袁柳嬌 傅夢妮 余如鳳 黎海利 袁長春 陳燕 劉鍇棟

(嶺南師范學院，湛江，524048)

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秋茄(KandeliacandelL.)響應重金屬脅迫的數(shù)字基因表達譜1)

袁柳嬌 傅夢妮 余如鳳 黎海利 袁長春 陳燕 劉鍇棟

(嶺南師范學院，湛江，524048)

基于高通量測序的數(shù)字基因表達譜(DGE)技術，對重金屬污水脅迫處理組和對照組秋茄材料進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。結果表明，重金屬污水脅迫處理樣品與對照樣品相比，共篩選出的3 097個差異表達基因，其中2 202個表達上調(diào)，895個表達下調(diào)。GO功能顯著性富集分析出38個GO分類條目，大量與生長發(fā)育，代謝調(diào)控，環(huán)境刺激響應相關的基因表現(xiàn)為富集。進一步的KEGG代謝途徑分析表明，差異表達基因主要與糖類、核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子代謝、能量代謝以及次生代謝過程有關。轉(zhuǎn)錄因子分析發(fā)現(xiàn)bHLH，MYB，NAC和WRKY在重金屬脅迫中發(fā)揮重要作用。此外，重金屬脅迫還促進萜類、黃酮類化合物生物合成的關鍵酶基因(牻牛兒基焦磷酸合酶(Unigene0029352)、黃酮醇合成酶(Unigene0010384))的表達，進而促進秋茄有效成分的積累；顯著誘導細胞分裂素相關基因type-b響應調(diào)節(jié)子ARR2(Unigene0033740)的表達、抑制油菜素內(nèi)酯的信號轉(zhuǎn)導組分基因BSK(Unigene0008986)的表達，進而提高秋茄對重金屬脅迫的適應能力。實驗選取了5個與環(huán)境刺激響應密切相關的基因，通過qRT-PCR驗證了它們在重金屬污水脅迫處理下的表達差異，結果與數(shù)字基因表達譜分析的結果較為一致，證實了差異表達基因數(shù)據(jù)的有效性。說明在重金屬脅迫處理下，秋茄通過調(diào)節(jié)基因表達提高自身對污染脅迫的耐受能力。

秋茄；重金屬；污水脅迫處理；數(shù)字基因表達譜(DEG)；差異表達基因

Digital Gene Expression Profiling (DGE) technique was used to analyze the differences in gene expressions ofKandeliacandelunder artificial heavy metal treatment. A total of 3097 differential expressed genes (DEGs) were screened. Compared with the control treatment samples, 2202 DEGs were up-regulated and 895 DEGs were down-regulated in the heavy metal water treatment samples. By gene ontology (GO), 38 DEGs were enriched in the processes of growth, metabolism regulation and environmental stimuli response. KEGG pathway enrichment analysis showed that these DEGs were involved in various pathways of biological macromolecules metabolism, energy metabolism and secondary metabolism, such as sugar, protein, nucleic acid and lipid biosynthesis pathways. By transcription factor analysis, bHLH, MYB, NAC and WRKY played vital role in response to heavy metal stress. The geranyl pyrophosphate synthase (Unigene0029352) and flavonol synthase (Unigene0010384) involved in terpenoid and flavonoid biosynthesis were up-regulated by heavy metal stress might be the reason for the enhancement for the active ingredients accumulation inK.candel. The significantly promotion of the type-b response regulatorARR2 (Unigene0033740) involved in the signal transduction of cytokinins by heavy metal stress, and the inhibition of serine/threonine-protein kinase BSK (Unigene0008986) involved in the signal transduction of brassinolide by heavy metal stress might enhance the stress tolerance inK.candel. Five randomly selected ‘responses to stimulus’ related genes were used to confirm the accuracy of DGE.

