娜 琴，陳阿梅，扈瑞平，武瑞兵，葉紀(jì)誠，鄧 鳳，程 飚

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

實驗證實，皮膚是應(yīng)激反應(yīng)的周圍靶器官之一，以前人們已經(jīng)注意到周圍神經(jīng)、神經(jīng)肽、神經(jīng)激素等對皮膚的影響，而應(yīng)激狀態(tài)同樣影響皮膚的功能[1]。應(yīng)激可能造成神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)穩(wěn)定性改變，引起許多皮膚疾患，包括創(chuàng)面愈合的失調(diào)節(jié)[2]。但有關(guān)創(chuàng)面愈合方面的研究極少，缺乏機(jī)制的探討和深入認(rèn)識。本研究建立小鼠應(yīng)激模型，并在其背部制作全層皮膚缺損創(chuàng)面，與未應(yīng)激小鼠創(chuàng)面愈合過程進(jìn)行對比，了解局部組織血管緊張素系統(tǒng)成分在應(yīng)激狀態(tài)下的變化特點和規(guī)律。為將來合理調(diào)控該系統(tǒng)，盡可能改善組織纖維化的愈合結(jié)局提供新思路和手段，目的是達(dá)到人類所期望的完美組織愈合。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗采用6-8周齡的C57BL/6小鼠。皮膚打孔器為自制。束縛應(yīng)激采用打孔的50 ml離心管進(jìn)行。主要試劑：ACE，AT1抗體購自美國SantaCruz公司，AT2抗體購自abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠應(yīng)激模型的建立

應(yīng)激模型制作方法參照Padgett等1998年制作的束縛應(yīng)激模型[3]，建立這一應(yīng)激模型后小鼠血清中皮質(zhì)醇水平是對照組的4倍[4]。

1.2.2 小鼠背部全層皮膚缺損模型的制作

將小鼠麻醉后，在小鼠背部脊柱兩側(cè)用特制打孔器（直徑0.8 mm，面積0.64 mm2）切割2個圓形創(chuàng)面，深至皮下。手術(shù)時間均為上午10∶00，因為這時皮質(zhì)醇分泌量最大，并且統(tǒng)一時間易于比較[5]。

1.2.3 小鼠創(chuàng)面愈合情況的觀察

分別在在制作創(chuàng)面的第0、3、5、7天，于上午10∶00將小鼠麻醉后用半透明薄膜紙描記其背部創(chuàng)面[6]。將薄膜紙上的創(chuàng)面描記圖掃描入電腦用photoshop軟件計算每個創(chuàng)面的面積和再上皮化率。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠創(chuàng)面愈合情況的觀察

創(chuàng)面描記結(jié)果見圖1左。描記后將薄膜紙掃描入電腦用photoshop軟件計算每個創(chuàng)面的面積，并計算不同創(chuàng)面每個時間點的再上皮化率，結(jié)果見圖1右。用SPSS13.0軟件對創(chuàng)后第5天和第7天創(chuàng)面再上皮化率進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的方差分析，P值為0.005，P＜0.01，未應(yīng)激組和應(yīng)激組間的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。即，在創(chuàng)后一定時期，應(yīng)激組的創(chuàng)面再上皮化率比未應(yīng)激組高。

2.2 q-PCR

由圖2右可見與正常對照相比，ACE、AT1、AT2mRNA的表達(dá)量在創(chuàng)后都升高，其中ACE和AT1的表達(dá)量在應(yīng)激組都是先下調(diào)再升高，而AT2沒有下調(diào)，在創(chuàng)后立即升高。應(yīng)激組和未應(yīng)激組三種mRNA表達(dá)的峰值在時間點上有所不同。從相對表達(dá)量上來看，在正常對照組織中，AT2的表達(dá)量比ACE和AT1都低，但在創(chuàng)傷后AT2表達(dá)量的上調(diào)值最高。

圖1 創(chuàng)面描記與再上皮化率比較

2.3 免疫熒光法檢測創(chuàng)面周圍皮膚組織中ACE、AT1、AT2和Ki67的表達(dá)

