劉永波，宋春蓮，謝相悅，吳常月，王志方，凌萬(wàn)旭，顏宏奎，張慶偉，舒相華*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠，鄭州，450000；3.昆明偉牧得生物科技有限公司，昆明，650201；4.山東省東營(yíng)市黃河三角洲動(dòng)物樂(lè)園管理有限責(zé)任公司，東營(yíng)，257091）

云南4個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟抗體水平監(jiān)測(cè)及免疫效果分析

劉永波1，宋春蓮1，謝相悅1，吳常月1，王志方2，凌萬(wàn)旭3，顏宏奎3，張慶偉4，舒相華1*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠，鄭州，450000；3.昆明偉牧得生物科技有限公司，昆明，650201；4.山東省東營(yíng)市黃河三角洲動(dòng)物樂(lè)園管理有限責(zé)任公司，東營(yíng)，257091）

為檢測(cè)云南省某地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)豬瘟病毒抗體水平及免疫效果分析，通過(guò)監(jiān)測(cè)整體豬瘟抗體水平來(lái)制定有效的免疫程序，并對(duì)抗體效價(jià)不合格的豬只及時(shí)補(bǔ)種疫苗，對(duì)豬瘟的防控有重大意義。本試驗(yàn)應(yīng)用豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)，檢測(cè)了云南省某地區(qū)4個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)283份血清的豬瘟抗體水平。結(jié)果表明，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有74份，免疫合格率為73.9%。哺乳仔豬檢測(cè)65份，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有22份，免疫合格率為66.2%。斷奶仔豬檢測(cè)74份，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有28份，免疫合格率為62.1%。育肥豬檢測(cè)75份，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有21份，免疫合格率為72%。母豬檢測(cè)69份，豬瘟血清抗體水平≧1∶8的有3份，免疫合格率為95.6%。所有豬群中斷奶仔豬免疫合格率最低，與臨床上斷奶仔豬豬瘟發(fā)病率較高相吻合。

豬瘟;抗體監(jiān)測(cè);免疫

豬瘟，又稱古典豬瘟，是由豬瘟病毒引起豬的一種急性、發(fā)熱性、高度接觸性傳染病，以發(fā)病急、高熱稽留和毛細(xì)血管壁變性引起廣泛出血、梗塞和壞死等變化為特征，其流行廣泛，發(fā)病率和死亡率高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大，因此備受世界各國(guó)關(guān)注，國(guó)際獸醫(yī)局也將其列入一類法定傳染病，并規(guī)定為國(guó)際重點(diǎn)檢疫對(duì)象[1]。近年來(lái)隨著養(yǎng)豬規(guī)模的擴(kuò)大，飼養(yǎng)管理水平的參差不齊，豬瘟在各地的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，臨床表現(xiàn)以影響繁殖性能和隱形帶毒為主[2]，并伴隨其他繼發(fā)感染病，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的損失。注射豬瘟疫苗以提高群體抗體水平是預(yù)防豬瘟發(fā)生的有效辦法[3]。但目前在疫苗免疫接種上普遍存在一個(gè)很大的誤區(qū)，即僅僅注重免疫密度，卻忽視了免疫接種的質(zhì)量[4]。免疫監(jiān)測(cè)可為被檢豬群是否需要繼續(xù)免疫注射提供依據(jù)，是提高豬群群體免疫質(zhì)量的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)將豬瘟抗原吸附在紅細(xì)胞上制成紅細(xì)胞致敏抗原，加入倍比稀釋的待檢血清，如紅細(xì)胞發(fā)生凝集，說(shuō)明待檢血清中有相應(yīng)抗體與其結(jié)合，由此可推斷待檢豬體內(nèi)有抗豬瘟病毒抗體，再根據(jù)發(fā)生凝集孔的稀釋度數(shù)判斷待檢豬體內(nèi)的抗體水平。

1 材料與方法

材料來(lái)源：血清：樣品血清采自云南省某地區(qū)4個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)（四個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)編號(hào)為I、II、III、IV，四個(gè)豬場(chǎng)所采血樣豬只均于三個(gè)月內(nèi)免疫），共283頭份，其中哺乳仔豬65頭份，斷奶仔豬74頭份，育肥豬75頭份，母豬69頭份。血液采集后3000轉(zhuǎn)10min離心，取上清液備用。

