劉貴生+吳俊靜+喬木++彭先文+梅書(shū)棋

摘要：規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（CRISPR）及其相關(guān)的蛋白（Cas）原本是細(xì)菌抵御病毒的獲得免疫系統(tǒng)，人們很快發(fā)現(xiàn)其應(yīng)用潛力，即RNA引導(dǎo)的核酸酶Cas9對(duì)靶DNA進(jìn)行基因組編輯：敲除、敲入、敲降。CRISPR-Cas9是繼ZNF、TALENS技術(shù)之后的第三代基因組編輯技術(shù)，具有突變效率高、成本低、制作簡(jiǎn)單、能夠誘導(dǎo)多位點(diǎn)同時(shí)突變等特點(diǎn)。除了基因工程功能外，CRISPR-Cas9系統(tǒng)還具有基因調(diào)控、基因組標(biāo)記功能、大片段刪除、全基因組掃描與編輯RNA等，且發(fā)展到CRISPR3.0，并繼續(xù)開(kāi)發(fā)其新應(yīng)用。從2012年底開(kāi)始，CRISPR的一系列創(chuàng)新性應(yīng)用開(kāi)啟了整個(gè)基因組編輯研究的革命，成為生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)明星。文章對(duì)其最新進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)其在豬中的應(yīng)用及潛力進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：基因組編輯；CRISPR-Cas9；豬；基因功能；網(wǎng)絡(luò)調(diào)控

中圖分類號(hào)：R34；S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）24-6510-07

最新的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）分類表將其描述為三大類型和多個(gè)亞型，結(jié)合生物化學(xué)與分子遺傳學(xué)方法揭示了不同CRISPR-Cas（CRISPR associated protein）類型的特征[1]，其中II型系統(tǒng)Cas9比其他更為簡(jiǎn)便?；贑RISPR-Cas9系統(tǒng)的作用原理，研究人員模擬細(xì)菌的成熟crRNA和tracrRNA，在體外人工合成gRNA（guide RNA），同樣可以達(dá)到特異地切割靶標(biāo)DNA，從而將該系統(tǒng)簡(jiǎn)化成核酸酶Cas9和人工合成的sgRNA兩個(gè)組分，在靶標(biāo)位點(diǎn)導(dǎo)致所期望的插入、刪除或替換，由此開(kāi)創(chuàng)了新型基因編輯技術(shù)，這是該系統(tǒng)的“基因工程功能”。更進(jìn)一步地，通過(guò)點(diǎn)突變得到缺乏核酸酶活性的Cas9突變體，命名為dCas9。突變的dCas9可在gRNA的引導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)與DNA結(jié)合，但不能切割DNA。而dCas9具有融合異源模塊的結(jié)構(gòu)域，利用dCas9這3點(diǎn)特性，將其與一系列具有功能的異源模塊融合，實(shí)現(xiàn)不同研究目的：轉(zhuǎn)錄激活與抑制、探索未知基因及其調(diào)控元件的功能、全基因組掃描等，這是該系統(tǒng)的“基因調(diào)控功能”。不論是基因工程/基因調(diào)控，其工作過(guò)程是相同的：gRNA通過(guò)序列互補(bǔ)原則將核酸酶帶到基因組特定位點(diǎn)，使其與靶標(biāo)結(jié)合。不過(guò)，基因工程與基因調(diào)控是利用Cas9蛋白的不同形式，包括野生型Cas9與人工突變的dCas9蛋白，以實(shí)現(xiàn)各自目的[2，3]。該技術(shù)能夠快速地構(gòu)建遺傳改造的動(dòng)物，使得在過(guò)去要花費(fèi)數(shù)月或數(shù)年的工作現(xiàn)在只需幾周完成。CRISPR技術(shù)與PCR技術(shù)類似，正在給生物工程研究帶來(lái)革命性的改變，從各個(gè)方面影響著生命科學(xué)的發(fā)展[4]。目前基因組編輯CRISPR-Cas中也主要是應(yīng)用Cas9系統(tǒng)，下面簡(jiǎn)稱“Cas9系統(tǒng)”。

