)醫(yī)院外科，河北 秦皇島 066004)

目的探討不同分子分型乳腺癌新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NAC)對TOPⅡα蛋白表達的影響。方法選取114例經(jīng)NAC前后的乳腺癌患者病理標本，采用免疫組織化學方法檢測其TOPⅡα蛋白表達的變化，并觀察療效。結(jié)果141例浸潤性乳腺癌標本中，在病理學Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級間TopⅡα陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。化療反應有效者TopⅡα陽性率高于無效者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而不同年齡、是否有家族史、是否絕經(jīng)、腫瘤大小、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者TopⅡα表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。141例乳腺癌患者分為Luminal A型、Luminal B1型、Luminal B2型、HER-2表達型、三陰性5型，NAC前三陰性TopⅡα表達陽性率高于Luminal A型(P<0.05)，NAC后各型之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 NAC后Luminal B2型和HER-2表達型TopⅡα表達陽性率低于NAC前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論TopⅡα能客觀反映乳腺癌的增殖活性，可作為判斷乳癌患者預后及指導化療的有效指標。

乳腺腫瘤；新輔助化療；DNA拓撲異構(gòu)酶類，Ⅱ型

近年來，我國乳腺癌發(fā)病率逐年升高，尤其在發(fā)達城市的發(fā)病率已超過宮頸癌，成為了女性惡性腫瘤的第一大疾病，化療是控制其復發(fā)轉(zhuǎn)移的主要手段之一，而新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NAC)通過抗癌藥可有效調(diào)控癌細胞的生命活動，對癌細胞的增殖、分化具有較高的抑制作用[1]，目的是降低腫瘤分期、提高手術(shù)的切除率和保乳率，并且可以了解新輔助藥物的敏感性，減少耐藥細胞出現(xiàn)，如能達到病理完全緩解則可有較好的生存獲益。影響乳腺癌NAC療效的重要原因是腫瘤細胞的多藥耐藥性[2]。DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα(topoisomerase Ⅱα，Top Ⅱα)是耐藥蛋白之一，是參與細胞復制、轉(zhuǎn)錄、基因重組及有絲分裂等重要的功能酶，TopⅡα抑制劑選擇性抑制增殖期DNA復制細胞，集中殺傷腫瘤細胞，可大大延長患者無進展生存期和總生存期[3-4]。目前，蒽環(huán)類藥物是乳腺癌新輔助治療最主要的藥物之一，有研究發(fā)現(xiàn)，TopⅡα是蒽環(huán)類藥物的作用靶點，其過表達則對蒽環(huán)類藥物敏感[5-6]。本研究對141例乳腺癌患者采用以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的NAC，觀察其化療前后TopⅡα的變化，結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月—2014年10月河北省秦皇島市婦幼保健院乳腺科收治的乳腺癌患者141例。所有患者均為女性，年齡31～61歲，中位年齡42歲，腫瘤臨床分期Ⅱ期86例，Ⅲ期55例。所選標本均為巴德針穿刺活組織檢查或外科術(shù)后病理及免疫組織化學證實為浸潤性導管癌。穿刺前均未行化療、放療和內(nèi)分泌治療。NAC方案為表柔比星、環(huán)磷酰胺(EC)4個周期序貫多西他賽(T)4個周期(每3周為1個周期)。2周期后進行療效評估，其間評估無效(疾病穩(wěn)定和疾病進展)者中轉(zhuǎn)手術(shù)、有效(完全緩解和部分緩解)者完成所有周期化療后14～21 d接受手術(shù)治療。分型按2013中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范的定義分類標準[7]。

1.2 方法 取其化療前穿刺及化療后手術(shù)石蠟標本進行4 μm連續(xù)切片，用涂有3-氨丙基-3-甲氧基硅烷的載玻片置于切片盒子備用。采用即用型二步法(非生物素法)進行TopⅡα免疫組織化學檢測：①石蠟切片于烤箱60 ℃烤20 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精(100%、95%、85%)脫二甲苯，每瓶2 min，蒸餾水沖洗，PBS沖洗；②3%雙氧水室溫孵育5 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，磷酸鹽緩沖液沖洗，烤箱37 ℃，20 min，92～98 ℃微波修復30～40 min，室溫自然冷卻，TBS沖洗；③玻片滴加TopⅡα一抗50 μL，4 ℃過夜，次日取出，甩去玻片表面液體，TBS沖洗；④滴加二抗50 μL，37 ℃孵育30 min，甩去玻片表面液體，TBS沖洗；⑤根據(jù)DAB顯色試劑盒配置顯色劑，根據(jù)背景顏色控制反應5～15 min，自來水沖洗，蘇木精染色5 min，在1%鹽酸中涮洗數(shù)秒，再用清水涮洗，自來水返藍5 min；⑥梯度酒精(85%、95%、100%)脫水，每瓶2 min，二甲苯原液2瓶脫酒精，各1 min。鼠抗人TopⅡα單抗及二抗均購自丹麥DAKO公司，免疫組織化學染色用PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性組織作陽性對照。DAB顯色，蘇木精復染，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3 結(jié)果判斷 由2位專業(yè)病理科醫(yī)師在在顯微鏡下進行雙盲半定量計數(shù)，TopⅡα均根據(jù)2012年美國臨床腫瘤協(xié)會陽性判斷標準進行判定：在腫瘤細胞核內(nèi)有黃色或棕黃色著色顆粒為陽性，陽性細胞<5%為(-)，5%～10%為可疑(±)，>10%～50%為(+)，>50%～75%為(++)，>75%為(+++)，其中(+)～(+++)者為TopⅡα陽性患者，(-)及(±)者為TopⅡα陰性患者。

