王雪萍++龔自明++譚榮榮++曹丹++高士偉++鄭鵬程++葉飛++王勝鵬+++滕靖++鄭琳++劉盼盼

摘要：為了解武漢地區(qū)茶樹內(nèi)生真菌的多樣性，從鄂茶1號、鄂茶5號、福鼎大白茶的莖、葉共210個組織塊中，分離獲得166株內(nèi)生真菌菌株。結(jié)果表明，茶樹受內(nèi)生真菌侵染程度較高，74.29%的組織有內(nèi)生真菌存在。根據(jù)rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育分析，從中分離鑒定內(nèi)生真菌15屬，27個分類單元，主要有鏈格孢（Alternaria）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria）、刺盤孢（Colletotrichum）、間座殼屬（Diaporthe）、鐮孢霉（Fusarium）、赤霉（Gibberella）、小從殼菌（Glomerella）、球座菌（Guignardia）、新殼梭孢菌（Neofusicoccum）、擬盤多毛孢（Pestalotiopsis）、擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis）、格孢腔菌（Pleosporales）、擬青霉（Paecilomyces）、腐霉（Pythium）、絲核菌（Rhizoctonia）和2種未知真菌。根據(jù)相對頻率，葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、盤長孢狀刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果球座菌（Guignardia mangiferae）等在茶樹中比較常見。不同組織部位、不同品種內(nèi)生真菌分布及組成存在差異，表現(xiàn)出較豐富的多樣性。

關(guān)鍵詞：茶樹；內(nèi)生真菌；多樣性；種群結(jié)構(gòu)；武漢

中圖分類號：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5563-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.031

Diversity and Population Structure of Endophytic Fungi from

Camellia sinensis in Wuhan， Hubei

WANG Xue-ping，GONG Zi-ming，TAN Rong-rong，CAO Dan，GAO Shi-wei，ZHENG Peng-cheng，

YE Fei，WANG Sheng-peng，TENG Jing，ZHENG Lin，LIU Pan-pan

（Institute of Fruit & Tea，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Tea Engineering and Technology Research Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： Aimming to study the diversity of endophytic fungi isolated from Camellia sinensis in Wuhan，166 strains of endophytic fungi were isolated from 210 tissues，including tea stems and leaves from E-Cha No.1，E-Cha No.5 and Fuding Dabaicha. The results showed that，endophytic fungi were in 74.29 percent of plant tissues. 27 taxa in 15 genera were identified by rDNA-ITS sequence analysis，which where Alternaria，Botryosphaeria，Colletotrichum，Diaporthe，F(xiàn)usarium，Gibberella，Glomerella，Guignardia，Neofusicoccum，Pestalotiopsis，Phomopsis，Pleosporales，Paecilomyces，Pythium，Rhizoctonia and two unkown endophytic fungi. In accordance with relative frequency，Colletotrichum gloeosporioides，Botryosphaeria dothidea and Guignardia mangiferae were more common in tea. The isolation results showed that there were some notable differences between distribution and composition of the endophytic fungi isolated from different cultivars and different tissues of tea，it also showed rich diversity.

Key words： tea tree； endophytic fungi； diversity； populatioon structure； Wuhan city

植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指其生活史中一定階段或全部階段生活于健康植物組織內(nèi)部，不引發(fā)植物產(chǎn)生明顯病癥的一類真菌[1，2]。內(nèi)生于健康植物組織中的真菌具有極其豐富的物種多樣性[3]。這類特殊的真菌資源不僅可以產(chǎn)生重要的生物活性物質(zhì)[4]，而且可以促進(jìn)宿主生長[5]，增強(qiáng)抗蟲能力[6]，在農(nóng)業(yè)生物防治、醫(yī)藥衛(wèi)生等方面具有重要的應(yīng)用價值[7]。

茶樹（Camellia sinensis O.ktzea）是一種多年生常綠灌木或喬木，是山區(qū)農(nóng)民的主要收入來源，中國是茶樹發(fā)源地，茶樹栽培已有3 000多年的歷史，茶樹已和茶樹內(nèi)生真菌形成一種長期協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系。盧東升等[8]從豫南茶園5 760組織塊中分離純化內(nèi)生真菌579株，經(jīng)鑒定為7科15屬18種，游見明[9，10]從四川省自貢市榮縣五通農(nóng)場茶園的茶樹根、莖、葉中分離得到內(nèi)生真菌14屬，胡雲(yún)飛等[11]在南京市紫金山中山陵十年生“龍井長葉”未耕墾茶園的健康根系中分離得到內(nèi)生真菌7屬12種，周游等[12]從白葉單叢成熟葉片、嫩葉和嫩莖中分離到內(nèi)生真菌6屬。本試驗(yàn)從湖北茶樹中分離內(nèi)生真菌，并根據(jù)菌落形態(tài)和孢子等形態(tài)特征，結(jié)合真菌的ITS序列進(jìn)行菌株鑒定，對茶樹內(nèi)生真菌的類群進(jìn)行研究，以為進(jìn)一步挖掘利用茶樹內(nèi)生真菌資源，闡明茶樹內(nèi)生真菌的生態(tài)功能提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 材料