2013年初以來(lái)，Cas9系統(tǒng)的快速創(chuàng)新及其拓展應(yīng)用，使其成為可替代ZFN和TALEN的第三代基因組編輯工具。2013年Science雜志將Cas9系統(tǒng)選為年度十大突破之一（亞軍）；2014年美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校生物化學(xué)家Doudna博士和德國(guó)的Charpentier博士因此共同獲得了美國(guó)硅谷“科技突破獎(jiǎng)”與“阿爾珀特獎(jiǎng)”；2015年被Science雜志評(píng)選為年度十大突破之首；2016年具有小諾貝爾獎(jiǎng)之稱的蓋爾德納國(guó)際獎(jiǎng)授予了三位科學(xué)家：Doudna，Charpentier和麻省理工學(xué)院的張鋒三位博士。幾大公司看好Cas9系統(tǒng)的成果商業(yè)化前景。Editas Medicine、Intellia Therapeutics和CRISPR Therapeutics等公司已經(jīng)收到數(shù)億美元的投資。例如，2015年比爾·蓋茨等大佬宣布為促進(jìn)基因編輯技術(shù)的蓬勃發(fā)展，共投資1.2億美元參與基因編輯公司 Editas Medicine的B輪融資，Cas9先驅(qū)之一張鋒是該公司的聯(lián)合創(chuàng)始人。Editas Medicine計(jì)劃于2017年采用基因編輯療法對(duì)先天性黑蒙癥進(jìn)行臨床試驗(yàn)，這是一種罕見(jiàn)的視網(wǎng)膜疾病，基因突變可能導(dǎo)致眼睛中的感光細(xì)胞逐漸消失。據(jù)麻省理工學(xué)院Broad研究所網(wǎng)站最新報(bào)道，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)巨頭杜邦（DuPont）公司宣布對(duì)Caribou Sciences公司進(jìn)行投資，且將獲得其專利在農(nóng)作物使用的獨(dú)家授權(quán)。而Caribou Sciences是Cas9技術(shù)首創(chuàng)之一Doudna博士實(shí)驗(yàn)室的附屬公司。目前，杜邦公司正在溫室中種植Cas9編輯的玉米、大豆、水稻和小麥，期望在5～10年內(nèi)出售Cas9技術(shù)的產(chǎn)品。位于明尼蘇達(dá)州圣保羅的動(dòng)物生物科技公司Recombinetics正在開(kāi)發(fā)同類動(dòng)物，包括無(wú)須抑制牛角生長(zhǎng)的牛和不需要被閹割的豬。2016年6月底，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）顧問(wèn)委員會(huì)批準(zhǔn)了一項(xiàng)申請(qǐng)：利用Cas9系統(tǒng)強(qiáng)化依賴于患者T細(xì)胞（一種免疫細(xì)胞）的癌癥療法。由于其易用性和通用性，Cas9已經(jīng)被世界各地的實(shí)驗(yàn)室用來(lái)改寫(xiě)基因組和重塑細(xì)胞，其在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用是無(wú)窮無(wú)盡的，它將開(kāi)啟該行業(yè)新一波的產(chǎn)品浪潮和利益追逐。根據(jù)瑞士洛桑附近的咨詢機(jī)構(gòu)IPStudies介紹，全球已有超過(guò)860項(xiàng)CRISPR專利，平均每天新增加一項(xiàng)專利。世界許多遺傳學(xué)家和生化學(xué)家普遍認(rèn)為，Cas9系統(tǒng)可對(duì)所有的生物進(jìn)行改造，這是一項(xiàng)可改變生命未來(lái)的偉大技術(shù)，當(dāng)然，該技術(shù)也面臨許多倫理挑戰(zhàn)。

1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的拓展性應(yīng)用研究

最初的Cas9只能實(shí)現(xiàn)剪切的基因工程功能（CRISPR1.0版本）。每次只能執(zhí)行一種功能的dCas9是CRISPR2.0。現(xiàn)在研究人員將突變dCas9蛋白與一系列具有功能的異源模塊融合，成為能夠執(zhí)行多重功能的CRISPR3.0。這種平臺(tái)能夠執(zhí)行復(fù)雜的程序，適用于研究基因網(wǎng)絡(luò)機(jī)理和更深入探討復(fù)雜性狀/疾病[5]。