1.4 臨床判斷 根據(jù)實體瘤評價標準，采用化療前后測量腫瘤最大直徑改變進行評估，判斷腫瘤對NAC是否有反應。目標病灶的治療反應分為完全緩解(所有腫瘤完全消失)、部分緩解(腫瘤最大直徑縮小≥30%)、疾病進展(腫瘤最大直徑增加≥20%或出現(xiàn)新病灶)、疾病穩(wěn)定(腫瘤最大直徑改變不大，達不到部分緩解和進展的標準)。完全緩解和部分緩解為有效，疾病穩(wěn)定和疾病進展為無效，有效率=(完全緩解+部分緩解)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 TopⅡα在乳腺癌各臨床病理指標中的表達及對化療的反應情況 本研究141例浸潤性乳腺癌標本中，在病理分級Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級間TopⅡα陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但病理分級Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?；煼磻行д逿opⅡα陽性率高于無效者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而不同年齡、是否有家族史、是否絕經(jīng)、腫瘤大小、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者TopⅡα陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 TopⅡα表達與乳腺癌臨床病理、化療療效的關(guān)系 (例數(shù)，%)

2.2 不同型別乳腺癌NAC前后TopⅡα的變化 141例乳腺癌患者分為Luminal A型、Luminal B1型、Luminal B2型、HER-2表達型、三陰性5型。NAC前三陰性TopⅡα表達陽性率高于Luminal A型(P<0.05)，NAC后各型之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 NAC后Luminal B2型和HER-2表達型TopⅡα表達陽性率均低于NAC前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 見表2。

表2 不同分型乳腺癌患者NAC前后TopⅡα表達陽性率比較 (例數(shù)，%)

*P<0.05與Luminal A型比較(χ2檢驗)

3 討 論

乳腺癌的發(fā)生是多基因、多步驟參與的一個復雜的過程，無論在分子生物學特征、免疫表型、組織形態(tài)、基因特點，還是對治療的反應上都存在著極大的差異，而這種異質(zhì)性提示其在分子水平上可能具有不同的分子亞型。隨著分子生物學的發(fā)展，因子表達在NAC療效及預后預測方面逐漸顯示出重要的臨床意義和價值，具有一定的化療方案指導作用[8-9]。其分型的金標準是基因芯片分析，但由于其標本制作困難、操作復雜及其耗費昂貴等原因，使其應用受到很大限制，目前免疫組織化學法作為一項較為成熟的技術(shù)成為替代基因芯片法的理想手段。DNA拓撲異構(gòu)酶分為TopⅠ和TopⅡ 2種類型，并各包含若干亞型。其中，TopⅡ能同時切斷DNA的2條鏈，與斷鏈的5′端結(jié)合，形成酶-DNA共價中間物，改變DNA螺旋結(jié)構(gòu)以后，再連接2條鏈，然后與DNA分離，因此TopⅡ不僅與DNA復制、轉(zhuǎn)錄、染色分離有關(guān)，而且還與DNA重組、修復有關(guān)[10]。本研究采用免疫組織化學法檢測141例乳腺癌患者TopⅡα表達特點，結(jié)果顯示病理分級為Ⅰ級的TopⅡα陽性率為27.8%，Ⅱ級的TopⅡα陽性率為37.1%，Ⅲ級的TopⅡα陽性率為58.8%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明病理分級越高，TopⅡα表達水平也越高。TopⅡα基因產(chǎn)物為同型二聚體蛋白質(zhì)，是客觀反映細胞惡性程度的指標之一。理論上癌細胞的分裂增殖越快，惡性程度越高，所需核酶TopⅡα也就越多[11]。TopⅡα蛋白的高表達提示腫瘤的增殖率越高，惡性度更高。Petit等[12]研究顯示，TopⅡα在乳腺癌中的表達與病理學分級呈正相關(guān)，與雌激素受體、完全緩解呈負相關(guān)，且臨床Ⅱ期、Ⅲ期患者如伴有TopⅡα高表達，其預后較低表達者差。說明TopⅡα的表達水平與增殖活性的病理分級相關(guān)，故TopⅡα能夠客觀地反映乳腺癌的增殖活性，對預后有一定的預測作用。

