李明杰+馮法節(jié)+張寶+古力+王豐青+楊艷會(huì)+田云鶴+陳新建+張重義

[摘要]連作障礙的研究雖然已經(jīng)有多年的歷史，但目前仍沒有有效的治療方法，其根本原因是其形成體系的復(fù)雜性。該文從連作植物根際土壤多元因子的互作關(guān)系入手，詳細(xì)闡述了栽培植物連作障礙形成的生理生態(tài)機(jī)制，提出了栽培藥用植物、自毒化感物質(zhì)和根際微生物間復(fù)雜的多元互作是驅(qū)動(dòng)連作障礙形成的根本原因，指出了植物功能基因組學(xué)和代謝組學(xué)以及微生物宏組學(xué)相結(jié)合的多元組學(xué)技術(shù)在深入理解特定生境多因子互作關(guān)系研究中的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，該文以地黃為例，從根際化感自毒物質(zhì)累積效應(yīng)、根際微生態(tài)的災(zāi)變及連作植株的分子響應(yīng)等多元角度綜述了地黃連作障礙形成的分子機(jī)制，并詳細(xì)總結(jié)了多元組學(xué)技術(shù)在這些機(jī)制研究中的運(yùn)用和進(jìn)展。該文為從分子水平上系統(tǒng)地揭示栽培藥用植物連作障礙形成的分子機(jī)制提供了新的思路。

[關(guān)鍵詞]地黃； 多元組學(xué)； 連作障礙； 分子機(jī)制； 栽培藥用植物

[Abstract]Although consecutive monoculture problems have been studied for many years， no effective treatments are currently available. The complexity of systems triggered the formation of consecutive monoculture problems was one major cause. This paper elaborated the physiological and ecological mechanisms of consecutive monoculture problem formation based on the interaction relationship among multiple factors presented in the rhizosphere soil of consecutive monoculture plants. At same time， in this paper the multiple interactions among cultivated medicinal plants， autotoxic allelochemicals and rhizosphere microbial were proposed to be most important causes that derived the formation of consecutive monoculture problem. The paper also highlighted the advantage of 'omics' technologies integrating plant functional genomics and metabolomics as well as microbial macro-omics in understanding the multiple factor interaction under a particular ecological environment. Additionally， taking R. glutinosa as an example， the paper reviewed the molecular mechanism for the formation of R. glutinosa consecutive monoculture problem from the perspective of the accumulation of allelopathic autotoxins， the rhizosphere microecology catastrophe and theresponding of consecutive monoculture plants. Simultaneously， the roles of mutilple 'omics' technologies in comprehending these formation mechanism were described in detail. This paper provides finally a new insight to solve systematically the mechanism of consecutive monoculture problem formation on molecular level.

[Key words]Rehmannia glutinosa； mutil-omics； consecutive monoculture problem； molecular mechanisms； cultivated medicinal plants

隨著現(xiàn)代中藥農(nóng)業(yè)的發(fā)展，藥用植物大面積單一化連續(xù)種植，導(dǎo)致中藥材產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣、生長(zhǎng)狀況變差、病蟲害加重等連作障礙現(xiàn)象日趨嚴(yán)重^[1-2]。連作障礙現(xiàn)象在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在，在藥用植物上表現(xiàn)尤為突出。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約占70%以上的根（根莖）類藥材人工種植時(shí)均存在不同程度的連作障礙，如人參、三七、地黃、黃連和當(dāng)歸等^[3-5]。由于許多藥農(nóng)對(duì)連作障礙缺乏科學(xué)的認(rèn)識(shí)，盲目加大農(nóng)藥和肥料的使用，以期防治病蟲害和提高產(chǎn)量，致使生產(chǎn)成本大幅增加、農(nóng)藥殘留超標(biāo)、藥材品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約了藥用資源的可持續(xù)利用和區(qū)域經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。同時(shí)，連作導(dǎo)致中藥農(nóng)業(yè)生境破壞、生物多樣性下降、生態(tài)位變窄，過度使用的農(nóng)藥、化肥又加劇了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的惡化，中藥資源可持續(xù)發(fā)展受到空前嚴(yán)重的威脅和巨大的挑戰(zhàn)。因此，連作障礙問題的研究已成為制約中藥資源可持續(xù)利用和影響中醫(yī)藥行業(yè)健康發(fā)展的戰(zhàn)略性課題，也是當(dāng)前中藥資源生態(tài)學(xué)迫切需要解決的重要內(nèi)容，成為國(guó)內(nèi)外同行研究的熱點(diǎn)。