1.1 同時(shí)激活多基因表達(dá)/同時(shí)抑制多基因

Chavez等[2]設(shè)計(jì)了三方轉(zhuǎn)錄激活子（VP64-p65-Rta）融入dCas9，可探討一連串基因回路對(duì)生物過(guò)程（比如組織發(fā)育或疾病發(fā)生）的影響，也可以精確指導(dǎo)干細(xì)胞分化，生成再生醫(yī)學(xué)所需的移植器官。Konermann等[6]應(yīng)用改造后的Cas9系統(tǒng)成功激活了十個(gè)基因，包括長(zhǎng)非編碼RNA（LncRNA）。這些基因轉(zhuǎn)錄效率得到了兩倍以上的增長(zhǎng)，該研究的意義在于，人們可以用這一技術(shù)在活細(xì)胞中有效啟動(dòng)任何基因表達(dá)[7]。Cas9系統(tǒng)已被成功地用于同時(shí)干擾小鼠2個(gè)基因和敲除猴與蠶的兩個(gè)基因[8，9]。多位點(diǎn)編輯將促進(jìn)多方面研究，包括上位效應(yīng)的檢測(cè)和基因組中物理距離非常接近的多基因操作。Ma等[10]同時(shí)靶向基因家族的多成員（多至8個(gè)位點(diǎn)），突變率平均為85.4%。Zalatan等[11]應(yīng)用架RNA（scaffold RNA，scRNA），成功在酵母中重新定向了一個(gè)復(fù)雜的多分支的代謝通路，其中一些基因被激活，另一些基因被抑制（CRISPRa/i）。多基因的組合控制可以幫助人們靈活操縱細(xì)胞中的通路，例如，改寫(xiě)細(xì)胞命運(yùn)或者設(shè)計(jì)代謝通路。Cheng等[5] 報(bào)道其CRISPR 3.0版本是Casilio，該系統(tǒng)可結(jié)合多個(gè)蛋白模塊，包括基因激活、基因抑制、染色體熒光標(biāo)記、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶等，以實(shí)現(xiàn)不同的目的。

1.2 運(yùn)用Cas9實(shí)施表觀遺傳學(xué)編輯

Kearns等[12]報(bào)道dCas9-組蛋白脫甲基酶LSD1 在鼠胚胎干細(xì)胞中靶向轉(zhuǎn)錄因子Oct4的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子，抑制Oct4轉(zhuǎn)錄并失去多能性。許多酶能以不同的機(jī)制催化DNA去甲基化，其中，TET（Ten-Eleven Translocation dioxygenase）雙加氧酶家族有3個(gè)成員：TET1、TET2和TET3，催化的5-甲基胞嘧啶氧化，可啟動(dòng)DNA的去甲基化。Xu等[13]首先向傳統(tǒng)sgRNAs中插入兩個(gè)拷貝的噬菌體MS2 RNA元件，構(gòu)建了修飾后的sgRNA2.0，這有利于Tet1催化結(jié)構(gòu)域（TET-CD），與dCas9或MS2外殼蛋白融合，以靶向基因位點(diǎn)。結(jié)果證明，dCas9/sgRNA2.0指導(dǎo)的去甲基化系統(tǒng)能有效地將靶基因去甲基化，可顯著上調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括RANKL、MAGEB2或MMP2，而且這結(jié)果與它們啟動(dòng)子中相鄰的CpG島的DNA去甲基化密切相關(guān)。類似的工作與結(jié)果也由Choudhury等[14]報(bào)道于模式抑癌基因BRCA1啟動(dòng)子。這些結(jié)果不僅可以幫助我們理解在特定背景中DNA甲基化如何調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制，而且也使我們能夠控制基因表達(dá)與功能，并帶來(lái)潛在的臨床效益。表觀遺傳效應(yīng)模塊的匯總詳見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。

