李巧云++張志剛++趙智中++劉栓桃++王立華++高會超++李溢真++徐文玲++劉賢嫻++劉辰

究

摘要：分別以大白菜TuMV國家級抗源材料8407和高感TuMV的核心種質(zhì)材料冠291為親本構(gòu)建分離群體，為驗(yàn)證TuMV抗性基因TuRBCS01兩側(cè)緊密連鎖的分子標(biāo)記mBr4055和BrID10723的檢測準(zhǔn)確率，對上述兩個親本F2代分離群體的107個單株進(jìn)行自交構(gòu)建F2∶3家系，并對每個家系的TuMV抗性進(jìn)行鑒定，以判斷原F2單株的TuMV抗性及基因型，同時利用上述兩個標(biāo)記引物對F2代107個單株進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果及抗病性鑒定結(jié)果計(jì)算標(biāo)記檢測的準(zhǔn)確率。結(jié)果表明，兩標(biāo)記均檢測為純合抗病的株系有22株，其中有2株經(jīng)抗病性驗(yàn)證為雜合抗病，其余均為純合抗病，檢測準(zhǔn)確率為90.9%；兩標(biāo)記均檢測為雜合抗病的有48株，經(jīng)抗病性驗(yàn)證，其中5株為純合抗病，5株為純合感病，其余均為雜合抗病，檢測準(zhǔn)確率為79.2%；兩標(biāo)記均檢測為純合感病的有23株，經(jīng)抗病性驗(yàn)證，其中4株為雜合抗病，1株為純合抗病，鑒定準(zhǔn)確率為78.3%。上述檢測結(jié)果為更好地利用標(biāo)記mBr4055和BrID10723進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大白菜；TuMV；抗性基因；分子標(biāo)記應(yīng)用

中圖分類號：S634.103.6文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）02-0010-05

大白菜是我國的重要蔬菜，病毒病是危害我國大白菜生產(chǎn)的主要病害，其中，蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus， 簡稱TuMV）是主要病原[1]。傳統(tǒng)的大白菜抗TuMV育種方法周期長、效率低、選擇準(zhǔn)確性差，利用分子標(biāo)記輔助選擇可大大加快育種進(jìn)程，提高選擇效率和準(zhǔn)確率。

近年來，國內(nèi)外已開展了一些與大白菜TuMV抗性相關(guān)的分子標(biāo)記研究。閆瑾琦[2]篩選到2個與大白菜抗TuMV基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記，連鎖距離分別為9.5 cM和15.36 cM。韓和平等[3]采用AFLP方法，篩選到2個與大白菜TuMV感病基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記，連鎖距離分別為7.5 cM和8.4 cM。張俊華等[4]篩選出2個與大白菜TuMV抗病基因連鎖的EST-PCR-AFLP標(biāo)記，連鎖距離均為6.5 cM。張曉偉等[5]采用多模型QTL作圖的方法，檢測到3個與大白菜抗TuMV相關(guān)的QTLs （Tu-1、Tu-2和Tu-3）， AFLP標(biāo)記E36M47-7 （2.9 cM）、E33M60-5 （0.5 cM） 和E36M59-5 （2.4 cM） 分別與上述三個QTLs連鎖。Rusholme 等[6]的研究表明，RFLP標(biāo)記pN202e1與定位在大白菜4號染色體上的隱性TuMV抗性基因retr01共分離；RFLP標(biāo)記pO52e2 和 pO85e1與定位在大白菜8號染色體上的顯性TuMV抗性基因ConTR01共分離。Qian等[7]報(bào)道，Indel標(biāo)記BrID10694 （0.3 cM）和 BrID101309 （0.6 cM）與大白菜隱性TuMV抗性基因retr02緊密連鎖，且分別位于該基因的兩側(cè)。Jin等[8]的研究結(jié)果顯示，SSR標(biāo)記H132A24-s1 （0.2 cM）和KS10960 （0.6 cM）分別與大白菜顯性TuMV抗性基因TuRB07緊密連鎖并位于該基因的兩側(cè)。本課題組鑒定出了兩個大白菜TuMV抗性基因——隱性TuMV抗性基因retr02[9] 和顯性TuMV抗性基因TuRBCS01[11]，篩選到一個與retr02緊密連鎖的SSR標(biāo)記HCC259（3.8 cM）[12]和9個與TuRBCS01緊密連鎖的SSR或InDel標(biāo)記，其中SSR標(biāo)記mBr4055和InDel標(biāo)記BrID10723分別位于TuRBCS01基因的兩側(cè)，與該基因的連鎖距離分別為0.6 cM和1.3 cM[13]。

