蒙 程，陸 妮，柴 琦

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

不同pH下接種AM真菌和根瘤菌對紫花苜蓿生長的影響

蒙 程，陸 妮，柴 琦

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

本研究設(shè)定4個(gè)pH梯度(4.43，5.06，6.43和7.16)，設(shè)置了接種AMF根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradices)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)、同時(shí)接種AMF和根瘤菌以及不接菌處理分析溫室不同pH處理下接種叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)和根瘤菌(rhizobia)對紫花苜蓿(Medicagosativa)生長的影響。結(jié)果表明，酸脅迫抑制了紫花苜蓿的生長，使其株高降低了1.27%～10.13%，地上生物量降低了33.33%～55.56%；AM真菌可以緩解酸脅迫，促進(jìn)紫花苜蓿的生長，與不接種AM真菌相比，株高提高了244.26%～294.17%，地上生物量提高了727.78%～1 737.50%，地下生物量提高了1 120%～2 220%，根長提高了39.85%～102.63%，根冠比提高了5.71%～90.32%；根瘤菌單獨(dú)接種未顯著影響紫花苜蓿生長(P>0.05)，但與AM真菌混合接種后，可顯著促進(jìn)紫花苜蓿生長(P<0.05)。

酸脅迫；AM真菌；根瘤菌；紫花苜蓿；生長

土壤酸化是限制作物生產(chǎn)的世界性難題[1]。我國酸性土壤面積約占全國土壤總面積的21%，主要分布在福建、廣東、廣西、四川、云南等南方地區(qū)[2]，且隨著環(huán)境的惡化酸性土壤的面積在不斷的增加。紫花苜蓿 (Medicagosativa)因其蛋白質(zhì)含量高，適口性好，抗逆性強(qiáng)而被廣泛栽培，是世界上栽培最廣的豆科飼用牧草[3]，素有“牧草之王”之稱。紫花苜蓿在畜牧業(yè)生產(chǎn)中有著重要的作用[4]。苜蓿對酸性土壤較為敏感[5]，成為苜蓿在南方地區(qū)推廣種植的限制因素。當(dāng)土壤pH低于5.7時(shí)，苜蓿產(chǎn)量會(huì)隨著pH的下降而迅速下降[4]。針對這一問題，目前的應(yīng)對方法主要有兩種：一是施用石灰來改良酸性土壤，但是施用石灰不能從根本上改良土壤，且對苜蓿自身可能造成傷害，不是最佳的選擇[6-7]；二是培育耐酸鋁苜蓿品種，但目前耐酸鋁育種工作距離應(yīng)用亦尚有距離。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)，可與植物根系形成共生體，通過提高養(yǎng)分吸收和碳循環(huán)促進(jìn)植物的生長[8-9]，提高植物抗干旱、低溫、鹽堿和酸等非生物逆性[10-12]和增加生物量[13-14]；紫花苜蓿播前接種根瘤菌是紫花苜蓿重要的栽培管理措施，已被證實(shí)可以提高其產(chǎn)量和品質(zhì)[15-18]；AM真菌和根瘤菌共同作用，可進(jìn)一步促進(jìn)豆科植物的生長和抗逆性[19]。然而，關(guān)于不同pH下接種AM真菌和根瘤菌對紫花苜蓿生長影響的研究卻鮮見報(bào)道。因此，本研究擬通過模擬南方酸性土壤，探討不同pH下接種AM真菌和根瘤菌對紫花苜蓿生長的影響，旨為推廣紫花苜蓿在南方酸性土壤的種植范圍和紫花苜蓿耐酸脅迫的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 植物材料為隴東苜蓿(Medicagosativacv. Longdong)，由甘肅省檢驗(yàn)局提供。

1.1.2 供試菌種 供試菌種為根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradices)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；供試根瘤菌為苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummedicae)，購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤菌中心。

1.1.3 供試土壤 供試土壤為沙土。草炭土于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌1 h，隔天再滅菌1 h，自然風(fēng)干；河沙過2 mm篩，200 ℃干熱滅菌6 h，然后將草炭土和河沙以重量比3∶1混勻，裝在密封袋中備用。原始供試土壤pH為6.43(水∶土=2.5∶1)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用模擬酸性土壤的方法，通過土壤中添加硫酸的方法將土壤pH調(diào)節(jié)至4.43、5.06、6.43和7.16。裝入盆口直徑×盆底直徑×高(17 cm×11 cm×15 cm)的塑料盆，每盆裝土1.9 kg，共計(jì)64盆。播種前，每個(gè)pH處理下16盆，接種AMF根內(nèi)球囊霉、接種苜蓿中華根瘤菌、同時(shí)接種AMF和根瘤菌以及不接菌，各4盆。