紅樹林為木本植物，分布于熱帶與亞熱帶海岸潮間帶，在維護生態(tài)平衡和保護環(huán)境有著不可或缺的作用[1]。秋茄(KandeliacandelL.)，又名水筆仔、茄行樹，是紅樹植物中為數(shù)眾多的物種之一，在植物學分類中為紅樹科秋茄屬的唯一物種，其株高為1～2 m，其樹皮呈現(xiàn)紅褐色而且比較光滑。在一定的地理條件下，秋茄可以形成單優(yōu)勢種灌木群落[2]。

隨著我國沿海地區(qū)工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展以及城市化區(qū)域的不斷擴大，工農(nóng)廢水和生活污水的排放量越來越大。大量污水涌入江河海灣造成了很大的環(huán)境壓力[3]。作為一個典型的熱帶、亞熱帶帶生態(tài)系統(tǒng)，海岸紅樹林濕地對泥灘中的污染物和有毒物質(zhì)有著較強的耐受及吸附作用。成片的紅樹林可以通過汲取、蓄積各種重金屬離子來凈化水體和濕地土壤[4-5]。然而，污水排放對紅樹林植物造成的正負影響在學術界一直存在爭議的。紅樹植物一方面可以從排放的污水中攝取營養(yǎng)物質(zhì)，有利于植物的生長；但是另一方面，污水中的重金屬離子也會對紅樹植物造成毒害[6]。因此，研究紅樹植物污水脅迫機理，對沿海灘涂的造林綠化、植被恢復以及林木作物抗污性育種具有重要的理論及指導意義。從20世紀80年代開始，一些研究人員對秋茄在污染脅迫下的生理學及次級代謝物質(zhì)的變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)總酚、單寧和縮合單寧參與了秋茄根和葉對鎘的螯合，增強了秋茄對鎘的耐性，同時秋茄幼苗通過改變體內(nèi)類黃酮和葉綠素含量促進秋茄對生活污水脅迫的耐性[7-8]，但是從分子層面分析重金屬污水脅迫對秋茄的影響以及秋茄的耐受機制尚少見報道。

數(shù)字基因表達譜(digital gene expression profiling，DGE)是一種高通量測序技術，可以全面、快速檢測某一物種特定組織在特定狀態(tài)下基因表達情況。轉(zhuǎn)錄組測序不依賴于基因組序列，是研究無參考基因組物種基因表達與調(diào)控的一把利器。隨著新一代測序平臺的研發(fā)及市場化，基于轉(zhuǎn)錄組測序的DGE技術大量被應用于不同處理下差異基因的檢測與功能基因的挖掘。目前已有學者利用該技術分析了鳳丹[9]、白樺[10]、長白落葉松[11]、壇紫菜[12]、花生[13]等植物在不同脅迫環(huán)境下轉(zhuǎn)錄水平的差異。本文采用基于高通量測序的數(shù)字基因表達譜技術研究重金屬污水脅迫處理下秋茄的基因表達變化，從分子的層面分析秋茄對重金屬污染脅迫的耐受機制，為深入研究重金屬污水脅迫對紅樹植物生長的影響機制提供理論基礎。

1 材料與方法

實驗試劑：Hoagland營養(yǎng)液；Trizol試劑盒(TaKaRa,大連，中國)；瓊脂糖；寡聚(dT)-纖維素；片段化緩沖液(fragmentation buffer)；dNTPs；六堿基隨機引物；RNase H；DNA polymerase I；QiaQuick PCR試劑盒；EB緩沖液；PrimeScriptTMRT Master Mix (TaKaRa，大連，中國)；SYBR Green supermix；儀器：PCR儀型Bio-Rad CFX96 touchTM。

1.1 材料處理和收集

2015年3月在湛江雷州附城鎮(zhèn)紅樹林育苗場采集秋茄幼苗，選取株高約20～30 cm，具有3～4對葉片的秋茄幼苗。將株高相近、長勢旺盛、完好無損的36株秋茄幼苗隨機分成重金屬處理組和對照組，每組設置3個重復。隨后加入1/2 Hoagland營養(yǎng)液于室溫條件下進行復壯培養(yǎng)(室溫約20 ℃)，30 d后處理組進行人工重金屬污染脅迫處理。人工重金屬污水脅迫處理參照Zhang et al[14]中的方法，其中Pb2+、Cd2+、Hg2+作為外界脅迫因素，它們的質(zhì)量濃度分別為10、2、2 mg·L-1。對照組用等量的1/2 Hoagland營養(yǎng)液處理。對照組和處理組在相同的環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)2 d后分別摘取無缺損、完全開展的嫩葉。將所得秋茄葉片保存于液氮中備用。

