熊智強(qiáng) ， 張 匯， 艾連中

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海食品微生物工程研究中心，上海 200093)

大學(xué)的首要任務(wù)是培養(yǎng)高素質(zhì)人才，本科畢業(yè)論文作為大學(xué)人才培養(yǎng)方案中重要的教學(xué)實(shí)踐環(huán)節(jié)，具有其他教學(xué)環(huán)節(jié)所不能替代的實(shí)踐性和綜合性作用[1]。本科畢業(yè)論文是檢驗(yàn)本科生綜合運(yùn)用所學(xué)專業(yè)知識(shí)和專業(yè)基本技能，考察學(xué)生分析和解決實(shí)際問題能力的一種重要手段[2-3]。通過完成畢業(yè)論文，讓學(xué)生能夠綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)，獨(dú)立地分析和解決問題，提升其綜合素質(zhì)，為其順利進(jìn)入社會(huì)奠定基礎(chǔ)。畢業(yè)論文的質(zhì)量，既是評(píng)定學(xué)生學(xué)業(yè)能力的一個(gè)重要指標(biāo)，又是認(rèn)定本科畢業(yè)和學(xué)士學(xué)位資格的一項(xiàng)重要依據(jù)[3]。然而，近些年隨著大學(xué)嚴(yán)重?cái)U(kuò)招和就業(yè)形勢(shì)日益嚴(yán)峻，大學(xué)本科畢業(yè)論文整體水平呈現(xiàn)逐步下滑趨勢(shì)[3]。因此，提高本科畢業(yè)論文水平對(duì)提升大學(xué)生綜合素質(zhì)具有顯著的意義。由于食品微生物是一門與農(nóng)業(yè)和加工業(yè)聯(lián)系緊密的學(xué)科，其畢業(yè)論文一般是在通過一系列實(shí)驗(yàn)獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，完成數(shù)據(jù)分析、論文撰寫和最終通過論文答辯[4]。上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院對(duì)本科畢業(yè)論文教學(xué)過程中，以“上海食品微生物工程研究中心”為載體，一直以功能性乳酸菌的篩選及其分子生物學(xué)為重要研究方向，對(duì)本科生畢業(yè)論文指導(dǎo)工作進(jìn)行探索和實(shí)踐。本文以“干酪乳桿菌異源表達(dá)膽鹽水解酶”畢業(yè)論文為例，將有關(guān)的試驗(yàn)步驟和指導(dǎo)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行介紹，以期為食品微生物學(xué)科本科生畢業(yè)論文的指導(dǎo)工作提供參考。

1 論文選題

本科畢業(yè)論文安排在本科最后一個(gè)學(xué)期進(jìn)行，但經(jīng)常與畢業(yè)生就業(yè)、考研和公務(wù)員面試等關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)相沖突[5]。為避免對(duì)學(xué)生就業(yè)的沖擊和教師指導(dǎo)過于集中，食品微生物方向的指導(dǎo)教師會(huì)將畢業(yè)論文啟動(dòng)工作提前至第六學(xué)期末，使指導(dǎo)的學(xué)生從大三學(xué)期結(jié)束的假期開始有較長的時(shí)間來完成選題、查閱文獻(xiàn)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施等畢業(yè)論文工作。畢業(yè)論文質(zhì)量好壞關(guān)鍵在選題[6]，尤其是論文創(chuàng)新性。根據(jù)指導(dǎo)教師承擔(dān)的科研項(xiàng)目和學(xué)生的科研興趣，結(jié)合上海食品微生物工程研究中心的研究方向及實(shí)驗(yàn)條件，選定“干酪乳桿菌異源表達(dá)膽鹽水解酶”為論文題目。