圖2左上為正常對照，由圖可見，正常對照組小鼠皮膚中，ACE在表皮基底層和真皮結(jié)締組織中稍有表達(dá)。AT2在表皮基底層和毛囊、汗腺中有表達(dá)。而AT1則沒有表達(dá)。圖2左下為創(chuàng)傷后ACE、AT1、AT2染色結(jié)果，由圖可見與正常組織相比，在創(chuàng)傷后，不管是應(yīng)激組還是未應(yīng)激組，ACE、AT1、AT2的表達(dá)都增強(qiáng)。ACE主要在真皮結(jié)締組織中表達(dá)。AT1的表達(dá)最弱，在毛囊外部表達(dá)相對較強(qiáng)。AT2在表皮基底及毛囊、汗腺都有表達(dá)。ACE和AT2的表達(dá)幾乎沒有重疊現(xiàn)象。圖3為Ki67染色結(jié)果，由圖可見，未應(yīng)激組從創(chuàng)后第3天開始在表皮基底部與毛囊表達(dá)Ki67，直到創(chuàng)后第14天都有表達(dá)。而應(yīng)激組從創(chuàng)后第一天開始即表達(dá)Ki67，直到創(chuàng)后第14天。應(yīng)激組的Ki67表達(dá)似乎比未應(yīng)激組強(qiáng)。

圖2 對照組與應(yīng)激組ACE、AT1、AT2的表達(dá)

圖3 兩組小鼠創(chuàng)傷后14天內(nèi)，創(chuàng)周皮膚組織的Ki67表達(dá)情況

3 討 論

RAS包括腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）、Ang I、Ⅱ、Ⅲ。AngⅡ通過靶器官的相應(yīng)受體而發(fā)揮生理效應(yīng)。AngⅡ的受體主要有AT1和AT2兩種亞型。在大鼠和小鼠，AT1受體有兩種亞型，分別被命名為AT1a和AT1b。目前沒有發(fā)現(xiàn)人和其他哺乳類動物的AT1受體有亞型存在。近年又發(fā)現(xiàn)有AT3、AT4受體[7]。

RAS激活過程的關(guān)鍵性限速酶之一是ACE，ACE的作用是將血管緊張素I轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素II，本實驗PCR結(jié)果中創(chuàng)后ACEmRNA的表達(dá)升高說明皮膚中有血管緊張素的轉(zhuǎn)換，即有Ang II的生成，說明在創(chuàng)面愈合的過程中血管緊張素及其受體和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等RAS系統(tǒng)成分在局部合成并起作用。從免疫熒光實驗結(jié)果可見，ACE主要表達(dá)在真皮結(jié)締組織中，說明血管緊張素的轉(zhuǎn)換是在真皮完成的，AngI在真皮中轉(zhuǎn)換成AngII后再到毛囊、汗腺和表皮基底層的細(xì)胞表面作用于AT1和AT2受體。Sun等研究發(fā)現(xiàn)ACE可能通過調(diào)節(jié)與創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)物質(zhì)的濃度來影響皮膚的損傷修復(fù)與再生[9]。而這里所說的與創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)的物質(zhì)應(yīng)主要為AngII。ACE主要表達(dá)在真皮結(jié)締組織中的實驗結(jié)果，與Morihara K等的研究結(jié)果有出入。他們的研究結(jié)果提示，合成Ang II的關(guān)鍵酶ACE存在于表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞的胞膜，可調(diào)控皮膚細(xì)胞的存活、創(chuàng)傷愈合和組織再生[8，9]。

