袁林 曹依娜 楊征毅 孫晉 潘廣嗣 錢鈞 宋晶晶 王涵

頜骨來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(orofacial bone- arrow- derived MSCs, OMMSCs)可以從頜面部整形外科手術(shù)廢棄的頜骨碎片獲得，且OMMSCs 增殖及成骨能力均強(qiáng)于長骨來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力并且具有免疫調(diào)節(jié)的能力，可調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能[2-3]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是如何調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的機(jī)制還并不完全清楚。

外泌體(exosome, Exo)是細(xì)胞主動分泌的大小均一，直徑小于200 nm，密度1.10～1.18 g/ml 的囊泡樣小體。外泌體可攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA，參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長等過程。在MSCs的調(diào)控免疫反應(yīng)中，外泌體發(fā)揮著重要作用[4]。miRNA是一類長度在19～24 個(gè)核苷酸(nt) 左右的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA, 它徹底改變了我們觀察基因調(diào)控的方式[5]，并正在改變我們關(guān)于對免疫系統(tǒng)的發(fā)展和免疫調(diào)節(jié)功能的理解。許多miRNA與免疫反應(yīng)有著密切的關(guān)系，如miR- 223、miRNA let- 7c在免疫調(diào)節(jié)中也有重要的作用，有報(bào)道指出它們都能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化[6-7]。

近年來關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體相關(guān)研究越來越多[8]，OMMSCs這一特殊的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的特性及它所能發(fā)揮的作用研究尚少，它是如何調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的機(jī)制的也還沒有明確報(bào)道。本研究觀察頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體(OMMSCs- Exo)的特性并初步探究它對巨噬細(xì)胞調(diào)控的作用，為頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞的運(yùn)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

因正頜手術(shù)磨除的頜骨碎片(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院)；α- EM 培養(yǎng)基、2.5 g/L 胰蛋白酶、谷氨酰胺(Gibco，美國)；胎牛血清(杭州四季青)；β- 甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸、吲哚美辛、胰島素、異丁基甲基黃嘌呤(Sigma，美國)；6、24、96 孔培養(yǎng)板(Falcon，美國)，激光共聚焦培養(yǎng)皿(Nest，美國)；人淋巴細(xì)胞分離液(MP Biomedicals，美國)；磁珠分選試劑盒(Miltenyi，德國)；Exo提取試劑盒(SBI,美國)；茜素紅(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站)；Hoechst33342 染液，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT- PCR試劑盒(TaKaRa，日本)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；酶標(biāo)儀(Tecan，奧地利)；FITC 直標(biāo)STRO- 1、CD105，PE 直標(biāo)CD90、CD45、CD34、CD31抗體，流式細(xì)胞儀(BD，美國)；二氧化碳恒溫孵箱(Forma，美國)；分光亮度儀(Eppendorf，德國)；熒光倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)(Olympus，日本)；低溫高速離心機(jī)(Heraeus，德國)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(BIO- RAD，美國)；引物由上海生工合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人OMMSCs原代細(xì)胞培養(yǎng)及克隆形成能力分析 無菌取得正頜手術(shù)中廢棄的頜骨骨松質(zhì)，大量PBS 沖洗后800 r/min 離心5 min，棄上清，再用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的α- EM 培養(yǎng)液重懸后連同剪碎的頜骨骨碎片接種于6 孔板中進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞融合約80%時(shí)，消化傳代，記為P1。之后胰酶消化后常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期生長干細(xì)胞行克隆形成分析實(shí)驗(yàn)，按照下列公式計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)量/接種細(xì)胞數(shù)量× 100%

1.2.2 人OMMSCs表面標(biāo)記檢測 用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS 洗2 次，每次5 min，PBS 重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，以每管200 μl分裝至EP管中，分別加入熒光直標(biāo)STRO- 1、CD105、CD90、CD45、CD31、CD34抗體2 μl后，4 ℃避光孵育1 h，PBS 洗滌2 遍后重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 人OMMSCs多向分化能力的檢測 分別用成骨誘導(dǎo)劑(含10%FBS的ɑ- EM 培養(yǎng)液，10 mmol/L的β- 甘油磷酸鈉液，0.3 mmol/L的抗壞血酸，100 nmol/L的地塞米松液)、成脂誘導(dǎo)劑(含10%FBS的ɑ- EM 培養(yǎng)液，10 nmol/L地塞米松，200 μg/mL吲哚美辛，5 μg/ml胰島素，0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤)誘導(dǎo)OMMSCs向成骨和成脂分化，并分別用茜素紅鈣鹽染色法、油紅O染色法來測定OMMSCs的多向分化能力。