1.1 試劑及儀器

試劑：豬瘟間接血凝抗原，豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清，稀釋液，購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所。待檢血清。

儀器：96孔V型血凝板，購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所。一次性透明醫(yī)用手套，25、50微升微量移液器（17965，5～40μL：X15105，15～40μL：X18493，40～200μL：8排管E89364，5～50μL，芬蘭)，微量移液器槍頭，振蕩器，水浴鍋，恒溫箱，濕盒，無(wú)菌青霉素小瓶（用于分裝稀釋液和抗原液）。

1.2 方法與步驟

1.2.1 加稀釋液

96孔V型血凝板1-6排：用于檢測(cè)待檢血清，每排檢測(cè)一個(gè)樣品。每排1-10孔每孔加50微升稀釋液。

96孔V型血凝板第7排：1-3孔為陰性血清對(duì)照，5、6孔為稀釋液對(duì)照。1-3孔及5、6孔每孔加50微升稀釋液。

96孔V型血凝板第8排：陽(yáng)性血清對(duì)照。1-12孔每孔加50微升稀釋液。

1.2.2 稀釋待檢血清

1號(hào)待檢血清：取50微升加入第1排第1孔，混合稀釋取50微升移致下一孔作倍比稀釋，致第10孔棄50微升。

2號(hào)待檢血清：取50微升加入第2排第1孔，同上。

1-10孔待檢血清稀釋梯度：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1：1024

1.2.3 陰性對(duì)照血清的稀釋

取陰性血清50微升加入第7排第1孔，倍比稀釋，致第3孔棄50微升。陰性血清稀釋度：1∶2，1∶4，1∶8。5、6孔為稀釋液對(duì)照（只有稀釋液）。

1.2.4 陽(yáng)性血清的稀釋

取陽(yáng)性血清50微升加入第8排第1孔，倍比稀釋，致第12孔棄50微升。陽(yáng)血清稀釋度：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，......1∶4096。

1.2.5 加血凝抗原

被檢血清各孔、陰性血清各孔、陽(yáng)性血清各孔、稀釋液對(duì)照孔均各加25豬間接血凝抗原（充分搖勻，瓶底應(yīng)無(wú)血球沉淀）。

1.2.6 振蕩混勻

將血凝板置于微量振蕩器上,振蕩1-2min。

1.2.7 反應(yīng)

蓋上玻板，室溫下或37℃下靜置1.5-2小時(shí)判定結(jié)果，或延至翌日判定。

1.3 結(jié)果判定

以呈現(xiàn)“++”血凝反應(yīng)的血清最高稀釋度作為該血清的間接血凝抗體效價(jià)。血凝反應(yīng)強(qiáng)度表示如下：

“++++”紅細(xì)胞全部凝集，形成一層均勻膜，布滿整個(gè)孔底。

“+++”紅細(xì)胞在孔底形成一層薄膜，面積比前者略小。

“++”紅細(xì)胞在孔底形成薄膜凝集，邊緣松散或呈鋸齒狀。

“+”紅細(xì)胞沉于孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圓點(diǎn)。

“±”紅細(xì)胞沉于孔底，但周圍不光滑或中心有空斑。

“-”紅細(xì)胞完全沉于孔底，呈光滑的圓點(diǎn)。

當(dāng)陽(yáng)性血清抗體效價(jià)≥1：256、陰性血清≤1：8、稀釋液對(duì)照孔無(wú)自凝現(xiàn)象時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立。接種豬瘟疫苗的豬群免疫抗體效價(jià)≤1：16為免疫合格。

2 結(jié)果

2.1 各豬場(chǎng)豬瘟病毒抗體檢測(cè)結(jié)果I、II、III、IV四個(gè)豬場(chǎng)哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和母豬豬瘟血清抗體水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 不同年齡段豬群豬瘟病毒抗體檢測(cè)結(jié)果哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和母豬豬瘟血清抗體水平比較