1.3 運(yùn)用Cas9開(kāi)展高通量全基因組遺傳學(xué)篩選

全基因組 CRISPR 篩選克服了傳統(tǒng)遺傳篩選的缺點(diǎn)，可應(yīng)用于幾乎任何細(xì)胞系和任何遺傳背景下的篩選[16]。應(yīng)用其進(jìn)行遺傳篩選的基礎(chǔ)是蛋白Cas9修飾后的多種形式融合和sgRNA文庫(kù)。構(gòu)建Cas9高通量篩選的文庫(kù)有兩種：陣列文庫(kù)和混合文庫(kù)。（1）細(xì)胞系中開(kāi)展遺傳學(xué)篩選。Wong等[17]創(chuàng)建了Cas9與CombiGEM結(jié)合的平臺(tái)技術(shù)，可展望，該平臺(tái)有著廣泛的應(yīng)用前景，加速系統(tǒng)鑒定控制人類疾病表型的遺傳組合，并轉(zhuǎn)化到新藥物組合的發(fā)現(xiàn)。（2）體內(nèi)開(kāi)展遺傳學(xué)篩選。Ma等[18]將活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶（AID）與dCas9融合成為dCas9-AIDx，在慢性粒細(xì)胞中靶標(biāo)BCR-ABL，鑒定了賦予細(xì)胞伊馬替尼抗性的已知突變和新突變。Zhu等[19]開(kāi)發(fā)了配對(duì)的gRNAs（pgRNAs），產(chǎn)生大片段缺失，應(yīng)用這種高通量方法確定了51條功能性的lncRNAs，并驗(yàn)證了其中的9個(gè)。該方法使科學(xué)家們能夠快速識(shí)別哺乳動(dòng)物非編碼元件的功能。

1.4 光遺傳學(xué)加CRISPR調(diào)控基因表達(dá)與靶DNA切割

東京大學(xué)和杜克大學(xué)基于光誘導(dǎo)的CRY2（色素）和CIB1（蛋白），開(kāi)發(fā)出相似的光遺傳學(xué)+CRISPR系統(tǒng)，其目的是利用光來(lái)開(kāi)啟和關(guān)閉基因表達(dá)，同時(shí)賦予時(shí)空控制和可逆性[20-22]。

1.5 通過(guò)熒光標(biāo)記的dCas9對(duì)DNA實(shí)施標(biāo)記

Deng等[23]體外構(gòu)建“dCas9/熒光素”復(fù)合物作為探針，可視化基因組位點(diǎn)完全沒(méi)有引起DNA變性，稱為Cas9介導(dǎo)的熒光原位雜交（CASFISH）。dCas9/sgRNA能夠在近著絲粒區(qū)、著絲粒、G富集端粒和編碼基因等位點(diǎn)快速而有效地進(jìn)行重復(fù)DNA元件標(biāo)記，也適用于初生組織切片的檢測(cè)。這種技術(shù)具有快速、有效、破壞性較少與成本低的特征，為基礎(chǔ)研究和遺傳學(xué)診斷增加了一種非常有潛力的工具。

1.6 CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因工程和基因調(diào)控的雙重功能

Kiani等[24]開(kāi)發(fā)了Cas9系統(tǒng)一個(gè)新策略，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因組工程和基因調(diào)控的雙重功能。其使用經(jīng)過(guò)改造的gRNA和Cas9蛋白，在切割特定基因的同時(shí)調(diào)控其他基因的表達(dá)。這一技術(shù)大大增強(qiáng)了基因組編輯和基因調(diào)控的功能性，幫助我們進(jìn)一步操縱細(xì)胞，以揭示重要生命過(guò)程背后的復(fù)雜機(jī)理，比如，癌癥耐藥性和干細(xì)胞分化，或者幫我們?cè)O(shè)計(jì)更高級(jí)的人工基因回路。更進(jìn)一步地，雙重功能Cas9可以促進(jìn)基因工程菌株（例如大腸桿菌）大規(guī)模生產(chǎn)化合物和燃料。

1.7 多順?lè)醋踊?/p>

Xie等[25]將tRNA與gRNA結(jié)合起來(lái)，開(kāi)發(fā)合成了一個(gè)多順?lè)醋踊颍蕴岣逤as9系統(tǒng)的靶向能力和多重編輯效率，能夠在水稻中高效實(shí)現(xiàn)多重基因組編輯和染色體片段刪除（可達(dá)到100%）。Qi等[26]設(shè)計(jì)多個(gè)tRNA-gRNA單元，在玉米中的研究表明，該系統(tǒng)不僅增加靶向位點(diǎn)數(shù)目，也能更有效和準(zhǔn)確地缺失染色體片段，這對(duì)基因功能的完全消除特別是lncRNAs的研究很重要。同時(shí)還表明，在一個(gè)表達(dá)盒中可容納多達(dá)四個(gè)tRNA-gRNA單元，用來(lái)修飾同一基因家族中的不同成員或同一代謝途徑中的不同調(diào)控基因。