對分子標(biāo)記檢測準(zhǔn)確率的研究，有利于更好地將其用于分子標(biāo)記輔助選擇。Piao等[14]的研究表明，與大白菜抗根腫病基因CRb緊密連鎖的共顯性標(biāo)記 TCR01 能夠準(zhǔn)確鑒定出純合抗性植株。張晶等[15]利用小麥春化基因特異性標(biāo)記Vrn-D1對石麥 12 與石家莊 8 號雜交后代 F2∶3株系進(jìn)行冬、春性鑒定，結(jié)果與表型鑒定結(jié)果一致。焦荻等[16]利用西瓜抗枯萎病基因SNP標(biāo)記，對兩個四倍體西瓜材料（易感病的 NF3 為受體，抗病的 JH 為供體）回交后自交群體BC1F2代673 個單株進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，檢測到的純合基因型抗病單株與表型鑒定結(jié)果一致。目前，尚未見利用大白菜抗TuMV分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇技術(shù)研究的報(bào)道。

本研究通過構(gòu)建大白菜抗TuMV材料8407和感病材料冠291的F2∶3家系，對每個F2∶3家系的TuMV抗性進(jìn)行鑒定，進(jìn)而判斷原F2代單株的TuMV抗性及基因型，結(jié)合標(biāo)記檢測結(jié)果，對標(biāo)記檢測的準(zhǔn)確率進(jìn)行分析，旨在為利用大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01兩側(cè)緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行該基因的輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與毒源

抗病親本材料為大白菜TuMV國家級抗源材料8407，感病親本材料為高感TuMV的核心種質(zhì)材料冠291，以兩親本構(gòu)建的F2代107個單株及F2代單株自交構(gòu)建的F2∶3家系為研究對象，用于大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)研究。

將上述材料播種于直徑7～8 cm的營養(yǎng)缽中，選用德國大漢（Klasmann-Deilmann）泥炭營養(yǎng)土育苗培養(yǎng)，人工氣候室溫度為25℃，濕度40%～60%，光照強(qiáng)度9 000～10 000 lx，光照時間每天11.5 h。

毒源為引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所的TuMV-C4株系，接種前一個月在感病材料上繁毒，病葉用于接種親本對照及試驗(yàn)材料。

1.2基因組DNA提取

采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒對大白菜F2代107個單株樣品的基因組DNA進(jìn)行提取，具體步驟如下：

（1）取滅菌的2 mL EP管，每管加入直徑為3 mm陶瓷珠4個，稱取供試樣品新鮮幼嫩葉片0.1 g，置于EP管中，加入液氮充分研磨。（2）加入400 μL緩沖液FP1和RNase A （10 mg/mL） 6 μL，渦旋振蕩1 min，室溫放置10 min。（3）加入130 μL緩沖液FP2，充分混勻，渦旋振蕩1 min。（4）12 000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。（5）向上清液中加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻，此時會出現(xiàn)絮狀基因組DNA。12 000 r/min離心2 min，棄上清，保留沉淀。（6）加入70%乙醇600 μL，渦旋振蕩5 s，12 000 r/min離心2 min，棄上清。（7）重復(fù)步驟6。（8）開蓋倒置，室溫靜置5～10 min，徹底晾干殘余的乙醇。（9）加入適量洗脫緩沖液TE，65℃水浴10～60 min溶解DNA，其間顛倒混勻數(shù)次助溶，最終得到DNA溶液。

用分光光度計(jì)測定所提取DNA的濃度和純度，并用1%瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測。使用前用去離子水將其稀釋至70 ng/μL。

1.3引物序列

試驗(yàn)所用引物為基因TuRBCS01兩端的SSR標(biāo)記mBr4055和InDel標(biāo)記BrID10723，其中引物mBr4055的上下游序列分別為5′-GGGTTCTCGGCTACTGGACT-3′和5′-TCATCATGAGACACATCCTCTCC -3′，引物BrID10723的上下游序列分別為5′-GCTTTCCTCGTGTCATTAGA-3′和5′-CTTTCCGAGTTTCCATAGTG -3′。

