韓超+徐建民+黃芳芳

摘要：為了探索和優(yōu)化桉樹染色體壓片技術(shù)，獲得收縮度好、分散充分的桉樹染色體顯微鏡觀察圖，對(duì)比不同取材時(shí)間、不同預(yù)處理劑和不同解離方法處理下的染色體壓片效果，得出最優(yōu)的處理方法為：上午09：00進(jìn)行取材，以8-羥基喹啉進(jìn)行預(yù)處理4 h，用卡諾氏固定液于4 ℃固定24 h，酶解35 min，卡寶品紅染色10 min，最后在顯微鏡下觀察，可以得到清晰、可計(jì)數(shù)的染色體。該技術(shù)可用于桉樹染色體核型分析和倍性鑒定等細(xì)胞生物學(xué)層面的研究。

關(guān)鍵詞：桉樹；染色體；壓片；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： Q94-336 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0233-03

染色體的數(shù)目、形態(tài)是物種顯著的遺傳性特征，可用于鑒別或輔助性鑒別物種、物種間的親緣關(guān)系和物種的變異程度[1]。掌握染色體壓片和技術(shù)，進(jìn)行染色體的數(shù)量和形態(tài)觀察是一項(xiàng)基本的和基礎(chǔ)性的細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)和手段，這種技術(shù)在物種鑒定和鑒別、物種間親緣關(guān)系確定、物種倍性鑒定和雜交育種等研究中有廣泛的應(yīng)用。

桉樹是桃金娘科（Mytraceae）杯果木屬（Angophora）、傘房屬（Corymbia）和桉屬（Eucalyptus）樹種的統(tǒng)稱[2]。桉樹是一種外來(lái)樹種，現(xiàn)在對(duì)其研究主要集中在雜交育種、優(yōu)良無(wú)性系選育、分子育種及生態(tài)效應(yīng)等相關(guān)方面[3-6]，對(duì)其細(xì)胞層面的研究較少。國(guó)外曾有人做過(guò)不同種桉樹染色體的觀察研究[7]，但國(guó)內(nèi)只有零星的研究，從研究報(bào)道看，還是沒有掌握成熟、穩(wěn)定和高質(zhì)量的染色體壓片技術(shù)。如果能夠開發(fā)出該物種成熟、穩(wěn)定的染色體壓片技術(shù)，則可為開展桉樹種間鑒別、倍性鑒定（筆者正在從事桉樹四倍體誘導(dǎo)研究）和種間親緣關(guān)系確定提供必要的技術(shù)支持。

本研究以桉樹尾巨桉無(wú)性系DH32-29的二倍體和四倍體組培生根苗為研究對(duì)象，進(jìn)行染色體壓片技術(shù)觀察，并在預(yù)處理、染色和壓片環(huán)節(jié)進(jìn)行探索試驗(yàn)，最終建立了一套成熟穩(wěn)定的染色體壓片技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為尾巨桉（Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis）無(wú)性系DH32-29的二倍體和四倍體組培生根苗的根尖，試驗(yàn)材料于2015年在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所組培室內(nèi)經(jīng)過(guò)增殖和生根誘導(dǎo)獲得。

試驗(yàn)試劑：8-羥基喹啉、秋水仙素、對(duì)二氯苯溶液、卡諾氏固定液、鹽酸、纖維素酶、果膠酶和卡寶品紅等。

試驗(yàn)器材：培養(yǎng)皿、乙醇燈、顯微鏡（徠卡，型號(hào)DM4000）、載玻片、蓋玻片、吸水紙、香柏油、石蠟、鑷子和解剖針等。

1.2 試驗(yàn)方法

取生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)的無(wú)性系DH32-29生根小苗，不定根著生5～8 d后，將其洗凈，依次進(jìn)行取材時(shí)間、預(yù)處理、固定（卡諾氏固定液低溫固定24 h）、解離、染色和壓片處理，1 000倍顯微鏡下觀察，拍照。在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)不同處理組合。

1.2.1 取材時(shí)間

以2 h為間隔進(jìn)行取材，取材時(shí)間為 08：00、10：00、12：00、14：00、16：00、18：00。在這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的壓片效果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步細(xì)化時(shí)間間隔，設(shè)置取材時(shí)間間隔為0.5 h。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在上午08：00到10：00進(jìn)行取材效果較好，因此，細(xì)化后的取材時(shí)間分別為08：00、08：30、09：00、09：30、10：00。