1.2 總RNA提取和基因表達譜測序

污水脅迫處理組和對照組的秋茄葉片樣品總RNA抽取采用Trizol法。對照和處理各3份生物學重復。然后將對照和處理的各自3份RNA樣品等量混合，由廣州基迪奧公司構建測序文庫，采用Illumina HiSeqTM 2000平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 序列比對及差異表達基因的篩選

預處理后序列與胡楊、麻風樹參考基因組數(shù)據(jù)庫進行比對。根據(jù)與參考基因組比對情況計算序列的全基因組覆蓋情況并計算RNA的表達量。在RNA-seq分析中，利用定位到基因表達區(qū)域測序序列的序列計數(shù)對該基因的表達水平進行估計，用edgeR軟件對基因表達水平分析中得到的序列計數(shù)數(shù)據(jù)進行差異分析，并以P<0.05，|lbx|>1(x為差異倍數(shù))的篩選閾值篩選出差異表達基因，其中差異倍數(shù)為重金屬污水脅迫處理樣本與對照樣本中各基因表達量的比值。對于差異表達基因，其lbx>1時，則認為該差異表達基因是上調(diào)的，反之，若lbx<-1，認為該差異表達基因是下調(diào)的。

1.4 Gene Ontology(GO)基因功能注釋和KEGG代謝通路分析

采用GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)對重金屬污水脅迫后的紅樹秋茄植物進行GO功能顯著性富集分析，并對篩選得到的差異表達基因進行聚類分析。通過GOseq方法假設驗證得到一個特定的P，并以此界定差異表達基因在特定GO中的富集程度。一般校正后的P<0.05，則表明差異表達基因在該功能GO中出現(xiàn)了富集。使用KOBAS(2.0)進行Pathway富集分析，當錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.05時，表示差異表達基因在該通路中顯著性富集。

1.5 qRT-PCR驗證

選取植物環(huán)境刺激響應相關的差異表達基因，利用qRT-PCR技術，驗證數(shù)字基因表達譜測序的可靠性。表1為相關引物。

表1 引物序列

利用Premier primer 5軟件設計紅樹植物秋茄中各基因的RT引物，擴增平均長度在200～250 bp。以秋茄組成型表達基因tubulin作為內(nèi)參基因。秋茄對照樣本及重金屬污水脅迫處理樣本各取1 μg總RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，大連，中國)試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于實時熒光定量檢測。反應體系如下：總體系為10 μL，含有SYBR Green supermix(2×)5 μL，上游引物0.2 μmol/L，下游引物0.2 μmol/L，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。本試驗共進行3次獨立的生物學重復，并采用2-ΔΔCt的方法計算相關的差異表達基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 測序質(zhì)量分值

對轉(zhuǎn)錄組測序得到的數(shù)據(jù)分析表明，對照樣本和重金屬污水脅迫處理樣本經(jīng)過除雜后獲得的有效序列與原始序列比例接近，對照樣本的有效序列為99.19%，重金屬污水脅迫處理樣本的有效序列為99.14%，說明構建cDNA文庫和測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量比較高。因為受到紅樹植物秋茄的遺傳背景不同和注釋信息量差異的限制，對照樣本有效序列中基因并未完全被注釋，大約89.06%的基因被注釋，剩下的10.94%的有效序列未能注釋到對應的功能基因，重金屬污水脅迫處理樣本的有效序列的注釋情況與對照樣本具有較高的一致性。另外，大部分注釋基因只有一種序列(占對照樣本的74.92%，重金屬污水脅迫處理樣本的74.26%)。根據(jù)測序隨機性分析可知，在基因中序列的分布具有較好的均一性，說明測序樣本的mRNA沒有被降解。