1 栽培植物連作障礙形成的生理生態(tài)機(jī)制

1.1 連作障礙的形成與化感自毒作用 目前關(guān)于栽培藥用植物連作障礙的研究雖有大量的報(bào)道，但對(duì)其形成機(jī)制仍處于探索之中。越來越多的研究表明，栽培植物根際自毒物質(zhì)的持續(xù)性積累及其所引發(fā)的根際災(zāi)變可能是造成連作障礙的主導(dǎo)因素^[6-9]。植物在正常的生命活動(dòng)過程中，會(huì)通過自身分泌、莖葉淋溶及殘?bào)w分解等方式向環(huán)境不斷釋放一些影響其他植物生長(zhǎng)的次生代謝物質(zhì)，這些次生代謝物質(zhì)在土壤中持續(xù)累積，對(duì)植物本身也產(chǎn)生毒害作用，即化感自毒作用（allelopathic autotoxicity），這些分泌物則被稱為自毒化感物質(zhì)（autotoxic allelochemicals）^[6]。植物中所發(fā)現(xiàn)的自毒化感物質(zhì)主要來源于有機(jī)酸、醛類芳香酸、香豆素、醌類、生物堿和類萜等植物次生代謝產(chǎn)物，其中酚類和類萜類化合物是高等植物的主要化感物質(zhì)。任何植物都不可能只產(chǎn)生一種或幾種化感物質(zhì)，植物化感作用往往是眾多化感物質(zhì)相互作用的結(jié)果。植物所生成化感物質(zhì)不論種類多少，其化感作用強(qiáng)弱通常與其對(duì)應(yīng)濃度呈正相關(guān)，表現(xiàn)出“低促、高抑”現(xiàn)象^{[6，10]}。比如：在地黃栽培實(shí)踐中，只有完整種植地黃一年的地塊才會(huì)對(duì)再植地黃產(chǎn)生強(qiáng)烈的傷害現(xiàn)象。此外，連作傷害的發(fā)生與植物所處的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)也存在著較為密切的關(guān)系。比如連作地黃傷害的關(guān)鍵期往往發(fā)生在拉線期前期（幼苗后期）^[11]，生產(chǎn)中常會(huì)采用育苗移栽的方法跳過此敏感期，來減緩連作傷害。

1.2 化感自毒作用與根際生態(tài)災(zāi)變機(jī)制 栽培植物根際土壤是一個(gè)有生命的、動(dòng)態(tài)的多元世界，聚居著細(xì)菌、放線菌、真菌、藻、原生動(dòng)物和病毒，它們對(duì)土壤肥力的形成、植物營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)化起著極其重要的作用。在藥用植物連作后，根際化感物質(zhì)卻介導(dǎo)了土壤微生物的趨化過程，選擇性的吸引了病原微生物在根面、根際定殖和擴(kuò)繁，營(yíng)養(yǎng)分配不均導(dǎo)致根際微生物趨化失衡，降低了原本根際微生物多樣性，導(dǎo)致有益微生物減少，惡臭假單胞菌、河生腸桿菌、多形屈撓桿菌等有害微生物大量滋生，引起了根際微生物群體從“細(xì)菌型”向“真菌型”的不利轉(zhuǎn)變。由于大量真菌病原物侵染植物根部，導(dǎo)致其碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂類和核酸等物質(zhì)代謝的改變，使根的分泌作用加強(qiáng)^[12-13]。根際化感物質(zhì)除了可以誘導(dǎo)根際微生物的群體失衡外，有研究也認(rèn)為萜類化感物質(zhì)能夠抑制細(xì)胞ATP 形成和植物生長(zhǎng)、干擾線粒體發(fā)揮正常功能、阻礙植物對(duì)礦物質(zhì)的吸收、引發(fā)膜過氧化毀壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)^[6]。由于化感物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜的具有較強(qiáng)損傷性作用，往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物不斷外泄，加速了土壤內(nèi)化感物積累，反作用于根際微生物群落加重根際災(zāi)難，造成惡性循環(huán)^[14]。由于遭受自毒化感物質(zhì)傷害作用和根際土中大量微生物病菌不斷增值的“雙重攻擊”，連作植物最終不堪重負(fù)、逐漸衰弱。

