楊偉克+唐芬芬+劉增虎

摘要：為研究1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，簡稱DNJ）對家蠶中腸BmSuc1基因表達及其酶活性的影響，以5齡第3天家蠶為試驗材料，經(jīng)口添食不同劑量的生物堿DNJ，采用實時熒光定量PCR方法檢測中腸BmSuc1的表達情況，同時測定β-呋喃果糖苷酶的活性。結果表明，添食不同劑量的DNJ均能引起B(yǎng)mSuc1基因在添食6、9 h出現(xiàn)上調表達，但相對表達量有一定差異，添食4 μg/頭的處理組在添食6、9 h基因的相對表達量分別是對照組的1.9、2.9倍，添食2 μg/頭的處理組在添食6、9 h基因的相對表達量分別僅為對照組的1.5、1.8倍。另外，添食4 μg/頭的處理組β-呋喃果糖苷酶活性在添食6、9、12 h顯著高于對照組，而添食2 μg/頭的處理組酶活性僅在添食6、9 h顯著高于對照組。由結果可知，酶活性變化與基因的轉錄表達規(guī)律基本一致。

關鍵詞：家蠶；DNJ；BmSuc1；β-呋喃果糖苷酶；實時熒光定量PCR

中圖分類號： S881.2；Q786 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0290-03

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，簡稱DNJ）屬于哌啶類多羥基生物堿，它能夠抑制α-葡萄糖苷酶，具有一定的降血糖功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物、微生物中均有DNJ及其類似物存在[2-3]，其中桑樹中生物堿DNJ的含量遠高于其他植物[4-5]。

蔗糖是包括昆蟲在內(nèi)的動物非常喜好的主要糖營養(yǎng)來源，分解蔗糖的水解酶有2種：一種是催化葡萄糖側基的α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase），另一種是催化果糖側基的β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）[6]。DNJ能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性，而對β-呋喃果糖苷酶沒有抑制作用。DNJ能夠通過抑制昆蟲腸道α-葡萄糖苷酶活性，阻止其分解和吸收蔗糖營養(yǎng)，使其不能正常生長發(fā)育，甚至死亡[7]。已有研究表明，生物堿DNJ對非食桑昆蟲卷心菜蛾、蓖麻蠶具有強烈的毒害作用[8-9]。

Daimon等率先在家蠶基因組中發(fā)現(xiàn)了β-呋喃果糖苷酶同源基因BmSuc1，其編碼的中腸蛋白酶具有蔗糖水解酶功能，且活性不受DNJ的抑制[10]。桑樹的葉片、枝條和根莖等部位富含DNJ[11]，寡食性昆蟲家蠶一生以桑葉為食物來源[12-13]，它能夠克服生物堿毒性，正常吸收桑葉中的糖營養(yǎng)，主要依賴β-呋喃果糖苷酶充分分解吸收桑葉中的蔗糖營養(yǎng)，從而成功地避開桑葉生物堿DNJ對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[10]。

本研究通過添食外源DNJ，利用實時熒光定量PCR對家蠶中腸BmSuc1基因的表達進行定量檢測和分析，同時測定β-呋喃果糖苷酶的變化規(guī)律，探討外源DNJ對BmSuc1基因表達及其酶活性的影響，為深入研究家蠶回避桑葉生物堿DNJ毒害作用的適應機制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

供試家蠶品種為菁松×皓月，來自云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所。主要試劑：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit和M-MLV反轉錄試劑盒（TOYOBO公司），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（Roche公司），生物堿DNJ（Sigma公司），蛋白定量測試盒和蔗糖水解酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 添食處理及樣品采集 選取發(fā)育良好、體質量和大小相當?shù)募倚Q5齡第3天幼蟲，采用經(jīng)口喂食的方法進行生物堿DNJ添食，其中A組喂食劑量為2 μg/頭，B組喂食劑量為4 μg/頭，以添食滅菌水的家蠶為對照，添食后在同等條件下飼喂。

