尹小平，趙姍姍，劉 丹，田延河，巴特爾，程天立，張江國，王遠(yuǎn)志

從中哈邊境亞洲璃眼蜱中檢測(cè)到弗朗西斯氏菌樣內(nèi)共生體核酸

尹小平1，趙姍姍2，劉 丹2，田延河1，巴特爾1，程天立1，張江國1，王遠(yuǎn)志2

目的 對(duì)中哈邊境鐵路線區(qū)域的亞洲璃眼蜱中弗朗西斯菌屬及內(nèi)共生體檢測(cè)。方法 2015年在中哈邊境采集的游離蜱進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子學(xué)鑒定后，擴(kuò)增弗朗西斯菌屬及共生體16SrRNA和sdhA基因，對(duì)陽性產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行Blast分析，用Mega 6.0構(gòu)建分子遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果 對(duì)243只游離蜱經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子學(xué)鑒定為亞洲璃眼蜱后，經(jīng)PCR病原學(xué)檢測(cè)及測(cè)序得到35份(只)陽性，陽性率為14.4%。分析得到兩株(Seq1和Seq2)不同基因型的序列，遺傳進(jìn)化樹顯示，這兩株弗朗西斯菌屬內(nèi)共生體聚到1支，未檢測(cè)到土拉弗朗西斯菌。結(jié)論 在中哈邊境鐵路線區(qū)域亞洲璃眼蜱中首次檢測(cè)到弗朗西斯菌樣核酸。

亞洲璃眼蜱；PCR；弗朗西斯菌；中哈邊境

General administration of quality supervision, inspection and quarantine technology fund project (2016 lk264)

Corresponding auther:Wang Youn-zhi,Email:wangyouzhi621@126.com

弗朗西斯氏菌科包括弗朗西斯氏菌屬以及弗朗西斯氏菌樣內(nèi)共生體(Francisella-like endosymbionts, FLEs)。目前已知弗朗西斯氏菌可以感染大約150種脊椎動(dòng)物，在自然環(huán)境中也與無脊椎動(dòng)物相關(guān)，并且它可以在水或者泥土中至少一年。因?yàn)檫@種宿主的廣泛性阻礙了人們對(duì)它的生態(tài)學(xué)與流行病學(xué)認(rèn)識(shí)[1-2]。土拉弗朗西斯菌(F.tularensis，土拉菌)，作為弗朗西斯氏菌屬一種，因?yàn)榫哂休^強(qiáng)傳染性的胞內(nèi)寄生菌，能夠引起人和動(dòng)物土拉熱，也叫野兔熱，是一種自然疫源性疾病，并呈世界性分布[3]。該菌具有傳播途徑多樣性(主要通過媒介節(jié)肢動(dòng)物，如蜱等在哺乳動(dòng)物和人之間傳播)、感染計(jì)量低、致病性強(qiáng)的特征，因此被列為與鼠疫、炭疽等同的A類恐怖病原。中哈邊境線全長約1 700 km，均與哈薩克斯坦東部、巴爾喀什湖的東南部大沙鼠鼠疫自然疫源地毗鄰[4]，也是各類蜱種的高發(fā)分布區(qū)。目前主要有7個(gè)口岸分別行使國家相關(guān)主權(quán)。為保障國家“一帶一路”戰(zhàn)略的實(shí)施與安全，近年來阿拉山口檢驗(yàn)檢疫局采用PCR檢測(cè)技術(shù)，已在蜱類中檢測(cè)出多種病原。但其是否攜帶弗朗西斯氏菌、土拉弗朗西斯菌的情況不清，因此本研究對(duì)該地區(qū)采集的游離蜱進(jìn)行了該病原的核酸檢測(cè)，以期預(yù)測(cè)、評(píng)估該區(qū)疫情存在的危害風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與鑒定 2015年3～9月在中哈邊境鐵路線兩側(cè)區(qū)選擇3個(gè)地段監(jiān)測(cè)點(diǎn)，用人工誘捕法采集游離蜱，將活體蜱裝入透析的試管瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室。用體式顯微鏡參照《新疆蜱類志》進(jìn)行種類鑒定。

