金宇斌 李立德 韓 瑩 苗春興 張 霞 李勝龍

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胸外科，黑龍江 牡丹江 157009)

姜黃素調(diào)控食管癌Eca-109細(xì)胞分化、增殖、凋亡的機(jī)制

金宇斌 李立德1韓 瑩 苗春興 張 霞 李勝龍

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胸外科，黑龍江 牡丹江 157009)

目的 探討姜黃素對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞的分化、增殖、凋亡及分泌信號(hào)蛋白(Wnt)信號(hào)通路的影響及機(jī)制。方法 MTT法檢測(cè)8、16、32、64 μmol/L的姜黃素作用于食管癌Eca-109細(xì)胞24、48、72 h后細(xì)胞存活情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)48 h后細(xì)胞凋亡情況，RT-PCR檢測(cè)48 h后細(xì)胞中β連環(huán)蛋白(β-catenin)、GSK-3β、c-myc的mRNA的表達(dá)情況，Western印跡檢測(cè)48 h后細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 姜黃素對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞的抑制作用隨著作用時(shí)間和作用濃度的增加而增加，姜黃素作用24 h IC50為28.1 μmol/L，48 h為23.2 μmol/L，72 h為15.6 μmol/L。TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡率隨著藥物作用濃度的增加而增加。β-catenin、c-myc的轉(zhuǎn)錄水平隨著藥物濃度的增加而減弱。GSK-3β的轉(zhuǎn)錄水平隨著藥物濃度的增加而加強(qiáng)。β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)量隨著藥物濃度的增加而減弱。GSK-3β蛋白表達(dá)水平隨著藥物濃度的增加而加強(qiáng)。結(jié)論 姜黃素可以抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。姜黃素可以上調(diào)Wnt信號(hào)通路中GSK-3β酶的表達(dá)、促進(jìn)β-catenin蛋白降解，從而抑制c-myc基因的轉(zhuǎn)錄，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。

食管癌；增殖；凋亡；信號(hào)通路

食管癌早期發(fā)病癥狀不明顯，確診后一般已經(jīng)發(fā)展到食管癌晚期〔1〕。常見(jiàn)的治療方法有手術(shù)治療、化療和放射治療。但手術(shù)治療方法有限，化療效果顯著但副作用大，長(zhǎng)期化療會(huì)引起一系列的繼發(fā)感染，損害人體其他正常細(xì)胞的正常功能。姜黃素是從姜科植物郁金塊根、姜黃根莖等提取的一種植物多酚，具有利膽、抗金黃色葡萄球菌等藥理作用〔2〕。對(duì)癌癥、老年癡呆等具有治療作用。姜黃素對(duì)胃癌、肝癌、乳腺癌、淋巴癌等具有很好的抑制作用〔3〕，目前姜黃素對(duì)食管癌的作用機(jī)制尚不清楚。分泌信號(hào)蛋白(Wnt)信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖過(guò)程中起決定性作用，其中β連環(huán)蛋白(β-catenin)、GSK-3β、c-myc是該信號(hào)通路中關(guān)鍵因子〔4〕。本研究擬探討姜黃素對(duì)食管癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及與Wnt信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：食管癌細(xì)胞Eca-109購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。主要儀器和設(shè)備：酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，倒置顯微鏡(日本尼康)，PCR儀(美國(guó)Beckman Coulter)，離心機(jī)(湖南恒諾醫(yī)用設(shè)備有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma)，PCR擴(kuò)增試劑盒(美國(guó)Thermo)，瓊脂糖(美國(guó)Thermo)，抗體稀釋液(杭州聯(lián)科生物股份有限公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青有限公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，青鏈霉素(美國(guó)Sigma)，姜黃素粉(杭州默沙東生物制藥有限公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Sigma)，RNA提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞總蛋白提取(碧云天生物技術(shù)有限公司)，PBS(上海欣百諾生物工程有限公司)，β-actin單克隆抗體(美國(guó)Bioworld)，β-catenin單克隆抗體(美國(guó)Bioworld)，GSK-3β單克隆抗體(美國(guó)Bioworld)，c-myc單克隆抗體(美國(guó)Bioworld)，辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗(美國(guó)Bioworld)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將液氮罐中保存的食管癌細(xì)胞Eca-109取出，放置于37℃的水浴鍋中融化，觀察細(xì)胞融化后，移液槍吹打細(xì)胞混勻后，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，加入10 ml細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基)懸浮細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入3 ml細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿細(xì)胞瓶時(shí)，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞間隙變大時(shí)，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞，加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液接種于新的細(xì)胞瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 噻唑藍(lán)(MTT)法觀察細(xì)胞增殖情況 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管癌細(xì)胞Eca-109，胰蛋白酶消化后，PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入細(xì)胞生長(zhǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸浮液100 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。吸除培養(yǎng)液，加入不同濃度的姜黃素使終濃度為8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L，同時(shí)設(shè)置空白組和陰性對(duì)照組，空白組中不加細(xì)胞加入等量的姜黃素，陰性對(duì)照組中加入等量的細(xì)胞生長(zhǎng)液代替藥物。為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性，減小實(shí)驗(yàn)誤差，每組設(shè)置10個(gè)復(fù)孔。放置于37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)結(jié)束后加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，37℃孵育4 h。棄去上清，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μl，37℃孵育震蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm處的吸光度(OD值)，每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取各孔的平均值，計(jì)算細(xì)胞的IC50和細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=1-(藥物作用組-空白組)/(對(duì)照細(xì)胞組-空白組)。