取添食后3、6、9、12、24 h家蠶的中腸組織，對照組同時取材，每次取樣均分成2份，1份用于抽提RNA，另外1份用于制備酶液，每次取樣均設3次重復，每個重復取5頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取及反轉錄 按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit操作說明提取中腸組織RNA。在核酸蛋白分析儀上測定D260 nm、D280 nm、D260 nm/D280 nm值，計算RNA樣品濃度，根據(jù)M-MLV反轉錄酶使用說明書將抽提的RNA反轉錄成cDNA。另外取D260 nm/D280 nm值在1.80～2.00之間的樣品，用于實時熒光定量PCR試驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測 利用Primer Premier 5.0軟件，按照Real-Time PCR要求對選取的家蠶內(nèi)參基因Actin3及目標基因BmSuc1進行引物設計。Actin3引物序列為F：5′-CGGGAAATCGTTCGTGAT-3′，R：5′-ACGAGGGTTGGAAGAGGG-3′；BmSuc1引物序列為F：5′-AATCCAGTCCTCTCCTACGTGC-3′，R：5′-TCCGGTCTGATACGTGTTCT-TG-3′。

熒光定量PCR方法參照FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒操作說明進行。反應體系20 μL，反應參數(shù)：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。用ABI公司StepOne熒光定量PCR擴增儀記錄試驗結果，每個樣品設3次重復。根據(jù)公式2-ΔΔCT計算基因的相對表達量[14]，其中ΔΔCT=（CTBmSuc1-CTActin3）處理-（CTBmSuc1-CTActin3）對照。式中：CTBmSuc1、CTActin3分別代表靶標基因BmSuc1、內(nèi)參基因Actin3在實時熒光定量PCR反應過程中擴增的CT值。

1.2.4 β-呋喃果糖苷酶活性測定 酶液的制備：取家蠶中腸樣品，加入4 ℃預冷的1.0 mL磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L，pH值7.0），在冰上勻漿，4 ℃、8 000 r/min離心5～8 min，收集上清。

蛋白質含量測定按照蛋白定量試劑盒操作進行。測定原理是蛋白質分子具有—NH3+基團，當棕紅色的考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標準液或樣品中時，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白—NH3+結合，使溶液變?yōu)樗{色，通過測定595 nm處吸光度可計算出蛋白含量。計算公式：待測樣品蛋白濃度（g/L）=[（D595 nm試驗-D595 nm對照）/（D595 nm標準-D595 nm空白）]×標準品濃度（0.563 g/L）。每個樣品重復3次，取其平均值，下同。

酶活測定原理是β-呋喃果糖苷酶能水解相應的底物產(chǎn)生單糖，該單糖在相應氧化酶的作用下產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫同顯色劑結合產(chǎn)生紅色絡合物，用分光光度計在505 nm處測定吸光度，根據(jù)以下公式計算酶性：酶活性（U/mg）=[（D505 nm試驗-D505 nm對照）/（D505 nm標準-D505 nm空白）]×標準品濃度（5.55 mmol/L）÷反應時間（20 min）÷待測樣品蛋白濃度×1 000。具體操作參照蔗糖水解酶活性測定試劑盒說明書。酶活力定義：在37 ℃、pH值為7.0的條件下，1 mg蛋白組織1 min內(nèi)水解1 nmoL蔗糖定義為1個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 添食DNJ對家蠶中腸BmSuc1基因表達的影響

利用實時熒光定量PCR的方法，對添食不同劑量生物堿DNJ后家蠶中腸BmSuc1基因的表達進行定量檢測和分析。試驗中采取的是相對定量計算方法，將對照組BmSuc1基因的相對表達量設定為1.0，當添食組BmSuc1基因的相對表達量大于1.0時即為上調表達，若小于1.0時即為下調表達。從圖1可以看出，添食不同劑量（2、4 μg/頭）的生物堿DNJ均能引起家蠶中腸BmSuc1表達量在6、9 h出現(xiàn)明顯上調趨勢，其中處理6 h相對表達量最高，而處理3、12、24 h基因相對表達量變化不明顯，均接近對照組BmSuc1基因的相對表達量1.0。

對比A、B 2個處理組可知，添食劑量越高基因表達量上調幅度越大，其中添食量4 μg/頭的B組，BmSuc1相對表達量在6、9 h分別是對照組的1.84、2.97倍，而添食量2 μg/頭的A組，在6、9 h BmSuc1的相對表達量分別是對照組的1.58、2.19 倍（圖1）。