目前，乳腺癌主要的化療方案是以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)或輔助紫杉類，TopⅡα表達是藥敏基礎(chǔ)，有研究顯示經(jīng)蒽環(huán)類藥物治療后的乳腺癌患者，其腫瘤局部TopⅡα的表達陽性率降低，而且TopⅡα表達陽性率降低的患者其化療效果也明顯更好。本研究結(jié)果顯示，NAC前后TopⅡα蛋白的表達確實發(fā)生一定程度的變化，陽性轉(zhuǎn)陰性率為60.3%(85/141)。這是因為TopⅡα主要分布于細胞核漿，可有效與抗腫瘤藥物結(jié)合，故TopⅡα陽性表達患者在進行化療時，化療藥物可更有效地殺滅癌變細胞；同時在化療過程中，化療藥物誘導腫瘤細胞重新表達受體，腫瘤細胞形成選擇性克隆，致使受體陽性或者陰性的細胞選擇性存活。腫瘤細胞多藥耐藥基因的擴增，使其對藥物產(chǎn)生耐藥性，故TopⅡα表達由陽性轉(zhuǎn)陰性，表明化療藥物殺滅大量腫瘤細胞，致使TopⅡα表達水平下降。而TopⅡα陽性轉(zhuǎn)為陰性在Luminal B-like型和HER-2表達型中尤為明顯，與HER-2與TopⅡα在基因定位上非常鄰近有關(guān)，均位于17q12-22，故兩者在基因表達和變化上存在某種聯(lián)系。

總之，NAC可改善某些乳腺癌患者的預后，分子標記物TopⅡα可成為預測NAC療效和預后的參考指標。但還存在一個不可忽視的問題，由于穿刺標本取材有限，取到的組織不一定能代表腫瘤的全部特性而影響其準確判斷。手術(shù)后切除標本評價應再次復習穿刺標本的常規(guī)病理切片，以便作出客觀的治療后評價。

[1] 桑果,王本忠.乳腺癌新輔助化療不同方案近期療效觀察及化療前后Ki-67的表達變化[J].安徽醫(yī)科大學學報,2011,46(11):1181-1184.

[2] 袁磊,時冉冉,饒淑梅,等.沉默AEG-1基因逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7/ADM細胞耐藥性[J].生理學報,2014,66(5):625-630.

[3] 馮慶梅,陳剛,裴月湖.DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑的研究進展[J].沈陽藥科大學學報,2015,32(11):900-910.

[4] Jacobsen RG,Mazloumi Gavgani F,Mellgren G,et al. DNA topoisomerase Ⅱα contributes to the early steps of adipogenesis in 3T3-L1 cells[J]. Cell Signal,2016,28(10):1593-1603.

[5] Ishikawa T,Sasaki T,Tanabe M,et al. The pathological response to anthracycline is associated with topoisomerase Ⅱα gene amplification in the HER2 breast cancer subset[J]. J Surg Sci,2014,2(1):10-12.

[7] 中國抗癌協(xié)會乳腺癌專業(yè)委員會.中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2013版)[J].中國癌癥雜志,2013,23(8):637-684.

[8] 丁婕,戴旭,孟憲運,等.實體瘤療效評價標準的研究進展[J].中國腫瘤臨床與康復,2015,22(9):1150-1152.

[9] Waldrep AR,Avery EJ,Rose FF Jr,et al.Breast cancer subtype influences the accuracy of predicting pathologic response by imaging and clinical breast exam after neoadjuvant chemotherapy[J]. Anticancer Rse,2016,36(10):5389-5395.

[10] Naylor RM,Jeganathan KB,Cao X,et al. Nuclear pore protein NUP88 activates anaphase-promoting complex to promote aneuploidy[J]. J Clin Invest,2016,126(2):543-559.

[11] 秦尚堯,袁一旻,胡昕,等.拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的結(jié)構(gòu)、功能及作用機制研究進展[J].生理學報,2016,68(1):98-106.

[12] Petit T,Wilt M,Velten M,et al. Comparative value of tumour grade,hormonal receptors,Ki-67,HER-2 and topoisomerase Ⅱ alpha status as predictive markers in breast cancer patients treated with neoadjuvant anthracycline-based chemotherapy[J]. Eur J Cancer,2004,40(2):205-211.

(本文編輯：許卓文)

2016-11-04；

2016-12-25

楊良權(quán)(1980-)，男，山西應縣人，河北省秦皇島市婦幼保健院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事乳腺外科疾病診治研究。

R737.9

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10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.027