1.8 Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）可無(wú)限地自我更新，而不會(huì)喪失分化成所有細(xì)胞類型的能力，且繞過(guò)了免疫排斥的障礙。iPSCs在再生醫(yī)學(xué)中具有良好的前景，是用于致病突變?cè)恍Ｕ囊环N理想細(xì)胞群。將CRISPR應(yīng)用到iPSCs中為糾正遺傳缺陷疾病開(kāi)辟了一條新途徑，因?yàn)閕PSCs很難采用傳統(tǒng)的基因打靶策略進(jìn)行操作，尤其是蛋白質(zhì)介導(dǎo)的基因組編輯方法[27-30]。

1.9 染色體大片段和lncRNA編輯

Shechner等[31]介紹了以CRISPR-Cas9為基礎(chǔ)的基因組靶向技術(shù)展示：CRISPR-Display（CRISP-Disp），將gRNA-ncRNA融合，能將大片段非編碼RNA帶到特定DNA位點(diǎn)，同時(shí)不影響dCas9的功能。CRISP-Disp系統(tǒng)可容納約4.8 kb的RNA結(jié)構(gòu)域，這相當(dāng)于天然lncRNA的長(zhǎng)度。除了lncRNA以外，研究人員還對(duì)各種天然和人工非編碼RNA進(jìn)行了測(cè)試，表明gRNA可以偶聯(lián)多個(gè)非編碼RNA結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可同時(shí)且獨(dú)立起作用。CRISP-Disp可用來(lái)解決如下問(wèn)題：一個(gè)lncRNA片段是如何調(diào)控基因表達(dá)的？是這個(gè)片段的轉(zhuǎn)錄本在起作用，還是它本身的序列在起作用？揭示lncRNA在表觀遺傳學(xué)修飾、染色質(zhì)重塑或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控中做出的貢獻(xiàn)。該系統(tǒng)除了研究非編碼RNA機(jī)理外，對(duì)合成生物學(xué)來(lái)說(shuō)，CRISP-Disp的靈活性、模塊化和多重化特性是很有吸引力的。用CRISP-Disp招募RNA-蛋白復(fù)合體到特定位點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)出復(fù)雜的基因調(diào)控回路。Yoshimi等[32]開(kāi)發(fā)出了兩種基因改造新技術(shù)：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP（Two-hit two-oligo with plasmid）），來(lái)完成相對(duì)較長(zhǎng)的DNA片段，如GFP（Green fluorescent protein）序列的靶向基因敲入，提高基因編輯的效率。第一種方法是利用lsODNs作為靶向供體。第二種方法是共同注射兩個(gè)gRNAs作為“剪刀”切割基因組DNA和供體質(zhì)粒DNA中的靶位點(diǎn)，兩個(gè)短ssODNs作為“漿糊”連接切割位點(diǎn)的末端。利用開(kāi)發(fā)出的兩種基因改造方法，該研究小組成功實(shí)現(xiàn)了高效、精確敲入GFP基因，導(dǎo)入了近200 kb的大片段基因組區(qū)域，這是采取傳統(tǒng)方法不可能做到的。并用人源基因替代了大鼠基因，構(gòu)建出了基因人源化的動(dòng)物。這兩種基因敲入方法將會(huì)提高遺傳工程改造的效率。研究人員高度期待這些遺傳工程生物將用于藥物研發(fā)、轉(zhuǎn)化和再生醫(yī)學(xué)等廣泛的研究領(lǐng)域。

1.10 研究蛋白質(zhì)工程

Hess等[33]開(kāi)發(fā)了一種稱為重利用體細(xì)胞超突變的原位蛋白質(zhì)工程新技術(shù)，命名為CRISPR-X。研究人員利用dCas9召集胞嘧啶脫氨酶（AID）變異體，其攜帶有經(jīng)過(guò)MS2修飾的sgRNAs，能特異地誘變內(nèi)源靶標(biāo)，限制脫靶傷害。它能產(chǎn)生不同點(diǎn)突變的多樣文庫(kù)，同時(shí)靶向多個(gè)基因組位點(diǎn)，結(jié)果從中找到了引發(fā)Bortezomib耐藥性的已知和新突變。還利用超活化AID變異體，同時(shí)誘變了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游和下游的位點(diǎn)。這些結(jié)果均表明 CRISPR-X是一種強(qiáng)大的工具，能幫助科學(xué)家們創(chuàng)建復(fù)雜的原始遺傳突變文庫(kù)，分析完善蛋白質(zhì)工程。