本試驗利用測序飽和度來檢驗紅樹植物秋茄的測序量與檢測到的基因數(shù)量之間的協(xié)同性。在試驗中，當測序量達到60百萬以上時，檢測到的基因數(shù)目趨于飽和。比較對照樣本與重金屬污水脅迫處理樣本的差異發(fā)現(xiàn)，對照樣本的被檢測基因量趨于飽和的曲線比較平緩，重金屬污水脅迫處理樣本的被檢測基因量趨于飽和的曲線相對更快達到飽和。

通過樣品基因覆蓋度的分析可知，對照組樣品基因覆蓋度主要在80%～100%，共39 298個基因，占總基因數(shù)的89.93%；重金屬污水脅迫處理組樣品共有42 140個基因的覆蓋度在80%～100%，占總基因96.43%，這說明物種內(nèi)遺傳變異相對比較保守。另外進一步對對照樣本的差異表達基因與重金屬污水脅迫處理樣本差異表達基因相比較，發(fā)現(xiàn)重金屬污水脅迫處理組樣本的差異表達基因的覆蓋程度更廣泛根據(jù)樣品表達量豐度分布分析可知，對照樣品和重金屬污水脅迫處理樣品的基因表達最集中的區(qū)域在lgx(x表示基因表達量值)的值為0～1.5，而且比較2組不同處理樣本的差異基因表達量，發(fā)現(xiàn)重金屬污水脅迫處理組樣品的差異表達基因的表達量更為豐富。

2.2 差異表達基因篩選

差異基因篩選基于兩組樣本所有基因的表達量值，利用MeV軟件對樣本和基因間的關系進行層級聚類，并使用熱圖來呈現(xiàn)聚類結果。結果表明兩組樣品中部分基因表達量水平有著較大的差異。通過比較對照樣本與重金屬污水脅迫處理樣本基因表達譜，共篩選到3097個表達量發(fā)生顯著變化的基因，其中上調(diào)基因有2 202個，下調(diào)基因895個。進一步，我們通過針對差異基因的火山圖(Volcano plot)分析發(fā)現(xiàn)，差異基因的呈現(xiàn)正態(tài)分布。

2.3 差異表達基因的GO顯著性富集分析

在GO功能顯著性富集分析中，通過與參考基因相比較，將篩選出的差異表達基因富集于不同的GO分類條目中，得到與差異表達基因相關的主要生物學功能分類。通過GO基因功能分類體系對重金屬污水脅迫處理組和對照組間差異表達的基因進行注釋后，發(fā)現(xiàn)38個GO分類條目，其中生物學過程、細胞組分過程和分子功能的相關條目的GO條目分別是19、11、8條，分別占50.00%、28.95%和21.05%。其中生物過程中差異基因的上調(diào)基因2 681個、下調(diào)基因745個；細胞組分過程中差異基因的上調(diào)基因1 442個，下調(diào)基因489個；分子功能中差異基因的上調(diào)基因925個，下調(diào)基因285個。另外我們發(fā)現(xiàn)生物學過程中被注釋的差異表達基因主要包括有機代謝、細胞代謝、初級代謝以及次生代謝等不同代謝過程。與細胞組分相關的差異表達基因主要包括細胞、細胞外組分和細胞內(nèi)組分等。與分子功能有關的差異表達基因主要涉及催化活性、結合活性、和轉(zhuǎn)移酶活性等功能(圖1)。

2.4 差異基因Pathway顯著性富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行注釋和分類，并根據(jù)KEGG pathway富集分析可知差異表達基因主要參與的生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。結果表明秋茄在重金屬污水脅迫處理下的差異表達基因廣泛涉及物質(zhì)代謝、能量代謝和新陳代謝等不同代謝與信號途徑。其中有關核糖體(7.99%)、噬菌體(2.46%)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(5.84%)、DNA復制(2%)、糖類轉(zhuǎn)換(1.69%)、卟啉與葉綠素代謝(2%)、苯丙氨酸代謝(2.15%)、苯丙氨酸合成(3.69%)、類黃酮合成(3.07%)和雙萜類合成(0.77%)的基因大量富集。除了基本代謝途徑外，還有16.28%的基因參與了次生代謝物的生物合成及表達調(diào)控。