干酪乳桿菌是一種具有調(diào)節(jié)人體腸道菌群、促進(jìn)消化吸收和增強(qiáng)人體免疫力等多種保健功能的重要益生乳酸菌[7]，廣泛應(yīng)用在發(fā)酵乳等食品工業(yè)生產(chǎn)中。例如，干酪乳桿菌LC2W是天然發(fā)酵食品中篩選的具有降血壓功能的益生乳酸菌[8-9]，該菌株已經(jīng)獲得中國和歐洲發(fā)明專利授權(quán)，并已在光明乳業(yè)股份有限公司產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，用于生產(chǎn)酸奶等發(fā)酵乳產(chǎn)品[8-13]。對(duì)干酪乳桿菌基因組分析發(fā)現(xiàn)[13]，基因組中并不存在膽鹽水解酶基因(負(fù)責(zé)水解結(jié)合膽鹽形成游離膽汁酸和氨基酸，使游離膽汁酸與膽固醇形成復(fù)合物沉淀，從而減少膽固醇含量)，造成其對(duì)膽鹽的耐受性不強(qiáng)。因此，在干酪乳桿菌中異源表達(dá)植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶，可顯著提高干酪乳桿菌的膽鹽耐受性，對(duì)開發(fā)降低膽固醇的干酪乳桿菌產(chǎn)品提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段，指導(dǎo)教師應(yīng)對(duì)學(xué)生進(jìn)行理論知識(shí)、實(shí)驗(yàn)操作和儀器使用等方面集中指導(dǎo)，使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中盡可能減少不必要的錯(cuò)誤。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備包括方案設(shè)計(jì)、試驗(yàn)材料和試劑準(zhǔn)備等方面。指導(dǎo)教師將整個(gè)課題的前期工作和論文目標(biāo)對(duì)學(xué)生進(jìn)行介紹，讓學(xué)生結(jié)合畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行文獻(xiàn)查閱，了解研究背景和最新國內(nèi)外研究進(jìn)展，掌握干酪乳桿菌分子生物學(xué)和膽鹽水解酶蛋白表達(dá)的研究情況，同時(shí)學(xué)習(xí)食品微生物厭氧培養(yǎng)和乳酸菌分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)操作。學(xué)生結(jié)合上述已掌握的相關(guān)知識(shí)，設(shè)計(jì)可行性的實(shí)驗(yàn)方案，并與指導(dǎo)教師進(jìn)行方案討論，最終確定實(shí)驗(yàn)方案和撰寫開題報(bào)告。學(xué)生根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在指導(dǎo)教師協(xié)助下采購或采集實(shí)驗(yàn)所需的試劑、耗材或?qū)嶒?yàn)所需樣本。

3 實(shí)驗(yàn)研究

實(shí)驗(yàn)研究是畢業(yè)論文的核心階段[1-2，6]。在此階段要培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力和科研思維能力，使學(xué)生能夠具備分析和解決科研問題的能力。在實(shí)驗(yàn)過程中，要求學(xué)生態(tài)度嚴(yán)謹(jǐn)，嚴(yán)格完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，詳實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)總結(jié)，向指導(dǎo)教師匯報(bào)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。指導(dǎo)教師幫助學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定實(shí)驗(yàn)是否達(dá)到預(yù)期設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)方案是否需要進(jìn)行調(diào)整。為方便學(xué)生實(shí)驗(yàn)研究，上海食品微生物工程研究中心實(shí)行開放式管理，每天早8:30至晚10:00對(duì)學(xué)生開放，學(xué)生可以根據(jù)自己的時(shí)間預(yù)約儀器和安排實(shí)驗(yàn)。

3.1 產(chǎn)膽鹽水解酶菌株的平板定性篩選

學(xué)生通過文獻(xiàn)查閱不難發(fā)現(xiàn)，很多種乳酸菌都含有膽鹽水解酶，但活性各異。由于文獻(xiàn)中酶活定義各不相同，很難比較出活性較高的膽鹽水解酶。為了克隆高活性的膽鹽水解酶基因，實(shí)驗(yàn)方案采用平板篩選法[14-15]，從實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的乳酸菌中篩選高膽鹽降解活性的菌株，從中進(jìn)行膽鹽水解酶基因克隆。通過平板篩選法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸菌菌種庫進(jìn)行快速定性膽鹽水解酶篩選，發(fā)現(xiàn)5株植物乳桿菌能在含有5 mmol/L甘氨膽酸鈉鹽的MRS固體培養(yǎng)基上生長，其中3株植物乳桿菌有白色沉淀圈，說明這3株菌產(chǎn)膽鹽水解酶有較好的活性。特別是植物乳桿菌AR113的白色沉淀圈最大，說明其膽鹽水解酶酶活最強(qiáng)。通過這樣簡單的平板篩選法，快速地篩選出高活性的膽鹽水解酶，避免了盲目克隆和表達(dá)出乳酸菌中低活性膽鹽水解酶，大大地降低了實(shí)驗(yàn)失敗風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 膽鹽水解酶表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

學(xué)生在進(jìn)行本部分實(shí)驗(yàn)前，首先經(jīng)過指導(dǎo)教師的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作系統(tǒng)培訓(xùn)，使學(xué)生較為熟練的掌握乳酸菌基因組DNA 提取、PCR技術(shù)克隆目的基因、PCR產(chǎn)物回收、酶切和連接、重組質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)操作技能。所以，學(xué)生在進(jìn)行植物乳桿菌基因組DNA提取和PCR克隆植物乳桿菌來源膽鹽水解酶基因的實(shí)驗(yàn)過程較為順利，經(jīng)瓊脂糖電泳跑膠，發(fā)現(xiàn)DNA條帶單一。同時(shí)Nanodrop儀器檢測(cè)也顯示，DNA質(zhì)量較高，可以滿足后期試驗(yàn)需要。利用PCR清潔回收試劑盒回收克隆的膽鹽水解酶DNA片段，通過酶切和連接等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，最終順利構(gòu)建出表達(dá)植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶重組乳酸菌質(zhì)粒。