2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在豬中的研究進(jìn)展

Cas9系統(tǒng)出現(xiàn)之前，已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了其他技術(shù)的基因組編輯豬[34]，現(xiàn)在利用Cas9系統(tǒng)的報(bào)道層出不窮。這里重點(diǎn)綜述Cas9系統(tǒng)在豬研究中的進(jìn)展，因?yàn)樨i不僅提供肉食，同時(shí)其在生理學(xué)、免疫學(xué)和基因組學(xué)上與人高度相似，器官大小也比嚙齒動(dòng)物有優(yōu)勢(shì)。

2.1 功能基因研究

Su等[35]合成sgRNA時(shí)用豬U6啟動(dòng)子代替人U6啟動(dòng)子，獲得更佳的打靶效率；Wang等[36]顯微注射Cas9 mRNA和sgRNA至豬原核期胚胎，篩選出打靶效率最高的sgRNA；He等[37]將攜帶GFP和紅色熒光蛋白（RFP）的Cas9質(zhì)粒先后轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，通過(guò)雙重?zé)晒夂Y選提高打靶成功效率；吳金青等[38]應(yīng)用SSA（Single-strand annealing）報(bào)告載體，使Cas9系統(tǒng)對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞的打靶效率提高5倍左右。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（OCT4）是參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新和維持其全能性的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。Kwon等[39]研究表明Cas9系統(tǒng)可針對(duì)孤雌胚胎實(shí)現(xiàn)基因OCT4的敲除和敲入。Lai等[40]構(gòu)建了一個(gè)豬OCT4的報(bào)告系統(tǒng)，其內(nèi)源性O(shè)CT4啟動(dòng)子可直接控制RFP，因此熒光能準(zhǔn)確地顯示內(nèi)源性O(shè)CT4的激活，并獲得了在內(nèi)源性O(shè)CT4基因啟動(dòng)子下游具有tdTomato基因敲入的豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFF）系。Cas9系統(tǒng)編輯的PFFs被用作體細(xì)胞核移植（SCNT）的供體細(xì)胞，在SCNT胎兒的囊胚和生殖嵴中檢測(cè)到了強(qiáng)大的RFP表達(dá)，并制備了兩頭有生命力的基因編輯豬。

2.2 提高生產(chǎn)性能

肌肉生長(zhǎng)抑制素（Myostatin，MSTN）基因?qū)∪馍L(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)控作用。Crispo等[41]、Cyranoski[42]、Wang等[43]和張冬杰等[44]利用Cas9系統(tǒng)獲得了MSTN基因的雙等位基因敲除豬。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所Bi等[45]應(yīng)用Cas9系統(tǒng)制備了無(wú)選擇標(biāo)記的MSTN基因敲除克隆豬。首先，利用Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組敲除豬初生細(xì)胞中MSTN的一個(gè)等位基因。然后，用Cre重組酶來(lái)切除選擇標(biāo)記基因，有效率為82.7%。免疫印跡顯示，克隆豬MSTN大約有50%的降低，同時(shí)肌原性基因在肌肉中的表達(dá)有所增加。組織學(xué)顯示，肌纖維數(shù)量增加，但是肌纖維大小保持不變。超聲波檢測(cè)顯示，最長(zhǎng)肌大小增加，背部脂肪厚度降低。該研究提供了一種可靠的途徑用于家畜良種生產(chǎn)，也提出了一種策略來(lái)減少潛在的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所的李奎教授領(lǐng)導(dǎo)研究團(tuán)隊(duì)，首次利用Cas9系統(tǒng)獲得了位點(diǎn)特異性的基因敲入豬模型[46]，得到一個(gè)新的基因組“安全港”位點(diǎn)：pH11位點(diǎn)，通過(guò)Cas9系統(tǒng)分別在細(xì)胞、胚胎和動(dòng)物體內(nèi)的該位點(diǎn)插入了大于9 kb的基因片段，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定高效的基因表達(dá)。

分化簇 163（Cluster of differentiation 163，CD163）被認(rèn)為是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的受體基因，分化簇1D（CD1D）是一類抗原遞呈因子。Whitworth等[47]利用Cas9系統(tǒng)分別敲除CD163和CD1D的基因編輯豬；經(jīng)過(guò)藍(lán)耳病毒株攻毒后CD163雙等位基因敲除豬未表現(xiàn)出臨床癥狀，具有良好的抗藍(lán)耳病能力。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所利用Cas9系統(tǒng)進(jìn)行抗PRRSV和抗豬傳染性胃腸炎（PEDV）的CD163和CD13雙基因編輯豬的制備，正在開(kāi)展相關(guān)驗(yàn)證鑒定工作。這些研究在養(yǎng)豬業(yè)引起了高度關(guān)注。