2.5 重金屬污水脅迫下的轉(zhuǎn)錄因子分析

在秋茄轉(zhuǎn)錄組注釋信息中，一共鑒定得到了分屬于54個家族的6 460個轉(zhuǎn)錄因子(表2)。通過對這些轉(zhuǎn)錄因子的深入分析，發(fā)現(xiàn)bHLH，MYB，NAC和WRKY是秋茄中成員最多的轉(zhuǎn)錄因子家族。除此之外，其他一些已知與環(huán)境脅迫響應相關的轉(zhuǎn)錄因子家族也都得到了鑒定，如bZIP，ARR-B和ARF等家族。眾多的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游功能基因，形成一個完整的網(wǎng)絡，共同參與秋茄對污水脅迫的響應。

前1條線為對照組;后1條線為重金屬污水脅迫處理組。

轉(zhuǎn)錄因子家族轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量/個上調(diào)數(shù)量/個下調(diào)數(shù)量/個轉(zhuǎn)錄因子家族轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量/個上調(diào)數(shù)量/個下調(diào)數(shù)量/個bHLH658239Dof6561MYB446127E2F/DP5950NAC409239Nin-like5941WRKY373195AP25530B3324127GeBP5020C2H229972NF-YC4121FAR1283112NF-YA4100C3H279143BES13601ERF27697CO-like3610bZIP255225CPP3621G2-like235127STAT3420GRAS20364NF-X13410HD-ZIP19862DBB3221HSF14483BBR-BPC3021HB-oth-er12842WOX3010GATA11264ZF-HD2810S1Fa-like10340ARR-B2411Trihelix10350CAMTA1910LBD9941SRS1810MIKC9640HB-PHD1400M-type9330GRF1110TALE9020RAV1010NF-YB8822LSD900ARF8641EIL700YABBY8421HRT-like610TCP6741Whirly600SBP6732VOZ600

注：轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)量6 460個，上調(diào)基因總數(shù)270個，下調(diào)基因總數(shù)為94個。

2.6 重金屬污水脅迫處理對秋茄中植物激素相關基因表達的調(diào)控

前面根據(jù)KEGG pathway富集分析得知秋茄在重金屬污水脅迫處理下的差異表達基因在植物激素信號轉(zhuǎn)導(5.84%)中富集。而植物激素是植物中的重要化學物質(zhì)，它們參與絕大部分和植物生長發(fā)育和環(huán)境適應相關的生物學過程[15]。通過對秋茄轉(zhuǎn)錄組DEGs的分析，我們發(fā)現(xiàn)了重金屬污水脅迫處理對生長素，乙烯，細胞分裂素，脫落酸，赤霉素和油菜素內(nèi)酯等一系列植物內(nèi)源激素的生物合成，體內(nèi)運輸和信號轉(zhuǎn)導的相關基因都有一定的影響(表3)。

在污水脅迫處理下，生長素運輸載體AUX1基因(Unigene0007561)的表達受到上調(diào)，而一個SAURfamily protein(Unigene0028568)的表達受到顯著抑制。此外，在乙烯信號途徑中，兩個乙烯響應轉(zhuǎn)錄因子ERF1(Unigene0030198)、ERF5(Unigene0041579)都受到誘導。多個細胞分裂素相關的基因得到了鑒定，它們的表達水平都受到污水脅迫處理的誘導，如細胞分裂素水解酶CKX7(Unigene0017080)，type-b響應調(diào)節(jié)子ARR2(Unigene0033740)，一個含有組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)移蛋白AHP1(Unigene0018785)和一個雙組份響應因子ARR5(Unigene0015908)。其中ARR2受到顯著誘導。另一個內(nèi)源細胞分裂素相關基因玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶ZEP(Unigene0000118)在污水脅迫處理下表達水平上升了數(shù)十倍。多個脫落酸基因也得到了鑒定，一個脫落酸不敏感基因ABI5(Unigene0025625)的表達受到顯著的下調(diào)而它的一個受體蛋白編碼基因PYL8(Unigene0016779)受到輕微誘導。有趣的是，油菜素內(nèi)脂的一個信號轉(zhuǎn)導組分基因BSK(Unigene0008986)的表達受到極大的抑制，而油菜素內(nèi)脂受體基因BRI1(Unigene0011111)的表達卻受到極大的誘導，它們的變化都達到幾十倍差異。