菌根接種劑的接種方法為層播，接種量為每盆接種20 g菌劑，接種AM真菌的處理加入含有孢子、菌絲的土壤及其寄主植物的根段混合物作為接種物，未接種的處理加入20 g滅菌的沙子作為對照。接種根瘤菌的方法為將供試菌株先接到Y(jié)MA斜面活化，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)接于YMA培養(yǎng)液(1 000 mL)的三角瓶中，震蕩(轉(zhuǎn)速為150 r·min-1，25 ℃，30 h)培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=0.816)，配制成菌懸液(菌數(shù)約109 cuf·mL-1)，間苗后采用根灌法接種，即用注射器將8 mL根瘤菌菌液注射于芽根處，不接種的對照注射8 mL無菌水。

播種前，紫花苜蓿種子用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的H2O2浸泡10 min，而后用無菌水(高壓滅菌鍋121 ℃下滅菌20 min)清洗3遍，然后將種子擺放于含有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)(直徑9 cm)，每皿擺放100粒，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，將催芽后的種子均勻播在每盆土壤中，每盆種6粒。待幼苗長7 d后間苗，每盆留4株長勢一致并且茁壯的幼苗。

1.3 試驗(yàn)管理

紫花苜蓿生長期間均隔日添加土壤重量10%的Long Ashton溶液，保證紫花苜蓿生長所需的養(yǎng)分。Long Ashton營養(yǎng)液組成及含量為：2 mmol·L-1K2SO4,1.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O, 3 mmol·L-1CaCl2·2H2O,0.1 mmol·L-1FeEDTA,4 mmol·L-1(NH4)2SO4, 8 mmol·L-1NaNO3。

試驗(yàn)在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)智能溫室開展，試驗(yàn)期間，溫度為23～28 ℃(晝) ，20～25 ℃(夜)，光照強(qiáng)度為180～850 mmol·(m2·s)-1(生長期5月-8月)。出苗后第2周，隔天記錄紫花苜蓿生長速度；自第4周起，每周測量一次自然株高及分枝數(shù)，種植70 d收獲。

1.4 收獲及測定

收獲時(shí)，將地上部分沿土表剪下，稱鮮重，取0.5 g用于測定生理指標(biāo)，其余部分105 ℃殺青30 min后置于70 ℃烘干至恒重，稱干重，計(jì)算干鮮比，換算出地上生物量。

地下部分洗凈后用直尺測量根長，隨后分兩份，一份用來測定菌根侵染率，另一份置于70 ℃烘干至恒重，稱干重，計(jì)算干鮮比，換算出地下生物量。

根冠比以地上干重/地下干重計(jì)算得出。

菌根侵染率的測定采用根段法[20]。稱取約0.1 g的根，剪成大約1 cm的小段，放入裝有10%KOH的試管中，80 ℃水浴20 min，用1%HCl洗滌，再用蒸餾水沖洗干凈；用0.065%苯胺藍(lán)染液在80 ℃水浴中染色10 min，洗凈后用甘油保存并在解剖鏡下鏡檢[21]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；采用JMP IN 4 進(jìn)行方差分析；采用Microsoft Excel 2013作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 株高

pH對紫花苜蓿的株高無顯著影響(P>0.05)(表1)。與不接菌和單獨(dú)接種根瘤菌處理相比，AM真菌和同時(shí)接種AM真菌和根瘤菌均顯著提高了紫花苜蓿的株高(P<0.05)，同時(shí)接種AM真菌和根瘤菌共同處理的株高高于單獨(dú)接種AM真菌處理的株高，但二者差異不顯著(圖1)。表明在本研究條件下， AM真菌促進(jìn)了紫花苜蓿的生長。

表1 不同土壤pH、苜蓿中華根瘤菌根瘤菌(S)、AM真菌(AM)及三者之間的互作效應(yīng)方差分析(P)

注：ns表示無顯著影響(P>0.05)。

Note：ns indicate no significant difference at the 0.05 level.