1.2 DNA提取 每只蜱一管，采用梯度酒精(90%、70%、50%、30%、無菌蒸餾水)清洗30 min，隨后取出放置在無菌濾紙上吸取多余的無菌蒸餾水。最后放置在無菌EP管中碾磨后按DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說明書，提取基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分子學(xué)檢測(cè)與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 PCR擴(kuò)增蜱16SrRNA基因[5]。根據(jù)弗朗西斯菌特異性引物Fr153/Fr1281PCR擴(kuò)增部分16SrRNA基因，陽性進(jìn)一步擴(kuò)增弗朗西斯菌部分sdhA基因[1-2]。選取陽性樣本送上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast分析，用Mega 6.0構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹分析。

2 結(jié) 果

2.1 蜱種鑒定：共采集243只游離蜱，經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子學(xué)鑒定為亞洲璃眼蜱，見圖1。

圖1 亞洲璃眼蜱Fig.1 H.asiaticum asiaticum

2.2 分子學(xué)檢測(cè)：經(jīng)PCR擴(kuò)增，游離蜱243只中有35份檢測(cè)到弗朗西斯菌16SrRNA和sdhA陽性片段，陽性率為14.4%(35/243)。測(cè)序DNAMAN分析得到兩株(Seq1和Seq2)基因型不同的序列，16SrRNA的同源性為99.9%和sdhA的同源性為99.7%。Blast分析16SrRNA基因顯示Seq1與Seq2，分別與來自日本鈍緣蜱屬中的Ornithodorosmoubata(AB001522)同源性最高為99.4%(1 162/1 169)和99.5%(1 163/1 169)；sdhA基因顯示Seq1與Seq2分別與來自埃塞俄比亞的璃眼蜱屬Hyalommarufipes(KJ864964)的同源性最高為98.3%(285/290)和98.6%(286/290)。基于16SrRNA遺傳進(jìn)化樹顯示，來自中哈邊境鐵路線鐵路線區(qū)的亞洲璃眼蜱中的弗朗西斯菌單獨(dú)聚為一支，并且與來自其他國家蜱中檢測(cè)的弗朗西斯菌樣內(nèi)共生體聚在同一大支上(圖2)。所有序列已上傳至GenBank，16SrRNA：KX852464、KX852466和sdhA：KX852472、KX852473。

3 討 論

蜱是一類吸血的節(jié)肢動(dòng)物，屬寄螨目、蜱總科。目前世界上已知蜱類應(yīng)為895種,包括軟蜱科Argasidae 189種、硬蜱科Ixodidae 705種、納蜱科Nuttalliellidae 1種, 中國已知蜱類119種,包括軟蜱科13種(銳緣蜱屬Argas 7種、敗蜱屬Carios 4種、鈍緣蜱屬Ornithodoros 2種)、硬蜱科104種(硬蜱屬Ixodes 24種、花蜱屬Amblyomma 8種、血蜱屬Haemaphysalis 44種、異扇蜱屬Anomalohimalaya 2種、璃眼蜱屬Hyalomma 7種、革蜱屬Dermacentor 12種、扇頭蜱屬Rhipicephalus 8種)。新疆至1995年已發(fā)現(xiàn)2科9屬45種(亞種)，其中璃眼蜱屬包括麻點(diǎn)璃眼蜱、小亞璃眼蜱、嗜駝璃眼蜱、亞洲璃眼蜱、亞東璃眼蜱、殘緣璃眼蜱和盾糙璃眼蜱7種[6]。亞洲璃眼蜱廣泛分布于新疆荒漠或半荒漠地區(qū)為三宿主蜱，也是中哈邊境地區(qū)廣泛分布的優(yōu)勢(shì)種，并也寄生于家畜與小型哺乳動(dòng)物體表的重要種類[4]?，F(xiàn)已從該蜱中檢測(cè)到多種病原體，如新疆出血熱、Q熱、北亞蜱媒斑點(diǎn)熱、蜱媒腦炎、鼠疫、流行性斑疹傷寒、布魯氏菌病、立克次體、萊姆病、巴貝斯蟲等，具有重要的醫(yī)學(xué)意義。