表3 激素相關基因在污水脅迫下的表達差異

注：lbx中x表示差異倍數(shù)。

2.7 重金屬污水脅迫處理對秋茄次級代謝重要酶編碼基因的差異表達

前面根據(jù)KEGG pathway富集分析得知秋茄在重金屬污水脅迫處理下的差異表達基因在類黃酮合成(3.07%)和雙萜類合成(0.77%)中富集。我們通過對秋茄轉(zhuǎn)錄組中的DEGs進行KEGG分類發(fā)現(xiàn)，污水脅迫處理可顯著地誘導秋茄中萜類和黃酮類基因的表達，具體見表4。其中，萜類物質(zhì)生物合成的限速酶甲基赤蘚醇磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(Unigene0019445)，牻牛兒基焦磷酸合酶(Unigene0029352)和牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶(Unigene0003919)的表達都受到污水脅迫的誘導。另外，黃酮類生物合成的幾個關鍵酶。如：查爾酮合成酶(Unigene0033021)，黃酮醇合成酶(Unigene0010384)和黃酮醇磺基轉(zhuǎn)移酶(Unigene0007965)的編碼基因表達水平也受到不同程度的誘導，尤其是黃酮醇合成酶的表達顯著提高。

表4 響應污水脅迫的次生代謝相關基因

注：lbx中x表示差異倍數(shù)。

2.8 差異基因的qRT-PCR驗證

為了進一步篩選秋茄污水脅迫響應的關鍵基因，我們對顯著富集的GO分類條目“response to stimulus”(GO:0050896)中的5個差異表達基因進行qRT-PCR分析，以驗證數(shù)字基因表達譜的可靠性。這5個基因分別為：Unigene0006285，Unigene0017050，Unigene0002022，Unigene0007043和Unigene0016871，它們都是植物響應外界刺激的關鍵基因。實驗表明，這5個基因的qRT-PCR結果與數(shù)字基因表達譜中檢測到的表達趨勢有著較高的一致性。上述5個基因的表達都受到污水處理的誘導，其中Unigene0007043被誘導超過10倍以上。

3 結論與討論

在重金屬污水脅迫處理下，紅樹植物秋茄可以通過自身調(diào)控改變基因的表達，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯等不同水平上作出相應的反應，進而調(diào)控不同代謝和信號轉(zhuǎn)導途徑。通過數(shù)字基因表達譜分析在轉(zhuǎn)錄水平上獲得39 480個基因的真實序列信息，大多數(shù)基因的覆蓋率較高，注釋基因的覆蓋度在80%～100%，占總基因96.43%，說明物種內(nèi)基因組的遺傳變異相對保守。根據(jù)注釋基因拷貝數(shù)的不同，可以直接反映相應基因的表達差異結果。進一步分析上述基因的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)3 097個差異表達基因在表達量上發(fā)生顯著的變化，這些基因為我們在分子水平研究紅樹科植物秋茄提供了可能和深入研究秋茄的污水脅迫耐受特性提供了基礎。