圖1 不同pH、AM真菌和根瘤菌處理下紫花苜蓿株高

注：不同小寫字母表示同一pH不同處理間差異顯著(P<0.05)，N代表不接種，S代表接種根瘤菌，AM代表接種叢枝菌根真菌，AMS代表同時(shí)接種根瘤菌和叢枝菌根真菌；下同。

Note: Different lower case letters for the same pH indicate singificant difference among different treatments; N, no inoculation; S, inoculated withSinorhizobiummedicae; AM, inoculated withGlomusintraradices; AMS, co-inoculated withG.intraradicesandS.medicae. The same below.

2.2 分枝數(shù)

pH對紫花苜蓿的分枝數(shù)有顯著影響(P<0.05)(表1)。與不接菌處理相比，單獨(dú)接種AM真菌和同時(shí)接種根瘤和AM真菌均顯著提高了不同pH下紫花苜蓿的分枝數(shù)(P<0.05)，提高幅度為87.50%～200.56%，但二者之間無顯著差異(P>0.05)(圖2)。單獨(dú)接種根瘤菌未顯著促進(jìn)紫花苜蓿分枝數(shù)，表明在本研究條件下，AM真菌是促進(jìn)紫花苜蓿生長的主要因素。

2.3 地上和地下生物量

pH對紫花苜蓿的地下生物量有顯著影響(P<0.05)，對地上生物量無顯著影響(P>0.05)(表1)。與不接菌處理相比，單獨(dú)接種AM真菌和同時(shí)接種AM真菌和根瘤菌的處理對紫花苜蓿地上、地下生物量的積累都具有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)(圖3、圖4),紫花苜蓿地上生物量提高了727.78%～1 737.50%，地下生物量提高了1 120%～3 000%，表明AM真菌和根瘤菌顯著提高了紫花苜蓿的生產(chǎn)力，而且接種對地下生物量的促進(jìn)大于對地上生物量的促進(jìn)。單獨(dú)接種根瘤菌的處理地上、地下生物量與對照組相比差異顯著，表明根瘤菌在一定程度上促進(jìn)了紫花苜蓿的生長。同時(shí)接種AM真菌和根瘤菌的處理地上、地下生物量都高于單獨(dú)接種AM真菌的處理，但差異不顯著，表明AM真菌和根瘤菌同時(shí)存在對植物的生長具有顯著的促進(jìn)作用，這與之前的研究結(jié)果一致[19]。

2.4 根長

pH對紫花苜蓿的根長有顯著影響(P<0.05)(表1)。與其它pH相比，pH為4.43的土壤條件下紫花苜蓿的根長反而有所提高(圖5)，這可能是紫花苜蓿通過增加根長來加強(qiáng)對養(yǎng)分的吸收進(jìn)而減輕酸脅迫的危害。與不接菌處理相比，單獨(dú)接種AM真菌和同時(shí)接種根瘤和AM真菌均顯著提高了紫花苜蓿的根長(P<0.05)。表明酸脅迫對紫花苜蓿的影響在于改變根的形態(tài)，接種AM真菌在一定程度上緩解了酸脅迫的影響，促進(jìn)了紫花苜蓿的生長。

圖2 不同pH、AM真菌和根瘤菌處理下紫花苜蓿分枝數(shù)

圖3 不同pH、AM真菌和根瘤菌處理下紫花苜蓿地上生物量

圖4 不同pH、AM真菌和根瘤菌處理下紫花苜蓿地下生物量

圖5 不同pH、AM真菌和根瘤菌處理下紫花苜蓿根長

2.5 根冠比

pH對紫花苜蓿的根冠比有顯著影響(P<0.05)(表1)。在pH為4.43和5.06的土壤條件下，紫花苜蓿的根冠比較小，表明低的土壤pH在一定程度上抑制了紫花苜蓿地上部分的生長，促進(jìn)了紫花苜蓿地下部分的生長，這與根長增加的結(jié)論是一致的。與不接菌處理相比，單獨(dú)接種AM真菌和同時(shí)接種根瘤和AM真菌均顯著提高了紫花苜蓿的根冠比，且后者的根冠比大于單獨(dú)接種真菌的處理。表明在本研究條件下，真菌在一定程度上緩解了酸脅迫對紫花苜蓿生長的影響，促進(jìn)了紫花苜蓿的生長。