福鼎大白茶、鄂茶1號、鄂茶5號3個供試茶樹品種枝梢采集自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所試驗(yàn)茶園。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，培養(yǎng)液pH 7.0。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。真菌DNA提取試劑盒為上海生物工程有限公司產(chǎn)品，DL2 000 DNA Marker為Takara公司產(chǎn)品；引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由上海生物工程有限公司合成；試驗(yàn)使用的生化及分子生物學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 取樣方法 按照5點(diǎn)采樣法在3個茶樹品種園選取5個點(diǎn)，每個點(diǎn)選擇2株茶樹，每株采集枝梢3枝（當(dāng)年生枝條），每個枝條3個莖樣和3片葉片。

1.2.2 茶樹內(nèi)生真菌的分離、純化、DNA提取 樣本采回實(shí)驗(yàn)室后24 h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，參照謝麗華等[13]的方法進(jìn)行表面消毒及消毒驗(yàn)證。參照李慧玲等[14]的方法進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離和純化，觀察記錄菌落形態(tài)并編號。按照真菌DNA提取試劑盒的方法提取真菌DNA。

1.2.3 目的片段擴(kuò)增和測序 采用真菌通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增所提取真菌DNA的ITS保守區(qū)。PCR反應(yīng)體系：2 ng基因組DNA，12.5 μL dNTPs mixture（2.5 mmol/L），10 pmol/L ITS1，10 pmol/L ITS4，用dd H2O補(bǔ)充至總體積25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳凝膠成像監(jiān)測后無引物二聚體，送上海生物工程有限公司測序。

1.2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過BLAST搜索找出相近的序列信息，通過ClustalX1.81進(jìn)行序列的匹配排序，然后用Neighbor-Joining分析方法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用分離率（isolation rate，IR）、分離頻率（Relative frequency，RF）、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Margalef豐富度指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)分析茶樹內(nèi)生真菌的分布、多樣性及偏好性[15]。

分離率指從樣本組織塊中分離得到的菌株數(shù)與樣本組織塊數(shù)的比值，用于衡量植物組織中內(nèi)生真菌的豐富程度和每個組織塊受多重侵染的頻率。

分離頻率是指分離到的某一指定類型內(nèi)生真菌的菌株數(shù)量占分離的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量的百分率，用于比較和判斷優(yōu)勢菌群。

采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）和Margalef豐富度指數(shù)（R）分析內(nèi)生真菌的多樣性，H′= -∑PilnP，R=（S-1）/Log2（N），其中Pi為第i種的個體數(shù)占總個體數(shù)N的比例，S為物種數(shù)。

采用Pielou指數(shù)（Pielou evenness index，J）分析菌群分布的均勻程度，J=H′/ln（S）。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的定植及分離

茶樹植物組織受到內(nèi)生真菌侵染的程度較高，74.29%的組織塊有內(nèi)生真菌存在。從組織性質(zhì)來看，葉中內(nèi)生真菌的定植率明顯低于枝條；不同品種內(nèi)生真菌定植率也存在差異，從高到低為鄂茶5號、鄂茶1號、福鼎大白茶（表1）。

從3個不同茶樹品種的枝條、葉片共210個組織塊中各分離得到94、72株內(nèi)生真菌，其中鄂茶1號、鄂茶5號枝條的內(nèi)生真菌分離菌株數(shù)最多，分別為34株和31株，分離率分別為97.14%、88.57%，福鼎葉片的內(nèi)生真菌分離率最低，為57.14%。

2.2 茶樹內(nèi)生真菌DNA提取及28S rRNA序列特異性擴(kuò)增

提取分離純化得到的茶樹內(nèi)生真菌DNA，應(yīng)用真菌28S rRNA序列通用引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，得到約600 bp的目標(biāo)片段，見圖1。

2.3 內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定

茶樹166株內(nèi)生真菌鑒定為15個屬、27個分類單元，包括絲孢菌3種、腔孢菌9種、子囊菌11種、腐霉2種和未知真菌2種（表2）。福鼎枝條、葉片分別分離3種、4種，鄂茶1號枝條和葉片分別分離14種、5種，鄂茶5號枝條和葉片分別分離8種、3種。