1.4PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增在美國ABI SimpliAmp PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增體系為10 μL：2×Taq Master Mix 5 μL，0.5 μmol/L正向引物1 μL，0.5 μmol/L反向引物1 μL，模板DNA（濃度為70 ng/μL）1 μL；雙蒸水（ddH2O）2 μL。PCR擴(kuò)增程序： 95℃預(yù)變性4 min；94℃變性60 s，退火45 s（退火溫度需要隨著擴(kuò)增引物的變更而進(jìn)行調(diào)整），72℃延伸45 s，此過程共進(jìn)行30個循環(huán)（循環(huán)數(shù)也可根據(jù)PCR擴(kuò)增引物的不同而進(jìn)行微調(diào)）；72℃延伸10 min，PAGE檢測或4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ粜鑼CR產(chǎn)物隔夜放置，可將其置于-20℃條件下保存。

1.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

采用濃度為8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（29∶1）對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。所用電泳儀為美國Labnet International公司Power Station200型，電泳槽為北京六一的DYCZ-24B型。175～190 V恒壓電泳1.5～3.0 h。銀染檢測電泳結(jié)果。

1.6病毒接種

待大白菜苗長至三葉一心時，采用摩擦接種法，對上述試驗(yàn)材料及對照接種TuMV-C4，具體方法參見李巧云等[10]的方法，三周后進(jìn)行抗病性調(diào)查鑒定。

1.7抗病性鑒定

采用生物學(xué)觀察法對F2∶3家系的TuMV抗性進(jìn)行鑒定，單株病級及病情指數(shù)的計(jì)算方法參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19557.5—2004，根據(jù)F2∶3家系的病情指數(shù)判斷原F2單株的抗性，進(jìn)而推測該單株的基因型。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

與親本8407擴(kuò)增帶型一致的單株基因型記為A；與親本冠291擴(kuò)增帶型一致的單株基因型記為B；雜合帶型記為H。F2單株的TuMV抗性根據(jù)F2∶3株系的病情指數(shù)來判斷，病情指數(shù)為“0”的，單株基因型記為AA；病情指數(shù)在0～55.55之間的，單株基因型記為Aa；病情指數(shù)在55.55以上的，單株基因型記為aa。根據(jù)單株抗病性鑒定和PCR擴(kuò)增結(jié)果，分析基因TuRBCS01兩側(cè)標(biāo)記mBr4055和BrID10723的檢測準(zhǔn)確率。

2結(jié)果與分析

2.1大白菜基因組DNA提取

提取的樣品基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖膠電泳檢測無拖尾現(xiàn)象（圖1），分光光度計(jì)測定其OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，說明DNA提取質(zhì)量較高，可用于PCR擴(kuò)增。

M：DNA Marker；1～10：部分大白菜F2代單株

3討論與結(jié)論

對于那些性狀鑒定受多種因素影響、難以在F2代或BC1代確保單株性狀鑒定準(zhǔn)確無誤的標(biāo)記，為了更好地用于分子標(biāo)記輔助選擇，有必要進(jìn)一步通過F2∶3家系的性狀鑒定驗(yàn)證其鑒定準(zhǔn)確率。

張晶[15]、焦荻[16]等分別利用F2：3家系和BC1F2代對標(biāo)記的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。Piao等[14]利用與大白菜根腫病抗性基因CRb緊密連鎖的共顯性標(biāo)記TCR01和TCR05檢測37個根腫病抗性品種和10個非根腫病抗性品種，結(jié)果表明，擴(kuò)出標(biāo)記條帶TCR01200和TCR05279的18個品種均為抗病品種，而沒有擴(kuò)出上述兩條帶的品種，有的是抗病品種，有的不是抗病品種。表明標(biāo)記TCR01和TCR05可選擇性地用于抗病品種的篩選。

本研究通過對大白菜抗TuMV材料8407和感病材料冠291的F2∶3家系的性狀鑒定確定原F2單株的基因型，結(jié)合基因TuRBCS01兩側(cè)標(biāo)記mBr4055和BrID10723的單株擴(kuò)增，檢測兩標(biāo)記對F2代單株的鑒定準(zhǔn)確率。結(jié)果表明，利用兩標(biāo)記檢測純合抗病株，效果最好，檢測準(zhǔn)確率為90.9%；其次是雜合抗病株和純合感病株，檢測準(zhǔn)確率分別為79.2%和78.3%。上述檢測結(jié)果為更好地利用以上兩標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2016-11-23

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-07-13.5-A11）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系雜糧創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)（SDAIT-15-03）；山東省重大科技專項(xiàng)（2015ZDJS03001-2）

作者簡介：于淑婷（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣茸釉耘嗌?。E-mail：yust1123@126.com

通訊作者：管延安（1965-）