2.6 菌根侵染率

未接種AM真菌的土壤中沒有檢測到叢枝菌根真菌侵染紫花苜蓿根部，而在接種AM真菌的土壤中菌根侵染率在40%～50%(圖7)。pH為4.43的處理下菌根侵染率低于其它pH處理?xiàng)l件下的菌根侵染率，表明低土壤pH抑制了真菌的侵染。試驗(yàn)中雖然沒有觀測到根瘤，但是在菌根侵染率方面，同時(shí)接種根瘤和AM真菌提高了侵染率，表明根瘤菌的存在有利于AM真菌的侵染。

3 討論與結(jié)論

3.1 酸性土壤與紫花苜蓿生長

不同土壤類型具有不同的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性[22]，使得同一植物在不同土壤上具有不同的生長特性[23-24]。pH為4.43和5.06的土壤都屬于強(qiáng)酸性土壤，6.43的土壤屬于弱酸性土壤，7.16的土壤屬于中性偏堿土壤，4種土壤酸度差異是造成紫花苜蓿生長差異的誘因。

在本研究中,分枝數(shù)、地下生物量、根長、根冠比、菌根菌侵染率在不同土壤pH處理?xiàng)l件下存在差異，說明酸對紫花苜蓿造成了脅迫，低的土壤pH不利于紫花苜蓿的生長。強(qiáng)酸性土壤條件下紫花苜蓿的根長有所提高，表明酸對紫花苜蓿的影響在于改變根的形態(tài)，根變細(xì)了，容易受微生物病害的侵染，主根吸收少，影響苗期的生長，進(jìn)而又促使苜蓿根伸長，以獲得充足的養(yǎng)分維持生長的需要。但是土壤pH為5.06時(shí)紫花苜蓿的根長最小，低于其它的處理，說明在酸處理大于5而小于7的土壤環(huán)境中，根系長度與pH水平之間可能呈顯著的正相關(guān)，土壤環(huán)境酸性較弱，植物的根系越長，這與李劍峰等[25]的研究結(jié)果一致。

圖6 不同pH、AM真菌和根瘤菌處理下紫花苜蓿根冠比

圖7 不同pH、AM真菌和根瘤菌處理下紫花苜蓿菌根菌侵染率

在本研究中根冠比隨土壤pH的降低而減小，且pH為4.43土壤處理?xiàng)l件下幼苗的根冠比低于pH為5.06土壤處理?xiàng)l件下的根冠比，這可能是由于根部對酸脅迫的敏感程度大于莖葉，所以低pH處理下根冠比的下降主要是地上部生物量雖然有一定的增加量，但地下部幾乎停止生長所致[26]。就不同pH條件下的生長速度而言，土壤pH為4.43時(shí)的生長速度是最快的，隨著土壤pH的升高，生長速度有所減緩，這可能是因?yàn)榈偷耐寥纏H值能夠促進(jìn)土壤養(yǎng)分以可利用狀態(tài)釋放出來，刺激紫花苜蓿的生長[27]。

酸脅迫并未對紫花苜蓿的生長造成顯著的影響，可能是因?yàn)楸狙芯坎捎玫氖峭ㄟ^向土壤中添加硫酸的方法調(diào)節(jié)土壤pH，而在生長過程中不斷添加營養(yǎng)液導(dǎo)致硫酸被稀釋，所以到了后期收獲的時(shí)候酸并未對紫花苜蓿的生長造成明顯的脅迫，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的主要原因可能是紫花苜蓿在弱酸土壤下面臨的主要脅迫因素是土壤中的鋁、鐵離子，酸性本身對植株的脅迫作用較微弱[28]。但在實(shí)際生長條件下，土壤中存在的較多的H+為亞鐵離子和鋁離子的活化提供了條件，放大了鐵、鋁離子對植株的傷害。而鋁毒害通常被認(rèn)為是影響酸性土壤中植物生長的重要因素。鋁能夠引起植株體內(nèi)Ca、Mg、P、K等元素的缺失，鋁濃度的增加會(huì)進(jìn)一步造成Al-P沉淀，從而導(dǎo)致植物可利用的土壤磷含量受到限制。

