李元 吳迪 王天玨 周宏志 胡開進(jìn)

因炎癥、外傷、腫瘤等原因所致的牙槽骨、頜骨缺損可嚴(yán)重影響患者口腔功能及美觀，骨替代材料引導(dǎo)和誘導(dǎo)骨再生是骨缺損修復(fù)重建的研究熱點(diǎn)[1-2]。自固化磷酸鈣(calcium phosphate cement, CPC)可與水或水溶液調(diào)拌為糊劑后自行固化形成磷灰石，具有良好的生物相容性、骨引導(dǎo)性、可塑形性和抗壓性，是骨缺損區(qū)域理想的生物充填材料[3-4]。但是，單純的CPC材料存在缺乏誘導(dǎo)骨再生活性、體內(nèi)降解速度較慢等問題，不適合牙槽骨或頜骨缺損修復(fù)。近年來研究表明神經(jīng)多肽P物質(zhì)(Substance P，SP)不僅是痛覺傳導(dǎo)分子，還是骨再生與改建的信號(hào)分子，能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)血管新生[5-9]。據(jù)此，本研究采用SP、Ⅰ型膠原(Col- Ⅰ)與CPC模塊化仿生設(shè)計(jì)構(gòu)建復(fù)合骨替代材料，觀察不同構(gòu)建模式對(duì)材料修復(fù)頜骨缺損效率的影響。

1 材料與方法

1.1 模塊化復(fù)合材料的構(gòu)建

自固化磷酸鈣人工骨(商品名：瑞邦骨泰)[國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3460199號(hào)，上海瑞邦生物材料有限公司]；P物質(zhì)(多肽氨基酸序列RPKPQQFFGLM- NH2，純度>98%)購自上海生工公司，配制工作濃度10-3mol/L；Ⅰ型膠原取材于SD雄性大鼠尾腱，5 mol/L醋酸溶解48 h，離心去除雜質(zhì)，雙蒸水半透膜(截留分子量25 000)透析72 h去除醋酸，獲得3%膠原溶液；膠原溶液-60 ℃凍干24 h，剪切獲得1 mm×1 mm×1 mm膠原海綿顆粒；膠原溶液內(nèi)加入0.1 mol/L濃度MES配制中性緩沖液，再加入10-3mol/L SP及共價(jià)交聯(lián)劑EDC/NHS，SP/EDC/NHS摩爾比1∶1.2∶0.6，磁力攪拌反應(yīng)24 h，雙蒸水半透膜透析72 h去除交聯(lián)劑，獲得共價(jià)交聯(lián)SP/Col- Ⅰ溶液。

CPC粉與各種固化液混合調(diào)拌(粉/液質(zhì)量體積比：3.0 g/ml)制成糊劑后，充填于直徑8 mm、厚度2 mm不銹鋼模具中，自行固化6 h后脫模，獲得實(shí)驗(yàn)試件。對(duì)照組試件采用原配售固化液與CPC調(diào)拌制備，記為A組。實(shí)驗(yàn)組共5 組：采用共價(jià)交聯(lián)SP/Col- Ⅰ溶液與CPC調(diào)拌制備試件記為B組；將SP多肽按照10-3mol/L濃度直接加入3%膠原溶液混合后再與CPC調(diào)拌制備試件記為C組；SP加入普通固化液與CPC調(diào)拌制備糊劑，再混合50%體積比的Col- Ⅰ海綿顆粒，固化制備試件記為D組；SP加入普通固化液與CPC調(diào)拌制備試件記為E組；3%膠原溶液與CPC調(diào)拌制備試件記為F組。

1.2 材料試件掃描電鏡觀察

各組試件取橫斷截面干燥噴金，掃描電鏡(德國卡爾蔡司公司)1 000 倍觀察試件的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，D組試件內(nèi)膠原海綿顆粒截面采用300 倍觀察(圖 1)。

圖 1 掃描電鏡下各組材料橫斷面形貌

1.3 兔頜骨缺損修復(fù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將30 只成年新西蘭兔(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分為6 組，每組5 只。術(shù)前給予頭孢唑啉鈉肌注，麻醉后取頜下切口顯露一側(cè)下頜骨體部，用環(huán)鉆于第一至第三臼齒區(qū)制備8 mm直徑圓形半層頜骨缺損，分別植入預(yù)制的各組材料試件，分層縫合傷口。術(shù)后進(jìn)軟食，抗生素注射3 d預(yù)防感染，7 d拆除縫線。8 周后4%戊巴比妥靜脈注射處死動(dòng)物，取下頜骨體，標(biāo)本固定備用。

1.4 骨缺損影像學(xué)檢查

使用Micro CT(德國西門子公司)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行掃描重建，精度40 μm，觀察骨缺損區(qū)材料降解與新骨再生情況。

1.5 骨缺損組織學(xué)檢查

頜骨標(biāo)本甲酸-甲酸鈉混合溶液脫鈣2 周，常規(guī)包埋切片，Masson三色法染色，光學(xué)顯微鏡觀察缺損區(qū)組織學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件行ANOVA分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)

掃描電鏡顯示：A組材料微孔隙多為數(shù)微米直徑，無超過50 μm孔隙；B、C、F組結(jié)構(gòu)相似，空隙直徑較大，多為50 μm左右；D組可見Col- Ⅰ海綿顆粒在CPC內(nèi)形成300～1 000 μm大孔隙；E組與A組結(jié)構(gòu)相似(圖 1)。