本次在亞洲璃眼蜱中首次檢測(cè)到的弗朗西斯菌樣內(nèi)共生體，該菌廣泛分布在蜱中，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)在革蜱屬、璃眼蜱屬、硬蜱屬、鈍緣蜱屬以及花蜱屬均有報(bào)道，并且分布范圍，除大洋洲與南極洲外均見報(bào)道，如泰國、日本、美國、加拿大、厄瓜多爾、納米比亞、埃塞俄比亞、保加利亞、匈牙利以及法國[2]?；c16SrRNA遺傳進(jìn)化樹顯示在亞洲璃眼蜱中檢測(cè)到的弗朗西斯菌樣內(nèi)共生體單獨(dú)聚為一支，與其他蜱中檢測(cè)到的內(nèi)共生體存在差異，顯示該菌的多樣性及與宿主間的相互進(jìn)化關(guān)系。目前，由于sdhA還未廣泛應(yīng)用于FLE的研究，所以沒有關(guān)于該基因的綜合的分析，有待進(jìn)一步研究。本次在亞洲璃眼蜱中雖未檢測(cè)到土拉弗朗西斯菌，但該菌在新疆地區(qū)分布廣泛，曾在邊緣革蜱以及草原革蜱中分離出病原[7-8]。血清學(xué)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)新疆西北地區(qū)多個(gè)縣包括博樂地區(qū)，人及家畜都存在該病原的抗體血清陽性的報(bào)道[8]。目前在美國、日本、俄羅斯、土耳其、西班牙、瑞士、瑞典、德國等國家均有報(bào)

注:▲本區(qū)陽性株圖2 弗朗西斯氏菌屬及弗朗西斯氏菌樣內(nèi)共生體的16S rRNA遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Francisella and Francis endosymbiont of 16 S rRNA genetic evolutionary tree

道。在中國，土拉弗朗西斯菌最早于1957年從黃鼠體內(nèi)分離得到，1959年黑龍江報(bào)道了第一起人感染“野兔熱”，隨后證實(shí)西藏、新疆、甘肅、青海、內(nèi)蒙古等地也存在土拉菌病的自然疫源地[3,9]。弗朗西斯氏菌科的另一大屬，由于它們存在于蜱中并且有能力與土拉弗朗西斯菌交叉反應(yīng)，在大多數(shù)傳統(tǒng)的分子檢測(cè)技術(shù)中可能導(dǎo)致誤診[1]弗朗西斯氏菌樣內(nèi)共生體作為含有當(dāng)前未知病原潛力的支廣泛分布在硬蜱與軟蜱中，這些都提示我們應(yīng)提高警惕。

[1] Barns SM, Grow CC, Okinaka RT, et al. Detection of diverse newFrancisella-like bacteria in environmental samples.[J]. App Environmental Microbiol, 2005, 71(9):5494-500.

[2] Szigeti A, Kreizinger Z, Hornok S, et al. Detection ofFrancisella-like endosymbiont inHyalommarufipesfromEthiopia.[J]. Ticks and Tick-borne Dis, 2014, 5(6):818-820.

[3] Wang ZD, Jing YY, Wang J. Research progress onFrancisellatularensisdetection [J]. Prog Mod Biomed, 2009, 9(14):2763-2765. (in Chinese)

王振東, 景瀅瀅, 王靜. 土拉弗朗西斯菌檢測(cè)研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009, 9(14):2763-2765.