相較之于對照樣本，重金屬污水脅迫處理組樣品的差異表達基因表現(xiàn)出廣泛的功能多樣性。根據(jù)GO功能分析，我們發(fā)現(xiàn)差異表達基因涉及的范圍十分廣，幾乎包括整一個生物生化過程，其中還包括糖類、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子以及各種分子功能，這說明秋茄的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是一個高度靈敏的開放式表達調(diào)控體系，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是秋茄污水脅迫耐受性的遺傳基礎。通過對GO分類的深入研究，我們發(fā)現(xiàn)“response to stimulus”(GO:0050896)相關基因的表達在對照與處理樣本之間存在顯著差異。其中，164個環(huán)境刺激響應基因顯著上調(diào)，68個基因顯著下調(diào)。通過對五個隨機選擇的環(huán)境刺激響應基因的qRT-PCR檢測，我們驗證了上述差異的可靠性。污水脅迫作為一種強烈的環(huán)境刺激，秋茄可能通過調(diào)控大量刺激響應基因的表達來實現(xiàn)增強對污水脅迫的耐受性。

污水中含有大量氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)，秋茄可以通過吸收污水中的營養(yǎng)物質(zhì)以供自身生長發(fā)育[16]。許多有關重金屬污水脅迫處理秋茄方面的研究表明，低濃度重金屬污水脅迫處理下可以促進紅樹植物的生長，在一定程度內(nèi)，隨著污水脅迫濃度增加促進作用加強；達到頂點后，隨著污水脅迫濃度升高促進作用下降，最后抑制紅樹植物的生長[8]。這表明，隨著污水脅迫濃度的升高，重金屬的毒害作用超過了營養(yǎng)物質(zhì)的促進作用。進一步研究重金屬對紅樹植物生理代謝的影響發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過正常濃度重金屬污水脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)秋茄等紅樹植物的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等抗氧化酶系統(tǒng)的活力得到了提高，說明秋茄等紅樹植物本身具有一定的污染耐受性[17]。本試驗通過KEGG Pathway富集分析數(shù)據(jù)可知，大量差異表達基因與植物激素信號(生長素，乙烯，細胞分裂素，脫落酸，赤霉素和油菜素內(nèi)酯)及次生代謝調(diào)控(黃酮類、萜類、卟琳)等有關，表明紅樹植物可能通過改變體內(nèi)植物激素的生物合成、體內(nèi)運輸和信號轉(zhuǎn)導，并增加次生代謝物的積累來抵抗污水脅迫。大量研究表明，植物激素參與植物的抗逆反應[18]。針對秋茄轉(zhuǎn)錄組的分析，得到了一系列激素相關基因的編碼和轉(zhuǎn)錄差異信息，這為我們分析激素參與秋茄重金屬污水脅迫耐受性形成的分子機制打下了基礎。在模式植物中，生長素運輸載體參與植物激素與脅迫響應的機制得到了初步揭示。在鹽和干旱脅迫下，水稻的LAX和ABCB家族基因普遍上調(diào)，這與秋茄中的AUX1(Unigene0007561)的表達差異相一致[19]。在擬南芥和苜蓿中，鎘、銅或者汞脅迫顯著誘導了ERF家族基因的表達[20-21]。本研究中，2個乙烯響應轉(zhuǎn)錄因子ERF1(Unigene0030198)、ERF5(Unigene0041579)都受到誘導，這與模式植物的表達情況一致。細胞分裂素具有促進細胞分裂的作用，在擬南芥中，細胞分裂素相關基因type-b響應調(diào)節(jié)因子ARR2基因的過量表達促進了主根的生長和下胚軸的伸長[22]，而本研究中，秋茄的type-b響應調(diào)節(jié)因子ARR2基因(Unigene0033740)在重金屬脅迫下被顯著誘導，說明脅迫可能促進根細胞的增殖，以此來緩解脅迫帶來的影響。在擬南芥中，脫落酸受體蛋白PYL5被證實與植物的環(huán)境脅迫抗性有關，而另一個脫落酸受體蛋白PYL4則通過茉莉酸信號途徑來發(fā)揮其功能[23-24]。在我們的研究中，秋茄的脫落酸受體蛋白PYL8得到了鑒定，它的表達受到污水脅迫處理的誘導，這說明脫落酸也參與了秋茄對污水脅迫的響應。此外，在植物組織的非酶抗氧化系統(tǒng)中，類黃酮發(fā)揮重要的作用，可以清除植物體內(nèi)的自由基和抑制脂質(zhì)的過氧化，類黃酮化合物的積累與代謝對植物產(chǎn)生應答逆境脅迫具有重要的作用[25]。本研究中類黃酮合成酶基因及萜類合成酶基因表達增加，特別是黃酮醇合成酶(Unigene0010384)和牻牛兒基焦磷酸合酶(Unigene0029352)受到顯著誘導，這些基因的誘導表達能夠促進秋茄萜類、類黃酮類等次級代謝產(chǎn)物的積累。這些化學成分具有滲透調(diào)節(jié)、清除自由基等功能，有利于秋茄適應重金屬脅迫。