生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)控過程是相互促進(jìn)（相生）或相互抑制（相克）的協(xié)調(diào)過程。連作障礙形成及加重發(fā)生的原因不是單一或孤立的，而是“栽培植物-土壤-微生物”系統(tǒng)內(nèi)多種因素綜合作用的結(jié)果，其主要根源在自毒物質(zhì)誘導(dǎo)下的根際微生態(tài)失衡^[5]。因此，連作障礙形成涉及到復(fù)雜的多元系統(tǒng)，包含大量未知化感物質(zhì)、微生物群體和植物的復(fù)雜響應(yīng)。雖然連作障礙的研究已經(jīng)經(jīng)歷多年的歷史，但對(duì)于連作障礙的形成機(jī)制仍然缺乏統(tǒng)一的定論，其根本的原因就在于系統(tǒng)的復(fù)雜性和缺乏相應(yīng)的解讀工具。近年來，隨著宏基因組學(xué)和功能基因組學(xué)高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，高效、批量鑒定特定環(huán)境中微生物整體構(gòu)成和監(jiān)視特定生理狀態(tài)下植物基因、蛋白和代謝物的變化已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)。因此，有效的組合功能基因組學(xué)和宏組學(xué)能夠顯著彌補(bǔ)目前連作障礙研究中的不足，有效實(shí)現(xiàn)連作障礙復(fù)雜體系中多元因子的動(dòng)態(tài)解析。

2 功能基因組學(xué)和微生物宏組學(xué)

2.1 植物功能基因組學(xué) 功能基因組學(xué)是指利用基因組學(xué)提供的信息作為基礎(chǔ)，進(jìn)一步深入研究基因轉(zhuǎn)錄為信使RNA的方式、編輯并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的機(jī)制（轉(zhuǎn)錄組學(xué)，transcriptomics）、蛋白質(zhì)表達(dá)及其活動(dòng)規(guī)律（蛋白質(zhì)組學(xué)，proteomics）、DNA序列不發(fā)生改變的表觀遺傳調(diào)控（表觀組學(xué)，epigenetics）以及它們?nèi)绾斡绊懩切┛刂萍?xì)胞生物化學(xué)和代謝的化學(xué)物質(zhì)（代謝組學(xué)，metabolomics）。功能基因組學(xué)更多的應(yīng)用高通量、大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)合統(tǒng)計(jì)科學(xué)和計(jì)算機(jī)分析來探索基因、表觀修飾、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的規(guī)律，并最終闡釋基因組信息和表型性狀之間關(guān)聯(lián)性的學(xué)科^[15]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門在整體水平上研究細(xì)胞中所有基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的科學(xué)。它能提供基因組轉(zhuǎn)錄出來的全部RNA信息的總和，是研究細(xì)胞表型和功能的一個(gè)重要手段。隨著科學(xué)研究的不斷深入，多種新技術(shù)和方法已成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，比如：表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag， EST）、cDNA-AFLP（amplified fragment length polymorphism）、抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）、基因芯片（gene chip）、新一代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-sequencing，RNA-Seq）等。值得一提的是，RNA-Seq測(cè)序技術(shù)省去了傳統(tǒng)測(cè)序方法中從構(gòu)建文庫(kù)到獲取序列信息的繁瑣過程，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲取大量數(shù)據(jù)信息，其測(cè)序量達(dá)到傳統(tǒng)Sanger測(cè)序法的幾百到幾千倍，而測(cè)序的成本僅為傳統(tǒng)技術(shù)的幾十分之一。

蛋白組學(xué)則是以該細(xì)胞或組織內(nèi)全部的蛋白或肽段作為研究對(duì)象，以更接近基因表達(dá)的實(shí)際生理功能的角度去闡述多個(gè)基因的作用方式。過去對(duì)蛋白的分析基本上集中在單一蛋白研究，在蛋白組學(xué)的概念提出以后，相關(guān)技術(shù)的快速進(jìn)步使大規(guī)模、同時(shí)間分析多個(gè)肽段序列已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)，突破了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究限制，是對(duì)基因組學(xué)的廣泛延伸。目前蛋白組學(xué)中的常見鑒定和分析技術(shù)有：雙向電泳技術(shù)（two-dimensional electrophoresis，2D-PAGE）、熒光染色技術(shù)（two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis，2D-DIGE）、iTRAQ技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantitation）。iTRAQ技術(shù)與傳統(tǒng)蛋白鑒定和定量技術(shù)相比，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了批量蛋白鑒定功能，最多可同時(shí)對(duì)8組樣品的蛋白進(jìn)行標(biāo)記，并進(jìn)行絕對(duì)和相對(duì)定量分析，效率和精準(zhǔn)度都得到了空前提高。

