張富華 李矛 韋智君 張建鳳

細菌感染是引起根尖周病的主要原因，根尖周炎的治療效果取決于是否能夠完全清除壞死的根管系統(tǒng)內(nèi)感染的微生物[1]。而且，現(xiàn)今的研究發(fā)現(xiàn)牙髓根尖周病的細菌感染主要是以微生物生物膜形式存在[2]。致病的生物膜中通常是具有多種細菌微生物相互作用形成[3]。有消毒滅菌效果的根管沖洗液和其他局部試劑及藥物對清除這些微生物具有十分重要的作用[4]。納米銀作為無機抗菌材料，由于其原子排列表現(xiàn)為介于固體和分子之間的“介態(tài)”表現(xiàn)出量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和極大的比表面積，具有其他載銀無機抗菌材料無法比擬的抗菌活性[5]。本研究在MBECTMP&G Assay上構(gòu)建多菌種生物膜，檢測納米銀顆粒對于多菌種生物膜內(nèi)糞腸球菌殺菌效果，為無機納米抗菌劑應(yīng)用于根管消毒提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌(Enterococcusfaecalis，ATCC 29212)，具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum，ATCC 25586)，產(chǎn)黑色素普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica，ATCC 25845,安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)中心實驗室提供)。

1.1 細菌復(fù)蘇培養(yǎng)鑒定和菌懸液制備糞腸球菌

首先將糞腸球菌和產(chǎn)黑色素普雷沃菌接種到牛心腦浸液(BHI)瓊脂平板，具核梭桿菌轉(zhuǎn)種至含 5%(W/V)脫纖維羊血的厭氧瓊脂平板上。3 種細菌置厭氧環(huán)境中(80%N2， 10%H2，10%CO2)， 37 ℃培養(yǎng)備用。以McFarland標(biāo)準(zhǔn)用細菌濁度儀調(diào)菌懸液濃度至107～108CFU/ml備用。將混合菌懸濁液放入MBECTMP&G Assay裝置，分成3 個實驗組(每組25 個樣本)和1 個陰性對照組(10 個樣本)。3 個實驗組中分別加入：0.1%納米銀顆粒(12～15 nm)懸濁液，0.1%納米銀顆粒(100 nm)懸濁液和2%次氯酸鈉溶液各100 μl。陰性對照組加入100 μl生理鹽水(PS)。

利用糞腸球菌選擇瓊脂，KVLB凍溶血平板和具核梭桿菌選擇培養(yǎng)基[6]分別用來分離培養(yǎng)，以確定生物膜內(nèi)各種細菌的存在。

1.2 疊氮溴化丙錠(PMA)處理

按照李聰聰?shù)萚7]的方法制備疊氮溴化丙錠(PMA)儲備液并進行PMA處理。

1.3 DNA提取以及熒光定量PCR(qPCR)檢測

將所有樣本利用細菌基因組DNA快速提取試劑盒(ATP Genomic DNA Mini Kit?; ATP Biotech, Taipei,Taiwan)提取基因組DNA，作為熒光定量PCR的反應(yīng)模板。操作按照生產(chǎn)廠家說明書進行。采用Taqman?qPCR 方法定量檢測糞腸球菌[8]。

每次定量 PCR 反應(yīng)都設(shè)空白對照(以相同體積的雙蒸水取代 DNA)，每次測定設(shè)2 個平行樣。

1.4 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將提取到的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品采用去離子水10 倍梯度稀釋，進行PCR反應(yīng)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以臨界循環(huán)數(shù)(cycle threshold, Ct)數(shù)值為縱坐標(biāo)

建立qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 1)。

圖 1 qPCR結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件利用配對t檢驗方法和獨立樣本t檢驗方法對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

將3 個實驗組和陰性對照組中分別使用PMA和未用PMA處理糞腸球菌得到的qPCR的Ct值進行配對t檢驗(表 1)。

將3 個實驗組和陰性對照組使用和不使用PMA qPCR檢測到的Ct值的差值(利用獨立樣本t檢驗進行比較：納米銀(12～15) nm實驗組的差值要大于納米銀(100 nm)實驗組，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；納米銀(12～15) nm實驗組的差值要大于次氯酸鈉實驗組，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；納米銀(100 nm)實驗組的差值要大于次氯酸鈉實驗組，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(表 2)。

表 1 各組使用PMA和未用PMA糞腸球菌qPCR的Ct值變化

表 2 糞腸球菌qPCR的Ct值變化(△Ct)組間兩兩比較

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)納米銀對于浮游狀態(tài)的糞腸球菌[9]以及生物膜狀態(tài)的糞腸球菌[10-11]都有著抑制作用。但是，研究中的生物膜均為單一菌種生物膜，本研究中選取3 種細菌構(gòu)建混合菌種生物膜，以生存在混合菌種生物膜內(nèi)的糞腸球菌為抗菌研究對象更加符合臨床感染根管內(nèi)細菌感染情況。

本實驗選取3 種細菌(糞腸球菌，產(chǎn)黑色素普雷沃菌以及具核梭桿菌)構(gòu)成多菌種生物膜，并分析抗菌藥物對于其中糞腸球菌的抗菌作用，原因在于: ①這3 種細菌都可以在根管治療失敗的感染根管中分離出[12-14]；②頑固性性根尖周炎及治療后再感染的根管內(nèi)糞腸球菌是主要的致病菌[14-16]；③這3 種細菌可以形成生物膜并且可以共聚集在一起。

檢測存在于感染性疾病病灶中的生活致病菌對于疾病的診斷和治療有著重要意義。近年來學(xué)者們利用DNA結(jié)合染料疊氮溴化乙錠(ethidium monoazide，EMA)和PMA;PMA用來判別和檢測死亡細菌和生活細菌。PMA和EMA可以選擇性的結(jié)合死亡細胞(細胞壁和細胞膜已破損的細胞)“暴露”出來的DNA，然后與定量PCR聯(lián)合使用，不擴增死細胞的DNA，選擇性的擴增活細胞DNA，從而可以定量檢測生活細菌[17-22]。但是，一些研究發(fā)現(xiàn)EMA可以穿透某些細菌的生活細胞細胞膜[20,23-24]，從而可能會影響實驗的準(zhǔn)確性。 因此，本研究采用PMA結(jié)合定量PCR方法檢測多菌種生物膜內(nèi)生活糞腸球菌的數(shù)量及其活菌數(shù)量，以此來分析抗菌藥物的殺菌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)各試驗組中使用PMA和不使用PMA的Ct值的差別都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明不同直徑(12～15 nm，100 nm)的納米銀顆粒和次氯酸鈉溶液對于多菌種生物膜中的糞腸球菌都有著顯著的抑制作用。本研究將qPCR檢測到的Ct值的差值利用獨立樣本t檢驗以比較不同抗菌劑的抗菌性能的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同直徑的0.1%納米銀顆粒的Ct值要高于2%次氯酸鈉，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；直徑12～15 nm納米銀顆粒的Ct值要高于100 nm的納米銀顆粒，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。納米銀的抗菌機制可能是因為其顆粒粒徑小，容易穿透細菌胞膜進入菌體內(nèi)，具有量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，和致病微生物的蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合作用有關(guān)[25-26]，而納米銀顆粒的直徑越小，表面效應(yīng)越強，和微生物作用位點結(jié)合作用越強[26-27]。