雷盛欽+胡水婷+程麗+黃小燕

[摘要]目的 探討低劑量脂多糖（LPS）刺激對(duì)哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-17的影響及其機(jī)制。方法 復(fù)制哮喘小鼠模型，體外分離培養(yǎng)脾臟來源的T淋巴細(xì)胞，分為對(duì)照組和LPS組，其中LPS組又分為LPS1組和LPS2組，分別以1、2 ng/ml的LPS體外刺激T細(xì)胞72 h。對(duì)照組以生理鹽水代替LPS。采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-17水平，觀察IL-17的水平濃度變化。結(jié)果 以低劑量LPS刺激哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞后，其培養(yǎng)上清液中IL-17的水平較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 低劑量LPS可以抑制哮喘T細(xì)胞IL-17的分泌，可能與機(jī)體的免疫耐受相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]脂多糖；哮喘小鼠；T細(xì)胞；白介素-17

[中圖分類號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）01（c）-0120-03

[Abstract]Objective To explore the influence of LPS with low dosage on the secretion of IL-17 and the potential mechanism.Methods The asthma mouse model was copied successfully and the T cells from spleen were isolated and cultured in vitro，and the mice were divided into the control group and the LPS group.The mice in LPS group were divided into the LPS group 1 and the LPS group 2，and were stimulated with 1，2 ng/ml LPS respectively for 72 hours.The control group was stimulated with the same volume of saline.The concentrations of IL-17 in the supernatant were detected with ELISA，the change of concentration of IL-17 was observed.Results After stimulation with lower dosages of LPS，the secretion of IL-17 in the supernatant decreased significantly in the LPS groups than that in the control group，with significant difference （P<0.01）.Conclusion Low dosage of LPS can inhibit the secretion of IL-17 in T cells of asthma，and it may be related with immune tolerance.

[Key words]Lipopolysaccharide；Asthma mice；T cell；Interleukin-17

支氣管哮喘是全球常見的慢性疾病之一，是由T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病[1-2]。T細(xì)胞及其亞群如Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如白介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-13、IL-17等直接參與了哮喘的炎癥過程，進(jìn)而誘發(fā)哮喘的一系列癥狀[3]。IL-17是一種主要由CD4+T淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等分泌的前炎性細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的募集中性粒細(xì)胞及促進(jìn)多種炎性因子釋放的作用，參與了機(jī)體多種炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展[4-5]，在哮喘的慢性氣道炎癥過程中，也發(fā)揮著重要的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)利用低劑量脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在體外刺激哮喘小鼠T細(xì)胞，檢測其IL-17的產(chǎn)生情況，探討低劑量LPS誘導(dǎo)IL-17的產(chǎn)生及哮喘T淋巴細(xì)胞免疫耐受的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone公司），Al（OH）3（A8222，Sigma公司），雞卵清蛋白（A5503，Sigma公司），尼龍毛柱（Cat.146-04231，日本W(wǎng)ako公司），小鼠紅細(xì)胞裂解液（碧云天公司），小鼠IL-17 ELISA試劑盒（Diaclone公司），倒置顯微鏡（日本Nikon），Eppendorf離心機(jī)，流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司），霧化器（boyo37G6000型，德國百瑞公司），空氣壓縮泵（德國百瑞公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

BALB/c小鼠15只，清潔級(jí)，4～6周齡，體重20～30 g，雌雄不限，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組5只，LPS組10只，其中LPS組又分為LPS1組和LPS2組，各5只。小鼠購自溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在普通清潔條件下飼養(yǎng)，自由取水、攝食。

1.3哮喘小鼠模型的制作

10只LPS組小鼠分別于第1、14天致敏，即經(jīng)小鼠腹腔注射OVA 10 μg與Al（OH）3凝膠20 mg的混合液，總體積200 μl；第25天開始，將小鼠放置于容積為5 L的密閉容器中，通過連接霧化吸入器的空氣壓縮泵，以3%的OVA氣溶膠激發(fā)小鼠，30 min/次，1次/d，總共3次。5只正常對(duì)照組小鼠以等量的生理鹽水代替OVA致敏及激發(fā)。最后1次激發(fā)后48 h處死小鼠，收集標(biāo)本。

1.4 T細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)

無菌狀態(tài)下分別切除各組小鼠脾臟，剪碎過100目鋼網(wǎng)，收集細(xì)胞混懸液，過T細(xì)胞尼龍毛柱，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，再用RPMI 1640沖洗尼龍毛柱，即得到分離、純化的T細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測CD3，檢測T細(xì)胞純度。按實(shí)驗(yàn)要求重新調(diào)整T細(xì)胞濃度為1×106/ml。

1.5 LPS體外刺激T細(xì)胞

取24孔培養(yǎng)板，每孔加入哮喘小鼠脾臟來源的T細(xì)胞1×106/ml（共1 ml），再分別加入終濃度為1、2 ng/ml的LPS生理鹽水溶液，對(duì)照組以0.1 ml生理鹽水替代加入。以上各組均設(shè)20個(gè)復(fù)孔。置培養(yǎng)板于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，取上清液測其IL-17水平。