代謝組學(xué)旨在研究生物體或組織甚至單個(gè)細(xì)胞的全部小分子代謝物成分及其動(dòng)態(tài)變化。它反映的是生物體在受到外界刺激或經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞或組織所產(chǎn)生的代謝響應(yīng)變化。最早提出的“代謝物組”（metabolome）是指某一生物或細(xì)胞所產(chǎn)生的所有代謝物，之后發(fā)展成為代謝組學(xué)。代謝組的分離和鑒定技術(shù)有：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography with mass spectrometer，GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography with mass spectrometer，LC-MS）及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（capillary electrophoresis coupled mass spectrometer，CE-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、傅里葉變換-紅外光譜（fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）、飛行時(shí)間質(zhì)譜（time of flight，TOF）等。通過不同代謝組學(xué)技術(shù)之間的合理搭配和使用能夠精準(zhǔn)地對(duì)植物體或環(huán)境中的代謝物進(jìn)行分析。植物的藥用活性成分和化感自毒物質(zhì)均來自于植物的代謝物，因此代謝組學(xué)對(duì)于連作植物化感物質(zhì)的鑒定和解讀具有重要的意義。

攜帶遺傳信息的DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA，再到翻譯成有功能的蛋白，進(jìn)而決定生物的表型性狀，構(gòu)成了遺傳學(xué)“中心法則”的經(jīng)典內(nèi)容。然而在生命活動(dòng)過程中，生物的遺傳性狀并不是完全由DNA序列變化所決定。在不改變DNA序列的前提下，基因的表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，造成可遺傳的表型變化，被稱為表觀遺傳。表觀遺傳學(xué)是通過 DNA 甲基化、組蛋白共價(jià)修飾、染色體重塑和非編碼 RNA 調(diào)控等方式使特定基因的表達(dá)發(fā)生改變，而不改變其本身的遺傳信息，并且這種改變能在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中穩(wěn)定遺傳，從而調(diào)控特定的生物學(xué)過程。目前有大量的方法可用來研究植物的表觀遺傳學(xué)規(guī)律，比如DNA甲基化的研究方法有：甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）法和以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的甲基化DNA 免疫共沉淀（methylated DNA immuno precipitation，MeDIP or mDIP），而非編碼RNAs的表觀調(diào)控主要通過高通量測(cè)序和生物信息學(xué)等技術(shù)。

2.2 微生物宏功能組學(xué) 植物功能基因組學(xué)解釋的是植物某一個(gè)或一類性狀背后的遺傳決定機(jī)制，而宏基因組學(xué)則針對(duì)是一類生物，特別是環(huán)境中的微生物群落整體的功能特性。宏基因組學(xué)研究主要分成2個(gè)層面，一是對(duì)特定環(huán)境中全部微生物的總DNA進(jìn)行深度測(cè)序，分析該生境中微生物的組成與相關(guān)功能；二是根據(jù)rDNA或目標(biāo)基因上特定片段進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，通過系統(tǒng)分析獲得該環(huán)境中微生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學(xué)信息。直接對(duì)土壤宏基因組測(cè)序的報(bào)道較少，主要是由于物種序列復(fù)雜程度較高造成拼接困難，目前主要通過高通量技術(shù)測(cè)定群體微生物16S rDNA 信息來判定群體中微生物多樣性。因此，宏基因組測(cè)序主要包括宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建和宏基因組文庫(kù)進(jìn)行分析和篩選。除了高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定微生物文庫(kù)外，16S rRNA宏基因組文庫(kù)的分析還包括：變性梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis， DGGE）、限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、末端標(biāo)記限制片段多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析（single-strand conformation polymorphism，SSCP）技術(shù)等。盡管宏基因組學(xué)研究提供了很多有價(jià)值的數(shù)據(jù)，但如果不對(duì)特定條件的蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，人們就不能徹底對(duì)環(huán)境微生物生態(tài)進(jìn)行分析。因此，宏蛋白組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。根際宏組學(xué)更多是包含微生物在內(nèi)的多個(gè)物種群體在某一特定環(huán)境、特定時(shí)期全部基因組轉(zhuǎn)錄情況。因此，宏基因組學(xué)和宏蛋白組學(xué)進(jìn)一步拓展和延伸了宏基因組學(xué)的內(nèi)涵，探索了微生物群落的基因表達(dá)與調(diào)控，為揭示微生物群落功能的直接表征奠定基礎(chǔ)^[16]。