1.2.4 外泌體的分離與鑒定 接種OMMSCs，將血清以100 000 g 4 ℃ 3 h離心去除血清中外泌體后的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集上清。按照SBI試劑盒說明書提取外泌體后加入200 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，按說明書用BCA法檢測蛋白量后置于-20 ℃保存。磷鎢酸負(fù)染外泌體后于透射電子顯微鏡觀察并照相。隨機(jī)選取20 個(gè)外泌體測量其直徑。另取15 μg外泌體懸液，Western blot檢測CD63、CD81表達(dá)。

1.2.5 外周血單核細(xì)胞的分離 無菌取得志愿者全血25 ml，按1∶1比例用PBS 稀釋,按1∶1比例緩慢加入到人淋巴細(xì)胞分離液之上，2 000 r/min離心20 min。離心后小心吸取第2層白色云霧狀層， PBS充分混勻后，1 300 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2 次，按Miltenyi磁珠分選試劑盒要求收集CD14+的單核細(xì)胞，重懸于含有10% FBS的1640培養(yǎng)基中，每孔2×105接種于6孔板中，第7天成長為巨噬細(xì)胞。

1.2.6 PKH26 熒光標(biāo)記外泌體觀察與巨噬細(xì)胞間相互作用 取外泌體懸液100 μl，重懸于250 μl Diluent C中，另取1 μl PKH26 加入混勻后室溫孵育5 min，加入等體積血清( 經(jīng)離心去除外泌體) 終止,再次用SBI試劑盒提取Exo。取10 μg/ml染色后的Exo加入培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的6孔板中，共培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定，用CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞膜，DAPI 染核置于共聚焦顯微鏡下觀察并照相

1.2.7 RT- PCR 按照試劑盒說明書提取外泌體及巨噬細(xì)胞中的miRNA，按照說明書用TaqMan microRNA Reverse TranscriptionKit分別逆轉(zhuǎn)并檢測miR- 223、miR- let- 7c表達(dá)量，以miR U6 作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以CFX Manager 軟件進(jìn)行分析。

1.3 圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IPP 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，DP MANAGER 軟件進(jìn)行熒光圖片合成，F(xiàn)lowjo 6.0 進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析，SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2 個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，3 個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 人OMMSCs的形態(tài)學(xué)觀察及CFU- F分析

人OMMSCs具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征，細(xì)胞多呈長梭形，具有2～3 個(gè)細(xì)胞凸起，細(xì)胞核居中，且在體外呈集落樣增殖，形成克隆細(xì)胞簇(圖 1A)，經(jīng)計(jì)算，OMMSCs的CFU- F為(24.23±1.13)%(圖 1B、C)。

2.2 人OMMSCS表面標(biāo)志物的表達(dá)

通過流式細(xì)胞儀檢測，人OMMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)見圖 2，OMMSCs陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD90、CD105、Stro- 1(陽性率分別為99.96%、99.67%、16.2%),而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31、CD34、CD45表達(dá)為陰性(陽性率分別為2.78%、0.07%、0.01%)，以上符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性。

A： 人OMMSCs(相差顯微鏡， ×100)； B～C： 人OMMSCs形成的克隆(甲苯胺藍(lán)染色， C， ×40)

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測人OMMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)

2.3 人OMMSCs向成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞分化

經(jīng)成骨誘導(dǎo)21 d后，鏡下可見細(xì)胞復(fù)層密集生長，茜素紅染色顯示2 組均形成鈣化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)呈紅色，呈散在分布，OMMSCs向成骨細(xì)胞分化(圖 3A)。成脂誘導(dǎo)21 d,油紅“O”染色后，圓形液滴呈紅色證實(shí)為脂滴，OMMSCs向脂肪細(xì)胞分化(圖 3B)。

2.4 OMMSCs- Exo的特性

透射電鏡下觀察OMMSCs- Exo呈圓形或橢圓形，直徑約60～160 nm(107.22±33.56)，有完整胞膜結(jié)構(gòu)(圖 4A);經(jīng)過Western blot 證實(shí)其表達(dá)外泌體特有的表面標(biāo)志CD63、CD81，而OMMSCs幾乎不表達(dá)(圖 4B)。