2.3 研究人類疾病的動(dòng)物模型

豬是人類醫(yī)學(xué)研究極佳的動(dòng)物模型。vWF（von Willebrand factor）的基因是引起人血管性血友病的主因。Hai等[48]應(yīng)用Cas9系統(tǒng)靶向豬vWF外顯子，目的基因插入/缺失突變效率達(dá)到 68.8%（11/16）；單等位基因突變和雙等位基因突變的vWF抗原水平均極顯著低于野生型個(gè)體（P<0.01），雙等位基因突變個(gè)體的凝血時(shí)間極顯著高于野生型個(gè)體（P<0.01）。賴良學(xué)課題組運(yùn)用Cas9系統(tǒng)，針對(duì)皮膚白化病相關(guān)的酪氨酸酶（TYR）基因、帕金森疾病相關(guān)的帕金森疾?、蛐停≒ARK2）和PTEN誘導(dǎo)激酶1（PINK1）基因，獲得了分別敲除這3個(gè)基因的體細(xì)胞克隆豬，且TYR雙等位基因敲除豬表現(xiàn)出白化病；PARK2 及PINK1雙等位基因敲除豬的2個(gè)靶基因均不表達(dá)，成功建立了人類白化病和帕金森綜合征兩種豬模型[49]。

再如，去除所有主要淋巴細(xì)胞的豬是研究人X-染色體連鎖的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）患者病毒感染和免疫受損發(fā)病機(jī)理的理想動(dòng)物模型。破壞IL2RG的豬比嚙齒動(dòng)物敲除IL2RG模型更接近于SCID表型。Lei等[50]利用Cas9系統(tǒng)快速生成雙基因RAG2/IL2RG敲除豬，成功建立了人諾如病毒（HuNoV）感染的免疫缺陷的豬模型，因?yàn)镽AG2/IL2RG缺陷豬缺乏B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。Yu等[51]成功地通過(guò)Cas9系統(tǒng)在滇南小型豬產(chǎn)生人類DMD疾病動(dòng)物模型。

2.4 醫(yī)學(xué)生物反應(yīng)器

豬除了作為人類疾病模型外，也可作為生產(chǎn)人類需要的產(chǎn)品反應(yīng)器。例如，賴良學(xué)課題組利用精確Cas9系統(tǒng)對(duì)豬胰島素基因進(jìn)行了無(wú)痕定點(diǎn)修飾，3頭可以分泌人胰島素的克隆豬，其中2頭完全分泌人胰島素，而不含豬胰島素；另一頭既分泌人胰島素也分泌豬胰島素。牛泌乳量大、乳汁活性蛋白的產(chǎn)量高，因此其乳腺是理想的生物反應(yīng)器，Peng等[52]通過(guò)CRISPR技術(shù)建立了人血清白蛋白的生物生產(chǎn)器。人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（hFGF2）是一種多功能生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)組織生長(zhǎng)發(fā)育、新血管形成和參與組織修復(fù)過(guò)程中起著重要的作用，但其在人體內(nèi)的表達(dá)量較低。Jeong等[53]借助Cas9系統(tǒng)將該基因?qū)氲脚３衫w維細(xì)胞的β-casein基因內(nèi)含子中，為獲得表達(dá)hFGF2蛋白的基因編輯牛奠定了基礎(chǔ)。谷氨酸棒桿菌是工程化應(yīng)用傳統(tǒng)方法（同源重組）批量生產(chǎn)氨基酸的重要生物機(jī)體。Cleto等[54]采用CRISPRi降低該菌的基因PGI和PCK的表達(dá)高達(dá)98%，降低基因PYK高達(dá)97%，從而大大增強(qiáng)了L-賴氨酸和L-谷氨酸產(chǎn)品滴度的比率。這種新谷氨酸代謝工程方法只需要3 d時(shí)間，表明CRISPRi可用于快速且有效地代謝途徑改造，而不需要對(duì)基因缺失或突變。