3 多組學(xué)在地黃連作障礙形成機(jī)制中的運(yùn)用

地黃Rehmannia glutinosa L.是玄參科多年生草本植物，以塊根入藥，是我國(guó)傳統(tǒng)的大宗道地藥材，現(xiàn)已廣泛栽培。然而，地黃連作障礙問題表現(xiàn)尤為突出，連作地黃生長(zhǎng)不良，塊根不能正常膨大，病蟲害加劇，產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降，甚至絕收，而且頭茬地黃收獲后須隔8～10年后方可再種。地黃連作障礙僅只傷害其自身，而對(duì)其他植物（禾本科、豆科等）卻影響不大，如地黃的茬口對(duì)下茬的作物如小麥、玉米、牛膝等。由此可見地黃連作障礙具有明顯的針對(duì)性，并不具備“普遍性”。正是由于地黃的連作障礙表現(xiàn)出嚴(yán)重性、特異性和持續(xù)性的典型特點(diǎn)，使其成為研究作物連作障礙形成機(jī)制的優(yōu)異實(shí)驗(yàn)材料。目前，地黃連作障礙形成的機(jī)理輪廓已經(jīng)基本清晰，如何讓這個(gè)輪廓更加精細(xì)，需要結(jié)合不同組學(xué)對(duì)連作障礙中的每個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行一一鑒定。在地黃連作障礙的形成機(jī)制研究中，本課題組中已經(jīng)通過各種組學(xué)技術(shù)的有效結(jié)合對(duì)連作形成關(guān)鍵的環(huán)節(jié)進(jìn)行了詳細(xì)的解讀。

3.1 地黃根際自毒化感物質(zhì)鑒定與代謝組學(xué) 目前，課題組已經(jīng)利用GC-MS，HPLC等代謝組學(xué)技術(shù)詳細(xì)探究了連作地黃土壤中化感物質(zhì)的作用部分、種類及分泌和釋放的規(guī)律。比如：李振方等用水浸提和“石油醚-氯仿-乙酸乙酯-甲醇”聯(lián)合分步、分部位提取地黃根區(qū)潛在的化感物質(zhì)，通過生物測(cè)試發(fā)現(xiàn)水、甲醇提取物有顯著的化感效應(yīng)^[17]。陳楓等以

70%甲醇提取地黃茬后根際土壤，并用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取獲取不同極性的部位，種子發(fā)芽和田間盆栽試驗(yàn)表明正丁醇和水部提取物具有明顯的化感效應(yīng)，并且正丁醇部對(duì)盆栽地黃塊根的生長(zhǎng)抑制作用顯著超過水部^[18]。為了更精確的鑒定連作地黃土壤中的化感自毒物質(zhì)種類及分布，朱廣軍等采用GC-MS 對(duì)通過吸附樹脂所獲取的地黃根區(qū)土壤浸提液進(jìn)行物質(zhì)種類鑒定，發(fā)現(xiàn)在地黃根區(qū)土壤中存在有機(jī)酸、醇、酚、醛、酚酸等有機(jī)化合物，且地黃根區(qū)土壤種類遠(yuǎn)多于對(duì)照土壤^[19]。郝群輝等采用GC-MS鑒定地黃根際土壤水提物，發(fā)現(xiàn)12種地黃根際特異化感物質(zhì)，其中，有超過一半屬于酚類物質(zhì)^[20]。李振方等用GS-MS方法從地黃的須根中鑒定得到32個(gè)代謝物，選擇9個(gè)復(fù)合物進(jìn)行化感活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)酚酸物質(zhì)有顯著化感活性^[21]。郜峰等以砂粒為基質(zhì)培養(yǎng)地黃苗，用XAD-4柱的循環(huán)收集系統(tǒng)即時(shí)吸附根系分泌物，通過GC-MS鑒定收集液成分，結(jié)果在分泌物中獲取3，5 -二叔丁基-4-羥基苯甲酸和阿魏酸2種豐度較高的化感物質(zhì)^[22]。