2.2 添食DNJ對家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶活性的影響

添食不同劑量生物堿DNJ后，由圖2可見，不同劑量生物堿DNJ處理家蠶，均能引起β-呋喃果糖苷酶活性出現(xiàn)先增強后減弱的趨勢。添食量4 μg/頭的處理組（B組），在6、9、12 h時酶活性與對照組相比，差異均達到顯著水平，其中在處理6 h時，酶活性最高。而添食量2 μg/頭的處理組（A組），在處理9 h時酶活性最高，并且僅在6、9 h時酶活性與對照組的差異達到顯著水平。

由圖2還可以看出，添食量4 μg/頭的處理組（B組），酶活性上升速度較快，而下降速度較慢，在處理6 h就達到最高值，隨后在9、12 h繼續(xù)維持一個相對較高的水平，在24 h酶活性仍高于對照組，但差異未達到顯著水平。添食量 2 μg/頭的處理組（A組）酶活性上升速度較慢，而下降速度較快，在添食9 h酶活性升至最高值，隨后急劇降低，在12 h已低于對照組，雖然在24 h的酶活性高于對照組，但差異并不顯著。

3 討論與結論

桑葉的乳液中含有大量的DNJ、1，4-二脫氧-1，4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇（簡稱D-AB1）等糖類似物生物堿[11]，其中DNJ是一種強效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，而動物體內(nèi)的蔗糖消化吸收主要依賴于α-葡萄糖苷酶的水解作用[15]。研究表明，添食DNJ能導致一些昆蟲喪失吸收和利用蔗糖的能力，從而對其產(chǎn)生一定的毒害作用[8-9]。β-呋喃果糖苷酶屬于另一類蔗糖水解酶，廣泛存在于真菌、細菌、酵母菌和植物中[6]，它也能催化蔗糖水解產(chǎn)生葡萄糖、果糖，并且其活性不受DNJ抑制[11]。家蠶BmSuc1是第1個被分子克隆和功能鑒定的動物β-呋喃果糖苷酶基因[10]。

家蠶主要依賴β-呋喃果糖苷酶充分分解吸收桑葉中的蔗糖營養(yǎng)，所以桑葉中高濃度的DNJ對家蠶沒有毒害作用，也不影響家蠶的生長發(fā)育[10]。另外家蠶自身具有一定富集DNJ的能力，其富集部位主要集中在血淋巴、消化管和體壁[16-18]。但蠶體DNJ的富集、代謝機制目前還不明確，筆者推測DNJ進入蠶體后，一部分被蠶體吸收利用，另一部分隨自身代謝產(chǎn)物排出體外。

家蠶無論是富集吸收DNJ，還是代謝利用DNJ，均需要能量。BmSuc1編碼的β-呋喃果糖苷酶主要是水解家蠶體內(nèi)的蔗糖，為機體提供糖源和能量，因此添食外源DNJ后，BmSuc1基因在一定時間范圍內(nèi)被上調表達，同時β-呋喃果糖苷酶活性顯著高于對照組。隨著時間的推移，進入蠶體的DNJ逐漸被富集及代謝利用，其含量也相應減少，機體不需要消耗過多能量去應對，BmSuc1基因表達量及β-呋喃果糖苷酶活性恢復至接近對照組水平，維持機體正常的生命活動。

本研究表明，生物堿DNJ能誘導家蠶BmSuc1基因的表達，同時增強β-呋喃果糖苷酶的活性，并且基因的表達規(guī)律與酶活性變化趨勢一致。本試驗中2種添食處理組，基因上調表達的時間點是一致的，都是在添食后6、9 h，但表達量卻有所差異，添食DNJ的劑量越大，基因表達量越高。β-呋喃果糖苷酶活性也是在添食6、9 h顯著高于對照組；另外，添食量4 μg/頭的處理組（B組），12 h的酶活性也顯著高于對照組，這表明DNJ劑量越大，對酶活性的影響時間越長。DNJ對家蠶中腸BmSuc1基因表達及其酶活性的影響是否與DNJ劑量有一定的相關性，有待進一步研究。

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