圖 3 人OMMSCs向成骨成脂細(xì)胞分化情況

2.5 巨噬細(xì)胞吞噬外泌體的觀察

PKH26染色的外泌體與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后免疫熒光染色。與上排的對照組相比，在共聚焦顯微鏡觀察可見外泌體被巨噬細(xì)胞攝取并分布在細(xì)胞核周圍(胞質(zhì))。其中，綠色核膜的為巨噬細(xì)胞，加入染為紅色的OMMSCs來源的外泌體后，可見巨噬細(xì)胞內(nèi)含有紅色的外泌體(圖 5)。

A： 透射電鏡形態(tài)觀察; B： Western blot檢測CD63和CD81的表達(dá)

圖 5 巨噬細(xì)胞吞噬OMMSCs- Exo(綠色： 巨噬細(xì)胞； 藍(lán)色： 細(xì)胞核； 紅色： 外泌體)

2.6 OMMSCs- Exo中相關(guān)miRNA調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中相應(yīng)miRNA表達(dá)

OMMSCs- Exo內(nèi)含有miR- 223、miR- let- 7c 這2種與巨噬細(xì)胞的調(diào)控緊密相關(guān)的miRNA，相比較而言，miR- let- 7c含量高于miR- 223(P<0.05)。為進(jìn)一步確定共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞內(nèi)的變化，將巨噬細(xì)胞與外泌體共培養(yǎng)72 h后，提取巨噬細(xì)胞內(nèi)的miRNA，發(fā)現(xiàn)與OMMSCs- Exo共培養(yǎng)后的巨噬細(xì)胞與加入等體積PBS的巨噬細(xì)胞(對照組)相比，miR- 223的含量高于對照組(P<0.05)。

3 討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞除了多向分化及自我更新能力外，其免疫調(diào)節(jié)功能也受到廣泛關(guān)注。巨噬細(xì)胞是重要的天然免疫細(xì)胞，在抗感染中的作用毋庸置疑。間充質(zhì)干細(xì)胞對于巨噬細(xì)胞的調(diào)控特別是巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控是近來的研究重點(diǎn)，但對于其調(diào)控機(jī)制并不清楚。因此，探究其內(nèi)在機(jī)制對間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞治療有重要的意義。間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌起重要作用的外泌體[9-10],最近的報(bào)道指出mir- let- 7c，miR- 223在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化上發(fā)揮重要功能[6-7]?；谶@樣的背景，本研究將焦點(diǎn)放在了OMMSCs所分泌的外泌體及其所含microRNA的對巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用上。

A: 外泌體中2 種micro RNA的表達(dá); B： OMMSCs- Exo與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后巨噬細(xì)胞中miR- 223的表達(dá)

本研究成功分離出人OMMSCs 符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性,并成功從其培養(yǎng)基中獲得了OMMSCs來源的外泌體，電鏡下觀察近似圓形，直徑在40～160 nm之間，表達(dá)表面標(biāo)志CD63、CD81。這些是相關(guān)研究中第一次對OMMSCs的外泌體相關(guān)特性有了具體了解。

實(shí)驗(yàn)中將頜骨來源OMMSCs的外泌體與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可見外泌體被巨噬細(xì)胞攝取并分布在細(xì)胞核周圍。提示頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體通過巨噬細(xì)胞的吞噬作用參與到免疫調(diào)節(jié)的活動中來。由于miRNA是外泌體所含的重要成分，我們發(fā)現(xiàn)，OMMSCs所分泌的外泌體中含有內(nèi)含有免疫相關(guān)miRNA 如miR- 223 和miR- let- 7c。進(jìn)一步檢測與共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞的miR- 223和miR- let- 7c，可發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞的miR- 223增加，而根據(jù)之前的研究成果，miR- 223增加后，可通過抑制Pknox1的表達(dá)，使得巨噬細(xì)胞向M2型極化。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證實(shí)，OMMSCs中所含有的外泌體通過巨噬細(xì)胞的吞噬作用來調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能，而這種調(diào)控可能是通過相關(guān)的miRNA特別是miR- 223在起作用。但關(guān)于頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞如何能通過外秘體中的miRNA調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)需要進(jìn)一步的研究?？傊?，增強(qiáng)對頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體生物學(xué)特性的了解，及其對巨噬細(xì)胞調(diào)控的作用，將有助于未來更好地探討其在臨床應(yīng)用中的潛能。