表14 個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)豬瘟血清抗體檢測(cè)結(jié)果

圖1 不同年齡段豬群豬瘟病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3 豬瘟血清抗體效價(jià)水平分布共檢測(cè)豬瘟抗體283份，免疫總合格率為73.9%，其中血清抗體水平≥1∶8的有74頭份。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 檢測(cè)豬血清豬瘟抗體效價(jià)分布

3 討論

3.1 隨著養(yǎng)豬規(guī)模的擴(kuò)大及豬群的轉(zhuǎn)移，不少豬場(chǎng)因豬瘟的發(fā)生造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)病豬群豬瘟血清抗體水平低下，不能保護(hù)豬群免受豬瘟強(qiáng)毒感染是關(guān)鍵所在。一般認(rèn)為，豬瘟抗體效價(jià)≦1∶8才能夠抵抗強(qiáng)毒感染[5]。本次調(diào)查結(jié)果顯示：在283份血清中，效價(jià)≧1∶8的有74份，免疫合格率為73.9%。高于何啟蓋等[6]的調(diào)查結(jié)果，總免疫合格率只有55.84%，但豬群免疫不合格的比例達(dá)26.1%，存在感染強(qiáng)毒的可能。

3.2 I豬場(chǎng)、II豬場(chǎng)、III豬場(chǎng)和IV豬場(chǎng)分別檢測(cè)72、75、66、70頭份，豬瘟病毒抗體效價(jià)總合格率分別為66.7%、64%、90.9%和75.7%。檢測(cè)結(jié)果顯示III豬場(chǎng)豬瘟免疫保護(hù)率最高，II豬場(chǎng)豬瘟免疫保護(hù)率最低。

3.3 不同年齡段的豬群豬瘟血清抗體水平差異較大。哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和母豬血清抗體水平免疫合格率分別為66.2%、62.1%、72%和95.6%。4個(gè)豬場(chǎng)均為母豬的免疫效果比較好，斷奶仔豬最低，建議在斷奶前對(duì)哺乳仔豬進(jìn)行豬瘟首免。

3.4 豬場(chǎng)普遍存在免疫率不高，其原因可能有以下幾種：(1)免疫機(jī)能差，注射疫苗后產(chǎn)生抗體的效果不理想；(2)注射疫苗時(shí)注射分量不夠，存在打“飛針”現(xiàn)象[7]；(3)疫苗質(zhì)量問(wèn)題；(4)豬瘟持續(xù)感染種豬，易引起免疫耐受，導(dǎo)致免疫失敗[8]；(5)豬免疫抑制病的普遍存在也是造成豬瘟抗體水平低下的一個(gè)很重要的原因，如豬繁殖與呼吸道疾病綜合征。另外，已經(jīng)證實(shí)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征病毒損害淋巴組織，引起廣泛的淋巴細(xì)胞減失，導(dǎo)致并發(fā)或繼發(fā)感染，可引起免疫抑制[9]。

3.5 建議這四個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行豬瘟免疫時(shí)應(yīng)加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的工作：(1)檢測(cè)是否存在免疫抑制性疾病，如豬繁殖與呼吸道疾病綜合癥、豬圓環(huán)2型等疾病，淘汰存在免疫抑制性疾病的豬；(2)免疫功能低下的豬隔離觀察，特別是多次免疫仍達(dá)不到免疫要求的種母豬，可借鑒湯薇等[10]對(duì)低抗體水平母豬的淘汰方法；(3)注射疫苗時(shí)注射部位要準(zhǔn)確，注射用針頭型號(hào)應(yīng)視豬而定，大豬用粗長(zhǎng)針頭，小豬用短細(xì)針頭，要確保將疫苗注射在肌肉層內(nèi)，防止疫苗滲漏；(4)購(gòu)買質(zhì)量好的豬瘟疫苗；(5)將疫苗接種與免疫監(jiān)測(cè)有機(jī)結(jié)合，以免疫監(jiān)測(cè)結(jié)果為依據(jù)制定合理的免疫程序[11]，達(dá)到最佳免疫效果。

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S815.4

B

1003-8655（2017）01-0084-03

劉永波（1989-），河南人，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防控及中藥免疫學(xué)，757259269@qq.com.

舒相華（1973-），云南騰沖人，男，副教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防控及飼料毒物學(xué)，1633992175@qq.com.