自毒化感物質(zhì)存在于根際土壤中，那么根際土壤中的自毒物質(zhì)輻射范圍到底有多大，如何界定等目前并沒有明確的定論。為了精確界定地黃土壤中自毒化感物質(zhì)的分布范圍，課題組通過生物測(cè)試比較了地黃不同根區(qū)土壤浸提液對(duì)自身種子生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)距離地黃塊根越近，地黃種子胚根生長(zhǎng)受抑制的作用越大，當(dāng)距離超過20 cm時(shí)地黃種子胚根的生長(zhǎng)不被抑制。同時(shí)，通過GC-MS技術(shù)對(duì)不同根區(qū)甲醇和正戊烷土壤浸提液進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)地黃種植后距離塊根20 cm范圍內(nèi)的土壤中新增了20種物質(zhì)，且這些物質(zhì)不存在于圈外及未種植過地黃的土壤中，其中，茉莉酮酸甲酯、1，2-亞甲二氧基-4，7二甲氧基-5-苯甲醛、7，10，13-十六碳三烯醛、9-十六碳烯酸和棕櫚油酸等已被報(bào)道具有較強(qiáng)的化感活性。因此，通過上述的研究可以初步的判定地黃根際化感物質(zhì)分泌范圍大約為20 cm^[24]。連作地黃根際土壤中積累了大量的化感自毒物質(zhì)會(huì)對(duì)地黃造成嚴(yán)重的傷害效應(yīng)，但這種效應(yīng)能夠維持多久，換句話說，含有一定含量自毒化感物質(zhì)的土壤，需要多長(zhǎng)時(shí)間的自然消減才能種植地黃。為確證酚酸類化感物質(zhì)在土壤中的存在和變化狀態(tài)，杜家方等采用HPLC檢測(cè)2，4，6，8年前種植過地黃的土壤中與化感現(xiàn)象密切相關(guān)的5種酚酸（阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、香豆酸和丁香酸）的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤中5種酚酸的含量依次降低，說明隨著連作土間隔年限的延長(zhǎng)，土壤中的化感物質(zhì)可以消減到一個(gè)較低的濃度^[25]。

3.2 地黃根際微生物群落鑒定與宏基因組學(xué) 目前，課題組已經(jīng)利用T-RFLP，DGGE及宏蛋白組學(xué)等方法對(duì)連作地黃根際微生態(tài)環(huán)境進(jìn)行詳細(xì)的研究。張重義等利用T-RFLP技術(shù)研究了連作地黃根際土壤中細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)連作地黃土壤中細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群的比例顯著下降，致病菌群的比例顯著上升^[26]。吳林坤等通過T-RFLP和PLFA（phospholipid-derived fatty acids）技術(shù)分析了野生地黃頭茬、連作和原茬土壤及未種植任何作物土壤根際微生物的群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)連作地黃土壤微生物總量顯著降低，細(xì)菌/真菌比例下降，大量病原菌迅速滋生^[27]。張寶等利用DGGE對(duì)地黃不同根際區(qū)間土壤的微生物群體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)地黃連作會(huì)引起土壤根際、根外土壤細(xì)菌數(shù)量減少；進(jìn)一步利用DGGE分析頭茬和連作地黃生長(zhǎng)過程中根際微生物變化，發(fā)現(xiàn)隨著地黃發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)，根區(qū)土壤細(xì)菌數(shù)量大幅降低，而木霉黃、曲霉等真菌數(shù)量顯著增加^[24]。土壤是一個(gè)極其復(fù)雜的“黑匣子”，若僅從土壤微生物、植株體自身等某一個(gè)側(cè)面進(jìn)行探討，很難真正反映連作障礙的成因，但應(yīng)用土壤蛋白質(zhì)組學(xué)研究根際生物體間的互作，則直接可以從土壤系統(tǒng)功能的水平上，揭示土壤中各生物體間以及生物體與環(huán)境間的相互作用，從分子水平揭示地黃根際微生態(tài)系統(tǒng)中根系分泌物、土壤微生物、植物間的互作關(guān)系。為此，課題組通過2-DE和MALDI TOF-TOF MS質(zhì)譜相結(jié)合的方法，在根際土壤鑒定了103個(gè)蛋白，其中33個(gè)在連作一年或兩年根際土壤出現(xiàn)顯著表達(dá)變化，這些蛋白來源植物或微生物，廣泛的參與蛋白、核酸的次級(jí)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)及根際土壤生態(tài)系統(tǒng)C，N的循環(huán)。此外，參與酚酸代謝的苯丙氨酸解氨酶在連作中上調(diào)表達(dá)，這與隨著連作年限增加土壤總酚酸含量增加的結(jié)果相一致^[28]。