[4] Yin XP, Ye ZH, Jiao W, et al. Tick fauna and monitoring of tick host animals at Alataw Pass [J]. Chin J Vector Biol Control, 2010, 21(4):375-377. (in Chinese)

尹小平, 葉志輝, 驕娃,等. 阿拉山口口岸地區(qū)蜱類區(qū)系調(diào)查及宿主動(dòng)物染帶關(guān)系監(jiān)測(cè)分析[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志, 2010, 21(4):375-377.

[5] Th BW, Piesman J. Phylogeny of hard-and soft-tick taxa (Acari: Ixodida) based on mitochondrial 16SrDNA sequences.[J]. Pro Nati Acad Sci United States of America, 1994, 91(21):10034.

[6] Yu X, Ye RY, Gong ZD. The ticks fauna of Xinjiang [M]. Urumqi: Xinjiang Scientific, Technological and Medical Publishing House, 1997:1-3. (in Chinese)

于心, 葉瑞玉, 龔正達(dá).新疆蜱類志[M].烏魯木齊: 新疆科技衛(wèi)生出版社 , 1997:1-3.

[7] Zong DG, Jiang YX, Liang JS, et al. The report aboutFrancisellatularensisin Wenquan, Xingjiang [J]. Chin J Zoonose, 1988, 4(6):40-41. (in Chinese)

宗定國, 蔣岳新, 梁繼山,等. 新疆溫泉縣土拉菌病調(diào)查報(bào)告[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 1988, 4(6):40-41.

[8] Kong ZM, Chen GS, Jin GY, et al. A study about the natural foci from ticks-borne disease in Xinjiang [J]. Bull Dis Control Prev,1987, 2(3):1-4. (in Chinese)

孔昭敏, 陳國仕, 金根源,等. 新疆蜱媒自然疫源性疾病的調(diào)查研究[J]. 疾病預(yù)防控制通報(bào), 1987, 2(3):1-4.

[9] Wang Y, Hai R, Zhang Z, et al. Genetic relationship betweenFrancisellatularensisstrains from China and from other countries[J]. Biomed Environ Sci, 2011, 24(3):310-314.

First detection ofFrancisella-like endosymbionts inHyalommaasiaticumasiaticumfrom China-Kazakhstan border

YIN Xiao-ping1, ZHAO Shan-shan2, LIU Dan2, TIAN Yan-he1, BA Te-er1, CHENG Tian-li1, ZHANG Jiang-guo1, WANG Yuan-zhi2

(1.alashankouinspectionandquarantinebureauAlashankou, 833418,Shihezi,shiheziuniversity, 832000)
2.ShiheziUniversity,Shihezi832000)

We conducted the detection theFrancisellaspp. nucle acid fromHyalommaasiaticumasiaticumthat main distribution is on railway line area from China-Kazakhstan border.The free-living ticks were collected and then identified by morphological and molecular methods. After species identification,they were detected by PCR targeting 16SrRNA andsdhAofFrancisellaspp.The amplified products were sequenced and the sequences was analyzed by using the Blast. A phylogenetic tree was constructed using MEGA 6 software.A total of 243 fleas were identified asH.asiaticumasiaticum. Only 35 samples were detected forFrancisellaspp. positive and the positive rate was 14.4%. Sequence analysis showed that two different sequences (seq1 and seq2) and all belong toFrancisella-like endosymbionts (FLEs). Phylogenetic analyses showed that two FLEs were belong to the same cladd.This is first detection of FLEs nucleic acid fromH.asiaticumRailway line area of China-Kazakhstan border.

Hyalommaasiaticumasiaticum; PCR;Francisellaspp.; China-Kazakh border

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.014

國家質(zhì)檢總局科技基金項(xiàng)目(No.2016lk264)資助

王遠(yuǎn)志，Email：wangyuanzhi621@126.com

1.中華人民共和國阿拉山口出入境檢驗(yàn)檢疫局，阿拉山 833418；

2.石河子大學(xué)，石河子 832000

R378

A

1002-2694(2017)02-0170-03

2016-08-25 編輯：李友松