1.2.2 預(yù)處理

以0.002 mol/L 8-羥基喹啉、0.1 g/L秋水仙素和飽和對(duì)二氯苯溶液為預(yù)處理劑，在4 ℃條件下浸泡材料，處理時(shí)間分別為3 、4 、5 h。

1.2.3 固定

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的材料經(jīng)蒸餾水漂洗后放到卡諾氏固定液中，于4 ℃固定24 h。

1.2.4 解離方法

從固定液中取出根尖，用蒸餾水漂洗，使用稀鹽酸解離法和混合酶液解離法進(jìn)行對(duì)比。酸解法：1 mol/L 稀鹽酸于60 ℃恒溫水浴鍋中分別解離6、8、10 min。酶解法：10 g/L 纖維素酶 和10 g/L 果膠酶混合液（體積比為1 ∶1）于37 ℃恒溫下分別解離30、35、40 min。

1.2.5 染色

根尖用蒸餾水漂洗后放到卡寶品紅中染色 10 min 左右。可以把根尖放在載玻片上，然后滴半滴卡寶品紅染液，待其半干后，蓋蓋玻片，蓋時(shí)從一邊先蓋，慢慢蓋到另一邊，蓋玻片和載玻片之間允許有氣泡。

1.2.6 壓片

夾取1個(gè)染色后的根尖置于干凈載玻片上，用刀片把根冠及延長(zhǎng)區(qū)剪去，滴少量染色液，并蓋上蓋玻片，用橡皮擦輕輕敲打蓋玻片，用吸水紙把多余的染色液吸干。

1.2.7 鏡檢

將壓片置于顯微鏡下觀察，觀察每個(gè)根尖所有的視野，以染色體的清晰程度、分散程度以及細(xì)胞有絲分裂中期分裂相（處于分裂期的細(xì)胞）的多少、染色體的聚縮程度等作為判定制備的染色體效果觀察圖的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)鏡檢結(jié)果，確定根尖染色體壓片技術(shù)的最佳試驗(yàn)方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對(duì)尾巨桉DH32-29染色體壓片制備效果的影響

對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，可阻斷紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂終止在中期階段，提高中期分裂相的出現(xiàn)頻率。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)預(yù)處理時(shí)間過(guò)短，染色體聚縮不到位，染色體相互交叉和粘連，難以進(jìn)行染色體分析（圖1-A）；處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，染色體也會(huì)發(fā)生粘連，聚縮程度嚴(yán)重，不易計(jì)數(shù)（圖1-B）。綜合染色體聚縮程度、分散程度等多項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，在3個(gè)預(yù)處理組合中，獲取尾巨桉DH32-29染色體標(biāo)本效果最好的是8-羥基喹啉處理4 h（圖1-C），染色體聚縮程度合適、分散均勻，秋水仙素效果次之，最差的是飽和對(duì)二氯苯溶液。

2.2 解離方法對(duì)尾巨桉DH32-29染色體壓片效果的影響

酸解法和酶解法都可使尾巨桉DH32-29根尖完全解離。鹽酸在低溫條件下對(duì)材料解離的時(shí)間把握難度較大，容易出現(xiàn)解離過(guò)度問(wèn)題。而混合酶液解離法在材料解離合適時(shí)，細(xì)胞分散，細(xì)胞中染色體也分散，便于計(jì)數(shù)；若酶解不足（圖2-A），染色體不易分散和上色；若解離過(guò)度（圖2-B），染色體被分解，無(wú)法觀察到成形的染色體。因此，從操作的便利度及成本考慮，以纖維素酶和果膠酶混合溶液于37 ℃恒溫解離35 min為佳（圖2-C）。

在給染色體染色過(guò)程中，細(xì)胞的邊界也變得更加清晰，且壓片過(guò)程中仍然保留了細(xì)胞邊界的清晰度和完整性，從而能夠看到細(xì)胞的大小。如圖3所示，桉樹四倍體細(xì)胞（圖3-B）比二倍體細(xì)胞（圖3-A）大，前者大小是后者的2倍左右。

如圖4所示，桉樹作為木本植物，壓片時(shí)需要用力平衡且力度足夠，否則，容易出現(xiàn)壓片時(shí)制片過(guò)厚，顯微鏡觀察時(shí)同一個(gè)焦點(diǎn)無(wú)法看清全部，不能在一個(gè)清晰的視野內(nèi)看清染色體全貌，需要多次聚焦才能觀察染色體全貌，這樣就無(wú)法一次性成圖。