2.4 茶樹內(nèi)生真菌的組成與分布

依據(jù)龐雄飛等[16]的研究，某物種占整體物種的百分比≥10%為優(yōu)勢屬（種），1%～10%為常見屬（種），百分比≤1%為稀有屬（種）。從表3可以看出，茶樹內(nèi)生真菌優(yōu)勢種群為Colletotrichum gloeosporioides、Botryosphaeria dothidea和Guignardia mangiferae，分別占真菌總數(shù)的25.30%、18.67%和10.24%，稀有種群11個，占真菌總數(shù)的6.66%。

Botryosphaeria dothidea、Colletotrichum gloeosporioides、Diaporthe actinidiae、Glomerella cingulata在枝條和葉片中均可以分離到，而Gibberella intermedia、Pestalotiopsis theae、Pythium vexans只存在于枝條組織，Guignardia mangiferae、Paecilomyces lilacinus只存在于葉片組織。內(nèi)生真菌數(shù)量、真菌種類枝條大于葉片，而主要優(yōu)勢菌的分布比例以葉片較高。茶樹內(nèi)生真菌在不同組織部位的分布存在差異，表現(xiàn)出一定的組織專一性。

福鼎大白茶、鄂茶1號、鄂茶5號3個茶樹品種分離到的內(nèi)生真菌分類單元分別為17、10、7個，菌株數(shù)分別為49、60、57株。優(yōu)勢種群中Botryosphaeria dothidea、Colletotrichum gloeosporioides在3個供試茶樹品種中均有分布，而Guignardia mangiferae只分布于福鼎和鄂茶5號葉片中。

2.5 茶樹內(nèi)生真菌的多樣性

從表4可以看出，茶樹內(nèi)生真菌具有豐富的物種多樣性，總體多樣性指數(shù)達(dá)到3.23，而且表現(xiàn)出鄂茶5號葉片<福鼎大白茶枝條<福鼎大白茶葉片<鄂茶1號葉片<鄂茶5號枝條<鄂茶1號枝條。不同品種、部位內(nèi)生真菌的均勻度指數(shù)差異不大。

3 小結(jié)與討論

本研究對同一栽培管理下種植的福鼎大白茶、鄂茶1號、鄂茶5號3個茶樹品種進(jìn)行了內(nèi)生真菌分離鑒定和多樣性差異比較，共分離獲得內(nèi)生真菌166株，其中164株經(jīng)鑒定屬于15個屬，在一定程度上反映了武漢茶樹內(nèi)生真菌的多樣性。枝條和葉片中內(nèi)生真菌的分布并不均一，差異比較明顯，說明茶樹內(nèi)生真菌具有一定的組織專一性。與徐焰平等[17]、汪立群等[18]的研究結(jié)果一致表明，品種也影響茶樹內(nèi)生真菌種類和數(shù)量分布。

陳暉奇[19]、武漢琴[20]研究認(rèn)為刺盤孢、芒果球座菌為茶樹的優(yōu)勢菌群，本研究中葡萄座腔菌的分離頻率為18.67%，與盤長孢狀刺盤孢、芒果球座菌同為茶樹優(yōu)勢菌群，這可能與所處地域、外界環(huán)境及茶樹本身微環(huán)境有關(guān)，即不同的外部及內(nèi)部環(huán)境造就了不同內(nèi)生真菌類群的入侵和定殖。在鑒定過的內(nèi)生真菌中有3個屬僅各分離到1株，它們可能在組織內(nèi)分布頻率較低、或培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不大適合而降低了分離率，也可能本身為機(jī)會菌。

從所分離到的內(nèi)生真菌種群來看，本研究所獲得的茶樹內(nèi)生真菌多數(shù)是腐生性或土壤中普遍存在的真菌類群。但所采集的樣本全部來自健康茶樹組織，在茶樹材料表面消毒徹底的前提下，認(rèn)為這些真菌在茶樹組織內(nèi)符合Petrini[1]及Stone等[2]對于植物內(nèi)生真菌的有關(guān)定義，可以認(rèn)為這些真菌是內(nèi)生的或至少是不引起病害的寄生性真菌。

內(nèi)生真菌在植物中的分布受生境、季節(jié)、年齡等因素的影響[21]，其多樣性的研究往往受到內(nèi)生真菌分離方法的制約。因此，在隨后的茶樹內(nèi)生真菌研究中，應(yīng)綜合考慮這些因素，獲得大量的內(nèi)生真菌資源，為進(jìn)一步尋找茶樹促生真菌以及篩選內(nèi)生真菌來源的生物活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

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