通過上述分析可以發(fā)現(xiàn)連作地黃所分泌的自毒物質(zhì)顯著誘導(dǎo)了土壤微生物群體改變，打破了土壤原有微生物群落平衡，導(dǎo)致大量病原真菌迅速增殖，破壞地黃的生理代謝進(jìn)程，使植株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，甚至死亡，這也更加證實(shí)了地黃所分泌的化感自毒物質(zhì)與連作根際微生物互作關(guān)系是加重連作障礙發(fā)生的重要原因。為進(jìn)一步理解根際土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物和植物間的互作關(guān)系，本課題組基于宏蛋白質(zhì)組學(xué)、宏基因組學(xué)的分析結(jié)果，將研究重點(diǎn)集中于鎖定的有益菌和病原菌，通過微生物可培養(yǎng)法與qRT-PCR技術(shù)對(duì)鎖定的特異關(guān)鍵微生物類群數(shù)量變化進(jìn)行分析，同時(shí)借助構(gòu)建的組培苗體系，通過室內(nèi)模擬連作環(huán)境來進(jìn)一步研究根系分泌物介導(dǎo)下微生物-微生物、植物-微生物之間的互作關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模擬根際土壤中各酚酸配比的混合酚酸能夠顯著促進(jìn)病原菌尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生以及DON毒素的產(chǎn)生，尤其是香草酸和阿魏酸的促進(jìn)效果最強(qiáng)，相反，該混合酚酸能夠顯著抑制有益拮抗菌假單胞菌W12的生長(zhǎng)，其中香草酸和阿魏酸的抑制效果剛好最強(qiáng)，而它們也是地黃根際土壤中含量較高的2類酚酸。可見地黃根系分泌物中的主要化感物質(zhì)對(duì)土壤微生物類群具有選擇塑造作用，能夠選擇性促進(jìn)或抑制某些特異微生物的生長(zhǎng)^[29]。

3.3 植物功能基因組學(xué)與連作地黃分子響應(yīng)機(jī)制 隨著土壤化感物質(zhì)的逐漸增多和微生物群落失衡，連作地黃所處生長(zhǎng)環(huán)境愈加惡化，面對(duì)惡化的環(huán)境，連作地黃的生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重抑制。然而，面對(duì)連作土壤惡劣的環(huán)境時(shí)，植物是如何感知、響應(yīng)進(jìn)而呈現(xiàn)出傷害癥狀的呢？為了深入解讀連作對(duì)地黃的分子傷害機(jī)制，課題組利用SSH技術(shù)構(gòu)建了頭茬與連作地黃消減cDNA文庫(kù)，鑒定了部分連作響應(yīng)的特異表達(dá)基因；利用高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了地黃轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)及頭茬與連作地黃根部、葉片差異基因表達(dá)譜，初步篩選了響應(yīng)連作地黃的差異表達(dá)基因。通過對(duì)上述不同文庫(kù)差異表達(dá)基因的分析，課題組提出連作障礙感知、響應(yīng)和發(fā)生過程中的幾個(gè)關(guān)鍵性決定事件，即：鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，乙烯產(chǎn)生和組蛋白修飾^[30-32]。目前，課題組通過不同實(shí)驗(yàn)方法已初步驗(yàn)證了鈣信號(hào)和乙烯在連作中的重要性^[33-36]。就地黃本身而言，連作傷害可能來自2個(gè)層次：一是自毒物質(zhì)的直接傷害；二是微生物失衡所致的間接傷害。因此，連作傷害發(fā)生過程中一些關(guān)鍵分子事件很可能是連作根際土壤中多元生物或非生物脅迫復(fù)合作用的結(jié)果。近年來，化感物質(zhì)對(duì)植物傷害的分子機(jī)制在不同作物中也取得了一定進(jìn)展，如Chi等通過RNA-Seq和基因芯片方法研究了自毒物質(zhì)胡桃醌和阿魏酸脅迫下水稻的響應(yīng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)2種自毒物質(zhì)均能激活水稻體內(nèi)鈣信號(hào)和乙烯信號(hào)途徑^[37-38]。此外，課題組也發(fā)現(xiàn)連作傷害進(jìn)程與異生素（xenobiotics）對(duì)植物傷害機(jī)制模式基本類似^[39]，側(cè)面表明了生物應(yīng)對(duì)不同生物脅迫或非生物脅迫可能存在著相似的響應(yīng)機(jī)制。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)相比，蛋白變化更能真實(shí)反映出植物面對(duì)脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)真實(shí)響應(yīng)狀態(tài)，為了從蛋白層面上研究地黃在面對(duì)連作脅迫時(shí)的響應(yīng)機(jī)制，課題組利用2-DE技術(shù)對(duì)頭茬和連作地黃葉片進(jìn)行差異蛋白分析鑒定到290個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白，其中，與光合作用、能量合成、細(xì)胞分裂及代謝相關(guān)的蛋白在連作地黃中顯著下調(diào)，而與抗病相關(guān)的蛋白在連作中顯著上調(diào)。表明連作地黃的光合作用受到顯著抑制，細(xì)胞分裂和細(xì)胞代謝受到顯著干擾，抗病性顯著減弱^[8]。同時(shí)，課題組進(jìn)一步利用2-DE技術(shù)分析頭、重茬地黃塊根蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與塊根重要生理代謝過程和主要成分合成相關(guān)的蛋白在連作地黃中下調(diào)；與脅迫響應(yīng)、抵御相關(guān)的蛋白在連作均上調(diào)，表明連作脅迫可導(dǎo)致地黃蛋白表達(dá)紊亂，植株生理代謝過程異常，碳水化合物和能量代謝緩慢，產(chǎn)生連作障礙效應(yīng)^[40]。