眾多的轉(zhuǎn)錄因子家族參與了植物環(huán)境脅迫的快速響應[26]。在擬南芥中，鎘脅迫誘導了許多轉(zhuǎn)錄組因子的表達，其中主要包括bHLH，WRKY，MYB和AP2/EREBP等家族[27]。水稻中過量的銅離子影響WRKY,MYB和NAC等基因的表達量，這些基因參與了銅毒害的耐受性[28]。在小麥中，TabHLH13的全長序列得到了克隆，它的表達水平在鹽，PEG，低溫脅迫等處理下，表現(xiàn)出顯著的差異[29]。秋茄轉(zhuǎn)錄組中注釋為bHLH家族的成員多達658個，大大超過擬南芥的140個和水稻的160個，這說明秋茄的基因組具有更高的復雜性[30]。從陸地棉晉棉—19中分離到了6個NAC型脅迫相關轉(zhuǎn)錄因子GhNAC1-GhNAC6，它們在非生物脅迫的信號調(diào)控中起著重要的作用[31]。而秋茄中，第二大的轉(zhuǎn)錄因子家族NAC也有446個成員得到了初步的分析。WRKY53在鎘處理的遏藍菜中差異表達，這個基因也能被鹽脅迫和旱脅迫調(diào)控，同時參與脅迫相關的信號傳導途徑[32]。同時，WRKY在麻風樹響應鎘脅迫中發(fā)揮重要作用[33]。依據(jù)秋茄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，一共373個WRKY家族成員得到了鑒定。這些都在一定程度上說明bHLH，MYB，NAC和WRKY在秋茄響應重金屬脅迫中發(fā)揮重要作用。本試驗分析得到的轉(zhuǎn)錄因子家族成員為未來進一步深入研究提供了一定的候選基因，為揭示秋茄污水脅迫耐受性形成的分析機制打下了基礎。

總結而言，通過對秋茄進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，比較了污水處理組和對照組之間的差異，我們發(fā)現(xiàn)大量與生長發(fā)育，代謝調(diào)控，環(huán)境刺激響應相關的基因及代謝途徑參與了秋茄對污水脅迫的響應。以上研究結果初步探討了重金屬污染脅迫對秋茄次級代謝和生長發(fā)育調(diào)控的分子機制，也表明了秋茄對重金屬脅迫響應機制的復雜性。對其中一些關鍵基因進行深入研究將有助于全面了解其分子機制，并進一步通過基因工程手段推動植物修復的發(fā)展。

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Yuan Liujiao, Fu Mengni, Yu Rufeng, Li Haili, Yuan Changchun, Chen Yan, Liu Kaidong(Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, P. R. China)//

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Kandelia candel; Heavy metals; Sewage treatment; Digital gene expression profiling; Differential expressed gene

1)廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目(2013KJCX011-03，2015KJCX025)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201510579277)；嶺南師范學院自然科學研究項目(LZL1507)；嶺南師范學院協(xié)同創(chuàng)新中心項目(CIL1503)；湛江市熱帶特色資源植物技術開發(fā)重點實驗室項目(2014A06008)。

袁柳嬌，女，1997年3月生，嶺南師范學院生命科學與技術學院，在讀本科生。E-mail:415592550@qq.com。

劉鍇棟，嶺南師范學院生命科學與技術學院，副研究員。E-mail:liukaidong2001@126.com。

2016年8月25日。

S718.4

責任編輯：潘 華。