2.5 異種器官移植

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界大概有200萬(wàn)人需要器官移植，而器官捐獻(xiàn)的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于需求數(shù)量[55]。尤其是老齡化和慢性疾病的多發(fā)，更加導(dǎo)致供體器官嚴(yán)重不足。豬被認(rèn)為是人體異種器官來(lái)源的首選動(dòng)物，因?yàn)樨i與其他哺乳動(dòng)物比較，無(wú)論從器官大小、生理結(jié)構(gòu)和基因組相似度都更接近于人，因此，上世紀(jì)90年代應(yīng)用豬生產(chǎn)人類器官項(xiàng)目一度在全球受到追捧，但受阻于豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Porcine endogenous retrovi-ruses，PERVs）造成的重大醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)。哈佛大學(xué)利用Cas9系統(tǒng)對(duì)豬腎細(xì)胞系PK15中所有62個(gè)拷貝的PERV pol（多聚酶）基因敲除，使內(nèi)源性病毒傳遞給人的風(fēng)險(xiǎn)降低了1 000倍以上[56]。該研究掃除了豬器官用于人體移植的安全障礙，為全世界亟需器官移植的上百萬(wàn)病人帶來(lái)希望，也重新燃起了大家對(duì)異種器官移植的信心。

免疫排斥反應(yīng)是豬器官移植另一障礙。α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GGTA1）基因與異種器官移植后的超急性免疫排斥反應(yīng)顯著相關(guān)，Sato等[57]在豬胎兒成纖維細(xì)胞中通過(guò)Cas9系統(tǒng)獲得了GGTA1雙等位基因敲除的細(xì)胞系。Li等[58]針對(duì)3個(gè)與免疫排斥相關(guān)的基因GGTA1、胞苷單磷酸N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（CMAH）和異紅細(xì)胞糖苷酯合成酶（iGb3S）基因，共轉(zhuǎn)染靶向這2個(gè)或3個(gè)基因的CRISPR/Cas9-PX330構(gòu)質(zhì)粒，最終獲得了敲除單個(gè)基因及同時(shí)敲除2個(gè)或3個(gè)基因的胎兒或仔豬。利用類似的方法，Estrada等[59]針對(duì)豬肝臟細(xì)胞分別敲除GGTA1、GGTA1/CMAH和GGTA1/CMAH/β4GalNT2（β-1， 4-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶2）基因。

3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的前景

CRISPR-Cas9系統(tǒng)在如此短的時(shí)間內(nèi)極大地推動(dòng)了生物學(xué)的各個(gè)方面研究，例如基因功能解析、基因治療、人類疾病動(dòng)物模型、生物生產(chǎn)反應(yīng)器和農(nóng)業(yè)動(dòng)植物優(yōu)質(zhì)遺傳育種。該技術(shù)生成的產(chǎn)品，定向改變但不含外源基因/片段，在驗(yàn)證其安全性的基礎(chǔ)上，這種經(jīng)過(guò)“基因組編輯”的產(chǎn)品更容易被消費(fèi)者接受。理論上它不會(huì)帶來(lái)健康或環(huán)境方面的風(fēng)險(xiǎn)，但是否應(yīng)該受到轉(zhuǎn)基因相關(guān)法律的約束，美國(guó)和歐盟的態(tài)度不一致。作為新興的基因組編輯技術(shù)，有必要進(jìn)一步完善其特異性、脫靶效應(yīng)和輸送方法，以及如何更好地激活細(xì)胞自身的同源重組，并探索新型基因組編輯技術(shù)及其應(yīng)用，例如，新CRISPR-Cpfl系統(tǒng)[60]、新型NgAgo系統(tǒng)[61]；無(wú)序列限制的DNA編輯新工具[62]、納米顆粒技術(shù)[63]等等。

農(nóng)業(yè)動(dòng)植物改良從來(lái)都是一個(gè)漫長(zhǎng)而繁瑣的過(guò)程，而如今，科學(xué)家因?yàn)橛辛薈RISPR技術(shù)能夠快速而輕松地實(shí)現(xiàn)。近兩年，許多實(shí)驗(yàn)室將這種工具應(yīng)用在動(dòng)植物和微生物中，以期獲得更高產(chǎn)、更適應(yīng)環(huán)境和更優(yōu)質(zhì)的品種。有理由相信，CRISPR-Cas9系統(tǒng)將更好的服務(wù)于人類，包括動(dòng)植物育種。

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