2.2 影像學(xué)檢查結(jié)果

Micro- CT顯示植入體內(nèi)8 周后，A組材料僅表面出現(xiàn)少量坑狀吸收，新生骨骨量較少。B組材料形態(tài)較完整，新生骨量少。C組材料吸收較明顯，新生骨骨量較多。D組材料吸收明顯，原有形態(tài)喪失，吸收部分已被大量新生骨組織占據(jù)。E組材料表面吸收，被較多新生骨組織覆蓋。F組材料不規(guī)則吸收，部分新骨長入。Micro- CT數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果證實(shí)，D組新生骨量及材料降解率明顯優(yōu)于其余5 組，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖 2)。

2.3 組織學(xué)檢查結(jié)果

Masson三色法染色顯示，A組材料周邊有引導(dǎo)骨爬行替代表現(xiàn)。B組材料周邊僅有少量新骨再生。C組材料吸收較明顯，有較多新骨長入。D組材料形態(tài)喪失，大量新骨組織包裹殘余材料。E組有較多新骨與材料緊密結(jié)合。F組材料有不規(guī)則新骨長入(圖 3)。

3 討 論

理想的的骨替代材料應(yīng)具備“4F”性能：Form即能夠填充復(fù)雜三維骨缺損，F(xiàn)ixation即能夠承載一定壓力，F(xiàn)unction即能夠與周圍骨組織功能性整合，F(xiàn)ormation即能夠誘導(dǎo)促進(jìn)骨再生[8]。模塊化設(shè)計(jì)構(gòu)建骨替代材料是實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的有效途徑，并有利于臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，其中的關(guān)鍵問題包括材料的骨引導(dǎo)能力、骨誘導(dǎo)能力、孔隙結(jié)構(gòu)、生物相容性及安全性等。

CPC固化后形成磷灰石結(jié)晶，與天然骨組織的無機(jī)成分類似，具有良好的骨引導(dǎo)性及生物相容性，但單純CPC缺乏誘導(dǎo)骨再生能力，且降解速率緩慢[11]。Ⅰ型膠原是天然骨中最主要的有機(jī)成分，常用作組織工程載體，利于成骨細(xì)胞粘附生長和增殖分化[12-13]。但單純膠原材料無法獲得足夠的機(jī)械強(qiáng)度。本研究擬采用仿生模塊化設(shè)計(jì)構(gòu)建復(fù)合骨替代材料，提高材料綜合性能，使其具備良好的成骨轉(zhuǎn)化效率，其中，CPC作為無機(jī)成分，可塑形填充缺損、保障材料強(qiáng)度以及提供骨引導(dǎo)功能，Ⅰ型膠原作為有機(jī)成分，可調(diào)整材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)并提供骨引導(dǎo)、骨誘導(dǎo)功能，P物質(zhì)作為生物活性分子，可提供體內(nèi)誘導(dǎo)骨再生和血管新生功能。

圖 2 各組材料植入8 周后Micro- CT掃描三維重建對(duì)比(藍(lán)綠色： 材料； 黃色： 新生骨組織)

圖 3 各組材料植入8 周后組織學(xué)表現(xiàn)對(duì)比

材料孔隙結(jié)構(gòu)和孔隙率是影響骨替代材料成骨能力的重要因素。研究表明，使用膠原溶液調(diào)拌固化CPC可以優(yōu)化材料內(nèi)部微孔隙結(jié)構(gòu)，增大孔隙直徑至50 μm左右。理想的成骨材料孔隙直徑應(yīng)達(dá)到200～900 μm[14]，為此，我們采用膠原海綿顆?；烊隒PC糊劑，固化后電鏡觀察確定實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明大孔隙結(jié)構(gòu)顯著增強(qiáng)材料降解和新骨再生。值得指出的是，材料強(qiáng)度和材料孔隙結(jié)構(gòu)是相對(duì)的兩面，膠原海綿顆?；烊隒PC會(huì)降低材料的整體強(qiáng)度，但本研究前期相關(guān)生物力學(xué)測(cè)試表明，其強(qiáng)度與松質(zhì)骨類似，因此適合于初期負(fù)載強(qiáng)度較低的牙槽骨缺損修復(fù)。

與BMP等常用骨誘導(dǎo)高分子蛋白相比，SP是一種小分子多肽，具有易于合成、保存等優(yōu)點(diǎn)，使用成本較低。SP體內(nèi)水解半衰期時(shí)間約為5 min[15-17]，因此，SP需要合適的運(yùn)載、定位、緩釋系統(tǒng)以保持其穩(wěn)定誘導(dǎo)成骨作用。本研究設(shè)計(jì)中，通過蛋白共價(jià)交聯(lián)技術(shù)，將Ⅰ型膠原分子與SP互相連接形成大分子結(jié)構(gòu)，意圖避免SP過早水解[18-19]。但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與直接添加SP多肽至CPC復(fù)合材料內(nèi)部的3 組相比(C組、D組、E組)，Col- Ⅰ/SP共價(jià)交聯(lián)組(B組)的成骨效果最差。分析其原因應(yīng)為共價(jià)交聯(lián)過度限制了SP的釋放，導(dǎo)致其活性減弱甚至喪失。CPC本身即是一種良好的蛋白、藥物運(yùn)載緩釋材料，其固化反應(yīng)溫和，不影響蛋白活性，固化后孔隙微小，可以阻擋蛋白水解酶等大分子通過，隨CPC逐漸降解，其中活性分子即可緩釋發(fā)揮作用[20]。

綜上所述，模塊化設(shè)計(jì)構(gòu)建由CPC、SP和Col- Ⅰ組成的復(fù)合材料具有誘導(dǎo)骨再生活性，并促進(jìn)材料體內(nèi)降解；材料構(gòu)建模式影響其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和活性分子SP緩釋，進(jìn)而影響材料誘導(dǎo)成骨效率；CPC、SP及Ⅰ型膠原海綿構(gòu)建的多孔材料可能在牙槽骨缺損修復(fù)方面具有良好應(yīng)用潛力。