1.6 ELISA法測定IL-17水平

按照說明書步驟進(jìn)行。加100 μl標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照、待測樣品和空白對(duì)照（樣品稀釋液）到已包被好的培養(yǎng)板孔內(nèi)，37℃孵育90 min；洗板，每孔加入50 μl抗體，混合30 s，37℃孵育60 min；洗板，每孔加入50 μl抗體，混合30 s，37℃孵育60 min；洗板，每孔加入50 μl抗體，混合30 s，37℃孵育60 min；洗板，用50 μl終止液終止顯色，10 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定光密度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，不同組別間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 T細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

流式細(xì)胞儀檢測總T細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物CD3，結(jié)果如圖1所示，經(jīng)尼龍毛柱法分析獲得的T細(xì)胞的純度為70.6%，可以滿足本次實(shí)驗(yàn)的需要。

2.2低劑量LPS對(duì)T細(xì)胞分泌IL-17的影響

對(duì)照組的IL-17水平為（10.48±1.47）pg/ml，LPS1組的IL-17水平為（9.34±1.63）pg/ml，LPS2組的IL-17水平為（9.57±1.66）pg/ml。與對(duì)照組相比，低劑量LPS（LPS1組、LPS2組）刺激哮喘T淋巴細(xì)胞后，其細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-17水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3討論

支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子參與了其中的病理過程[7]，其中T細(xì)胞及其亞群發(fā)揮非常重要的作用，是造成哮喘炎癥反應(yīng)和各種臨床癥狀的根源[8-9]。T細(xì)胞在抗原肽、主要組織相容性復(fù)合物分子的相互作用下，被抗原提呈細(xì)胞活化，然后增殖、分化成各種效應(yīng)T細(xì)胞，分別分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子發(fā)揮各種功能[10]。

近年來有學(xué)者提出哮喘免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的“衛(wèi)生假說”，其核心是Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為，哮喘的發(fā)生是Th2細(xì)胞過度活化，釋放較多的Th2細(xì)胞因子，而Th1細(xì)胞因子表達(dá)不足使Th1/Th2平衡失調(diào)[11]。根據(jù)此理論，當(dāng)哮喘小鼠模型建成后，其血清中與Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子水平如IL-4、IL-5、IL-13、IL-17等應(yīng)該上升，但是在本實(shí)驗(yàn)中，低劑量LPS刺激哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞后，其培養(yǎng)上清液中的IL-17水平下降，低于對(duì)照組，可能的機(jī)制是低劑量LPS短期刺激可能抑制DC細(xì)胞的成熟，從而阻斷Th2細(xì)胞的活化，進(jìn)而阻止變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生、發(fā)展。莫碧云等[12]的研究顯示，LPS通過激活Toll樣受體4在哮喘氣道炎癥和氣道重塑過程中發(fā)揮雙相調(diào)節(jié)作用，這與本課題研究結(jié)果一致。

研究顯示，支氣管哮喘患者肺組織中IL-17A+CD4+細(xì)胞增加，證實(shí)了Th17細(xì)胞群的存在，IL-17和Th17細(xì)胞在支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17A、IL-17F、IL-22均參與了支氣管哮喘的發(fā)病。李賤等[13]的研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，哮喘患者中Th17細(xì)胞數(shù)量升高，其分泌的IL-17水平亦升高。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，與輕度、中度、重度哮喘相比，IL-17升高的水平與支氣管哮喘的嚴(yán)重程度成正比。涂國華等[14]的研究顯示，哮喘患者痰液中IL-17A和IL-8 mRNAs水平顯著升高，提示Th17細(xì)胞以及IL-17A通過IL-8導(dǎo)致了哮喘中的中性粒細(xì)胞炎癥。痰液中的IL-17A增加也與哮喘中支氣管高反應(yīng)性有關(guān)[15]。痰液中IL-17A增加也是重度哮喘的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[16]。

氣道上皮細(xì)胞分泌的IL-17可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤以及黏液分泌增加。IL-17基因沉默后，小鼠Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生明顯增加，嗜酸粒細(xì)胞功能明顯增強(qiáng)，提示Th17與Th2之間可能存在分化拮抗作用[17]。在IL-17家族細(xì)胞因子中，IL-17A和IL-17F與哮喘嚴(yán)重程度和肺部中性粒細(xì)胞募集的關(guān)系最密切[18]。

在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，經(jīng)低劑量LPS處理后T細(xì)胞沒有發(fā)生明顯的凋亡，其原因可能是LPS與T細(xì)胞在體外培養(yǎng)的時(shí)間較短，T細(xì)胞尚未發(fā)生凋亡，但T細(xì)胞處于對(duì)變應(yīng)原不反應(yīng)的狀態(tài)，因此Th2細(xì)胞因子如IL-17等生成減少。

綜上所述，低劑量LPS可以誘導(dǎo)哮喘免疫耐受，為哮喘的免疫治療提供理論依據(jù)，但是其中具體的機(jī)制還有待更加深入和全面的研究。

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（收稿日期：2016-11-12 本文編輯：祁海文）