3.2 AM真菌、根瘤菌與紫花苜蓿生長

接種AM真菌后，紫花苜蓿的株高、分枝數(shù)、地上和地下生物量、根長、根冠比都有顯著的提高，即使在低土壤pH條件下紫花苜蓿也能生長得較好，表明接種AM真菌能夠緩解酸脅迫，促進(jìn)紫花苜蓿對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而增加生物量的積累。研究表明，接種AM真菌可以增加蠶豆(Viciafaba)對土壤中磷、氮元素的吸收[29]。因此，初步認(rèn)為，接種AM真菌降低了酸脅迫對紫花苜蓿的元素吸收的抑制，促進(jìn)了紫花苜蓿的生長和生物量的提高。接種根瘤菌后，紫花苜蓿的生長沒有顯著提高，但是在株高、地上生物量、地下生物量方面，接種根瘤菌的處理與不接種處理相比存在差異。本研究中紫花苜蓿結(jié)瘤數(shù)很少，幾乎沒有，而有研究表明，過低的土壤pH會(huì)直接影響到豆科植物根瘤菌的存活，導(dǎo)致宿主侵染被抑制，土壤中礦質(zhì)元素的作用也可能被嚴(yán)重影響，從而造成共生固氮體系間接地被抑制[30]。pH低于5.0的情況下即使接種根瘤菌，苜蓿的固氮效率也非常低[31-34]，因此，沒有結(jié)瘤可能是因?yàn)樗嵝酝寥酪种屏烁鼍纳L，本研究所用苜蓿中華根瘤菌可能不適宜在酸性土壤中生長。有研究認(rèn)為,相比接種根瘤菌的影響，土壤環(huán)境能更顯著地影響紫花苜蓿的生長，但接種根瘤菌對紫花苜蓿的生長有一定的促進(jìn)作用[35]，這與本研究得出的結(jié)論基本一致。

同時(shí)接種AM真菌和根瘤菌的處理，株高、分枝數(shù)、地上、地下生物量、根冠比、菌根菌侵染率都高于單接種AM真菌的處理，說明接種根瘤菌能夠促進(jìn)AM真菌發(fā)揮作用，同時(shí)接種同樣可以提高菌根侵染率，根瘤菌促進(jìn)AM真菌發(fā)揮作用的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 茍燕妮)

Effects of inoculation with arbuscular mycorrhizal fungi and rhizobia on growth ofMedicagosativain acidic soil

Meng Cheng, Lu Ni, Chai Qi

(College of Pastoral Agriculture Science and Techology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

Experiments were performed to test the effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and rhizobia on the growth ofMedicagosativa(alfalfa) with a variety of soil pH in a greenhouse. Plants were inoculated withGlomusintraradices(AMF), Sinorhizobium medicae (rhizobium), both, or neither, under four different soil pH treatments (4.43, 5.06, 6.43, and 7.16). Acid stress inhibited alfalfa growth, such that plant height was decreased 1.27%～10.13% and biomass decreased 33.33%～55.56%. AMF alleviated acid stress and promoted alfalfa plant height by 244.26%～294.17%, shoot biomass by 727.78%～1 737.50%, root biomass by 1 120%～2 220%, root length by 39.85%～102.63%, root: shoot ratio by 5.71%～90.32%. Inoculation with rhizobia alone did not significantly affect alfalfa growth(P>0.05), but the co-inoculation of AMF and rhizobia significantly increased alfalfa growth(P<0.05).

acid-stress; AMF; rhizobia; alfalfa; growth

Chai Qi E-mail:chaiqi@lzu.edu.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0075

2016-02-21接受日期：2016-04-05

秦惠君與李政道中國大學(xué)生見習(xí)進(jìn)修基金(JZSH20150008)

蒙程(1995-)，女，廣西荔浦人，在讀本科生，研究方向?yàn)椴輰W(xué)。E-mail:mengch13@lzu.edu.cn

柴琦(1971-)，男，甘肅寧縣人，副教授，博士，研究方向?yàn)椴萜荷鷳B(tài)學(xué)、草坪工程學(xué)、草坪管理學(xué)。E-mail:chaiqi@lzu.edu.cn

S431.14;S432.4+4

A

1001-0629(2017)2-0352-09

蒙程，陸妮，柴琦.不同pH下接種AM真菌和根瘤菌對紫花苜蓿生長的影響.草業(yè)科學(xué),2017,34(2)：352-360.

Meng C,Lu N,Chai Q.Effects of inoculation with arbuscular mycorrhizal fungi and rhizobia on growth ofMedicagosativain acidic soil.Pratacultural Science，2017,34(2)：352-360.