3.3 膽鹽水解酶在干酪乳桿菌中表達(dá)

目前蛋白表達(dá)最常用的原核宿主是大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌，乳酸菌并不是表達(dá)蛋白的通用宿主，蛋白表達(dá)量不高。此外，蛋白表達(dá)選用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)方式最為常見，蛋白表達(dá)量較高，但在乳酸菌中誘導(dǎo)型表達(dá)方式對(duì)蛋白表達(dá)效果不能確定。為避免在乳酸菌中可能出現(xiàn)表達(dá)目的蛋白含量太低的情況，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)就選用了強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子來對(duì)膽鹽水解酶進(jìn)行蛋白表達(dá)。另外，通過增加膽鹽水解酶的基因拷貝數(shù)，可進(jìn)一步增加蛋白表達(dá)。將膽鹽水解酶重組質(zhì)粒導(dǎo)入干酪乳桿菌中，聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白檢測(cè)，成功觀察到目的蛋白的表達(dá)。通過高效液相色譜檢測(cè)，重組的膽鹽水解酶具有一定的降膽鹽能力，能較好的降解甘氨類膽鹽，其中降解甘氨脫氧膽酸最強(qiáng)，甘氨膽酸其次，甘氨鵝脫氧膽酸的降解能力較弱。通過上述實(shí)驗(yàn)充分表明，植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶在干酪乳桿菌中得到了活性蛋白表達(dá)。

4 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

學(xué)生按上述實(shí)驗(yàn)方案將全部實(shí)驗(yàn)完成后，與指導(dǎo)教師一起確定論文撰寫大綱。按照擬定的大綱和學(xué)院相關(guān)要求完成論文初稿撰寫，并交由指導(dǎo)教師修改。指導(dǎo)教師對(duì)論文條理、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果與討論等部分對(duì)學(xué)生做出指導(dǎo)，修改后返回給學(xué)生繼續(xù)修改，如此反復(fù)多次直至定稿。學(xué)院同行專家和老師對(duì)定稿的畢業(yè)論文給出評(píng)閱意見，將意見返還學(xué)生修改。指導(dǎo)教師對(duì)再修改的論文進(jìn)行審閱，給學(xué)生對(duì)畢業(yè)論文答辯提供建設(shè)性意見，使學(xué)生順利通過畢業(yè)論文答辯。

5 小 結(jié)

畢業(yè)論文作為本科人才培養(yǎng)過程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，是全面考核學(xué)生綜合素質(zhì)的有效方式[6]。通過論文選題、實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)研究等環(huán)節(jié)對(duì)食品專業(yè)學(xué)生進(jìn)行食品微生物畢業(yè)論文指導(dǎo)和訓(xùn)練，使學(xué)生在畢業(yè)階段極大地提高了對(duì)科研工作的興趣，鍛煉了學(xué)生的動(dòng)手能力、科研思維能力和團(tuán)隊(duì)協(xié)作精神。按照上述本科畢業(yè)論文指導(dǎo)模式，學(xué)生初步掌握如何解決科學(xué)問題的方法和步驟，如何檢索和查閱相關(guān)文獻(xiàn)，如何組織和實(shí)施實(shí)驗(yàn)，如何用軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)圖片，如何分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)，如何撰寫畢業(yè)論文等能力。

以“干酪乳桿菌異源表達(dá)膽鹽水解酶”作為學(xué)生畢業(yè)論文題目，課題涉及到食品科學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科的理論與實(shí)驗(yàn)技能，要求學(xué)生在有限的時(shí)間內(nèi)獨(dú)立完成該畢業(yè)論文，這種自主性設(shè)計(jì)畢業(yè)論文能夠較為全面地多層次考察學(xué)生的自我學(xué)習(xí)、分析問題、解決問題和動(dòng)手能力。學(xué)生最終能夠在有限的時(shí)間內(nèi)高質(zhì)量地完成實(shí)驗(yàn)，并順利通過畢業(yè)論文答辯。畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果目前已被國外乳品頂級(jí)刊物Journal of Dairy Science接收，間接說明畢業(yè)論文題目選題恰當(dāng)、立意新穎、具有較好的科學(xué)前沿性和創(chuàng)新性。學(xué)生實(shí)驗(yàn)構(gòu)建異源表達(dá)植物乳桿菌來源膽鹽水解酶的干酪乳桿菌工程菌，顯著提高干酪乳桿菌的膽鹽水解酶活性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和理論指導(dǎo)意義，為開發(fā)降低膽固醇的干酪乳桿菌發(fā)酵乳產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

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