在植物面對(duì)逆境脅迫時(shí)，基因的表達(dá)與否受到組蛋白甲基化、乙?；却罅勘碛^修飾的調(diào)控。連作作為一種特殊的環(huán)境脅迫，必然會(huì)引起連作地黃體內(nèi)復(fù)雜的表觀修飾變化。Yang等利用MSAP技術(shù)分析了連作地黃根細(xì)胞基因組的胞嘧啶甲基化狀態(tài)的變化，通過比較頭茬與連作地黃中的592個(gè)DNA甲基化多態(tài)性片段，發(fā)現(xiàn)連作引起了根細(xì)胞DNA甲基化位點(diǎn)增加，其中，甲基化修飾的基因主要有MYB轉(zhuǎn)錄因子、反轉(zhuǎn)座子、植物色素B等與基因表達(dá)和植物正常生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因，這些基因被甲基化后DNA的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而無(wú)法正常轉(zhuǎn)錄，致使地黃體內(nèi)正?；虻谋磉_(dá)程序出現(xiàn)紊亂^[41]?；蚰芊褶D(zhuǎn)錄為蛋白發(fā)揮正常功能，需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后剪切、修飾等復(fù)雜調(diào)控過程，而 miRNAs在這個(gè)過程中起著重要作用。Yang等通過頭、重茬地黃sRNA差異表達(dá)譜分析獲取了大量顯著差異表達(dá)miRNAs信息，利用降解組測(cè)序?qū)Σ町恗iRNAs靶基因進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)地黃miRNAs參與了連作地黃轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、激素代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、逆境響應(yīng)等核心的生物學(xué)過程^[42-43]。從以上現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄組，蛋白組和miRNAs組等結(jié)果說明地黃在不同水平上均受到了連作脅迫的影響。其影響的最終結(jié)果造成地黃生長(zhǎng)發(fā)育的錯(cuò)亂，表現(xiàn)出連作障礙效應(yīng)。

4 展望

地黃連作障礙形成機(jī)制研究帶來了許多新的啟示，連作障礙的形成絕非某一個(gè)或某幾類因素所決定的。連作障礙的形成涉及從栽培植物—土壤微生物—再到植物復(fù)雜互作和響應(yīng)體系，而這種多元互作體系卻在土壤“暗箱”內(nèi)上演。正是由于連作障礙形成因素的復(fù)雜性和隱蔽性給研究帶來重重困難。隨著多學(xué)科的相互交叉和大量研究工作投入，目前研究組基本上把住了地黃連作障礙形成的脈絡(luò)，即自毒化感物質(zhì)及其所誘發(fā)的次生災(zāi)變機(jī)制是連作障礙形成基本原因。然而，由于化感物質(zhì)類種類繁多、根際微生態(tài)復(fù)雜性和植物響應(yīng)多邊性，很難用常規(guī)的方法去解釋連作障礙形成機(jī)制。這種系統(tǒng)的復(fù)雜程度，很難用一個(gè)或若干個(gè)因素去闡明。就如同很難用質(zhì)量性狀的遺傳分離規(guī)律去解釋數(shù)量性狀一樣，連作猶如一個(gè)遺傳復(fù)雜的數(shù)量性狀，所呈現(xiàn)出的癥狀是外界復(fù)雜的環(huán)境因子和內(nèi)部眾多的響應(yīng)基因綜合作用結(jié)果。過去用單一生理生化方法對(duì)連作現(xiàn)象的解釋很容易墜入“管中窺豹”的結(jié)果。所謂“解鈴還須系鈴人”，由于連作障礙是多系統(tǒng)之間的互作使然，應(yīng)該整合多元組學(xué)并用系統(tǒng)的思維或方式去尋找連作復(fù)雜因素背后真實(shí)規(guī)律。近年來隨著多元組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)算法的進(jìn)步，為以后從多角度、多層次、整體性的去解讀連作障礙的形成機(jī)制提供了重要的工具。相信隨著不同組學(xué)通量和鑒定精度的不斷提高，發(fā)現(xiàn)和最終確證連作障礙形成分子機(jī)制也近在咫尺。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]