實驗中隨著創(chuàng)后時間的延長，ACE、AT1、AT2mRNA的表達(dá)量都增加，提示他們在創(chuàng)面愈合過程中都是必須的。而且，AT2mRNA的表達(dá)量比AT1mRNA高很多。創(chuàng)后21天內(nèi)應(yīng)激組AT1mRNA的表達(dá)量峰值大約為正常組織AT1mRNA表達(dá)量的18倍，未應(yīng)激組AT1mRNA的表達(dá)量峰值大約為正常組織AT1mRNA表達(dá)量的6倍，這說明應(yīng)激狀態(tài)影響AT1受體的活性。而在創(chuàng)后21天內(nèi)不論是未應(yīng)激組還是應(yīng)激組，AT2mRNA的表達(dá)量峰值都達(dá)到正常組織AT2mRNA表達(dá)量的25倍左右。免疫熒光實驗結(jié)果也顯示AT2受體的表達(dá)更強(qiáng)，說明AT2受體在創(chuàng)面愈合中扮演非常重要的角色，血管緊張素主要是通過作用于AT2受體來發(fā)揮促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。這與Viswanathan等的實驗結(jié)果很相符，Viswanathan等在2周齡的大鼠實驗性皮膚創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)AT1和AT2受體在皮膚組織都有表達(dá)，傷后第3天在創(chuàng)傷區(qū)周圍的真皮組織其表達(dá)明顯增加，主要的受體亞型是AT2受體[10]。De Gasparo M等的研究結(jié)果顯示，盡管成年后AT2受體似乎被抑制，但在病理情況下，如皮膚損傷、血管損害、心肌損害、神經(jīng)系統(tǒng)損傷如腦缺血、坐骨神經(jīng)和視神經(jīng)橫斷等，它的表達(dá)將明顯增加[11]。本實驗中AT2受體在創(chuàng)后表達(dá)量很高，與上述結(jié)果一致。但應(yīng)激和未應(yīng)激兩組間的AT2mRNA表達(dá)量的差別不明顯。

創(chuàng)面再上皮化率的實驗結(jié)果顯示，在創(chuàng)后第5至第14天，應(yīng)激組小鼠的創(chuàng)面再上皮化率比未應(yīng)激組高（64.4% v.s46.8%，74.2% v.s56.3%，94.6%v.s88.8%）。創(chuàng)周皮膚Ki67表達(dá)情況的免疫熒光實驗結(jié)果顯示，應(yīng)激組從創(chuàng)后第一天即有Ki67的表達(dá)，即有增值的細(xì)胞，而未應(yīng)激組在創(chuàng)后第3天開始表達(dá)Ki67，比應(yīng)激組晚，且表達(dá)量也沒有應(yīng)激組多。說明應(yīng)激組創(chuàng)傷愈合過程比未應(yīng)激組發(fā)生的早，而且增值的細(xì)胞更多，愈合的更好。隨著人類對應(yīng)激的研究的深入，目前學(xué)者們普遍認(rèn)為適當(dāng)應(yīng)激能增強(qiáng)動物對外界有害因素的免疫和防御能力，但應(yīng)激負(fù)荷過強(qiáng)或應(yīng)激時間過長，將導(dǎo)致機(jī)體生理功能紊亂或疾病的發(fā)生。

總之，局部組織RAS系統(tǒng)成分在創(chuàng)面愈合中扮演重要的角色。在應(yīng)激狀態(tài)下ACE，AT1，AT2等成分的表達(dá)在表達(dá)量和時間點上與未應(yīng)激組是有區(qū)別的，說明局部組織RAS系統(tǒng)可能是應(yīng)激反應(yīng)的通路之一。本課題小組前期關(guān)于心理應(yīng)激對整形美容外科手術(shù)前患者焦慮狀況的影響及其全身血管緊張素系統(tǒng)的作用的研究結(jié)果顯示，焦慮狀態(tài)下的患者血中AngⅠ、AngⅡ和ACE的含量均高于正常對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明，全身性血管緊張素確實在焦慮發(fā)生時產(chǎn)生變化，提示該系統(tǒng)參與機(jī)體的應(yīng)激調(diào)控[12]。綜上所述，全身性RAS系統(tǒng)和局部組織RAS系統(tǒng)可能都參與應(yīng)激的調(diào)控，應(yīng)激可能通過RAS系統(tǒng)成分調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合。

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