2.3 取材時(shí)間對(duì)尾巨桉DH32-29染色體壓片效果的影響

設(shè)置的8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在08：00和10：00可觀察到較多的分裂中期相，而在12：00、14：00、16：00、18：00觀察到的分裂中期相較少。然后，在08：00和10：00之間，觀察時(shí)間點(diǎn)細(xì)分為每隔30 min觀測(cè)1次，發(fā)現(xiàn)一般情況下，09：00時(shí)分裂中期相較多。但最佳的取材時(shí)間并不具有較好的穩(wěn)定性，有時(shí)會(huì)發(fā)生偏移，且在最佳取材時(shí)間獲得分裂中期染色體的比例也有較大波動(dòng)，可獲得分裂中期相染色體細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比例在10%～20%之間。

利用本研究?jī)?yōu)化的壓片技術(shù)獲得了不同倍性的染色體顯微鏡觀察圖（圖5），加倍獲得的八倍體，有88條染色體，但仍然實(shí)現(xiàn)了充分的收縮和分布上的分散，能夠使用染色體核型分析軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)和核型分析，這也驗(yàn)證了本研究摸索出的方法的可靠性和成熟性。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在09：00取根尖獲得的分裂中期相的細(xì)胞數(shù)比例較高，雖然具體比例有較大波動(dòng)性，但這個(gè)時(shí)間點(diǎn)分裂中期相比例高且保持了穩(wěn)定性，說(shuō)明桉樹根尖細(xì)胞有絲分裂在24 h的循環(huán)周期下具有一定的周期性和穩(wěn)定性。因此，上午09：00是較合適的取材時(shí)間點(diǎn)。

要從桉樹這種木本植物的細(xì)胞中獲得清晰的分裂中期染色體圖像，預(yù)處理是關(guān)鍵步驟之一。預(yù)處理可抑制紡錘體的形成，以積累更多的分裂中期相，同時(shí)，可使染色體縮短，便于染色體分散和計(jì)數(shù)[8-9]。據(jù)報(bào)道，預(yù)處理以4 ℃左右低溫處理3～5 h 為宜[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)用8-羥基喹啉4 ℃預(yù)處理4 h，是制備效果較好的尾巨桉DH32-29染色體的關(guān)鍵。處理時(shí)間過(guò)短，不僅積累停留在分裂中期相的細(xì)胞數(shù)量少，而且染色體收縮程度差，染色體個(gè)體之間分辨界限不明顯，計(jì)數(shù)難度大；而處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，染色體收縮程度過(guò)大，由短棒狀變?yōu)榧~扣狀，染色體間形態(tài)差異趨于模糊甚至消失，不利于核型分析和觀測(cè)染色體形態(tài)。

酸解雖然也能夠使細(xì)胞壁軟化，但解離效果不如酶解。推測(cè)原因，可能是桉樹根尖較堅(jiān)硬，因此，解離時(shí)需要輔助酶來(lái)處理。有研究認(rèn)為，解離的時(shí)間控制非常重要[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，30、35、40 min之間，相差5 min的解離效果也有很大差異。因此，通過(guò)細(xì)分解離時(shí)間，確定適宜的解離時(shí)間，對(duì)于獲得理想的解離效果具有重要意義。

壓片效果要求的2個(gè)要點(diǎn)：（1）染色體充分收縮，呈短棒狀；（2）染色體充分分散，能較容易實(shí)現(xiàn)計(jì)數(shù)和核型分析。與其他研究[13-18]相比，桉樹是較難獲得高質(zhì)量染色體顯微鏡觀察圖的樹種。從國(guó)內(nèi)已有的研究成果看，雖然譚德冠等均進(jìn)行了桉樹染色體壓片觀察的研究[19-21]，但是，從染色體顯微鏡觀察圖來(lái)看，未能很好地達(dá)到染色壓片所要求的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)過(guò)不斷摸索和優(yōu)化試驗(yàn)條件，獲得了較高質(zhì)量的染色體顯微鏡觀察圖。

本研究獲得的染色體壓片技術(shù)優(yōu)化的經(jīng)驗(yàn)有：（1）預(yù)處理和解離時(shí)需要設(shè)定足夠多梯度，從而摸索出最優(yōu)的試驗(yàn)條件；（2）把握準(zhǔn)確的取材處理時(shí)間，至少對(duì)部分物種是有很大價(jià)值的；（3）酶解比酸解在處理難解離材料時(shí)，更具有優(yōu)勢(shì)。

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