1.2.3 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 終濃度為8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L的姜黃素與Eca-109細(xì)胞作用48 h后。加入4%多聚甲醛固定液放置于室溫下固定細(xì)胞30 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞3次，3 min/次，加入3%H2O2甲醇阻斷內(nèi)源性氧化物酶，孵育30 min，加入PBS洗片。加入含有0.1%TritonX-100的0.1%的枸櫞酸鈉溶液作為通透液，放置于冰盒中孵育2 min，小心吸除液體，加入轉(zhuǎn)化劑過(guò)氧化物酶(POD)50 μl，蓋上蓋玻片，37℃于濕盒中反應(yīng)30 min，洗片。加入100 μl二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色，室溫靜置15 min，用酒精脫水后，用二甲苯透明封片。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。顯微鏡下觀察細(xì)胞核為棕紅色為陽(yáng)性，計(jì)算凋亡率。凋亡率的計(jì)算方法：胞核為紅棕色的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)量的百分比。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc的表達(dá) 食管癌細(xì)胞Eca-109經(jīng)8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L的姜黃素作用48 h后，PBS洗滌細(xì)胞，加入適量的Trizol Reagent裂解食管癌細(xì)胞，用氯仿抽提，吸取水相層到新EP管中，加入異丙醇混勻，12 000 r/min離心15 min。用提前預(yù)冷的乙醇洗滌，放置于室溫下風(fēng)干，用RNAse free溶解RNA，保存于-80℃?zhèn)溆?。用紫外分光光度?jì)檢測(cè)RNA純度及濃度，OD260 nm/OD280 nm比值1.8～2.0認(rèn)為RNA純度很高。反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成β-catenin、GSK-3β、c-myc的cDNA。PCR擴(kuò)增β-catenin、GSK-3β、c-myc的cDNA。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，凝膠系統(tǒng)成像。運(yùn)用Image J分析目的基因表達(dá)率。

1.2.5 Western印跡檢測(cè)藥物作用后Eca-109細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管癌細(xì)胞Eca-109經(jīng)胰蛋白酶消化后，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞貼壁后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入姜黃素終濃度為8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L的培養(yǎng)基，37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。PBS洗滌2次，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，PBS重懸細(xì)胞。按照細(xì)胞總蛋白提取試劑盒步驟提取細(xì)胞蛋白。按照蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作步驟測(cè)定提取的蛋白濃度。在蛋白樣品中加上樣緩沖液混合后，煮沸變性5 min。每孔中加50 μl樣品，電壓80 V，marker進(jìn)入分離膠后，將電壓升高至120 V，電泳結(jié)束后將蛋白凝膠取出，濾紙、凝膠、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、濾紙依次夾好，4℃轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。取膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗4℃過(guò)夜，TBST洗膜，加入二抗室溫下孵育1.5 h。TBST洗膜后，顯影，通過(guò)Odyssey掃描系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制情況 作用時(shí)間為24、48、72 h的8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L濃度的姜黃素作用食管癌細(xì)胞Eca-109后的抑制率與對(duì)照組相比均差異顯著(P<0.05)。姜黃素對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞的抑制作用隨著作用時(shí)間和作用濃度的增加而增加。計(jì)算姜黃素作用24 h IC50為28.1 μmol/L、48 h IC50為23.2 μmol/L、72 h IC50為15.6 μmol/L。見(jiàn)表1。

表1 MTT法檢測(cè)姜黃素作用后食管癌Eca-109細(xì)胞的 抑制率

與對(duì)照組比較:1)P<0.05

2.2 TUNEL檢測(cè)姜黃素作用后的食管癌細(xì)胞凋亡情況 姜黃素濃度為8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L與細(xì)胞Eca-109作用48 h后，TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡率分別為0.325 4±0.011 5，0.451 9±0.021 4，0.681 6±0.017 8，0.853 4±0.021 7。對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為0.056 5±0.002 7。各濃度姜黃素作用后的細(xì)胞Eca-109凋亡率與對(duì)照組相比均差異顯著(P<0.05)。姜黃素可以促進(jìn)食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡。

2.3 RT-PCR檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、c-myc的mRNA的表達(dá) 8、16、32、64 μmol/L姜黃素作用后β-catenin、GSK-3β、GSK-3β、c-myc的表達(dá)率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。姜黃素可以抑制食管癌細(xì)胞Eca-109中β-catenin、c-myc的轉(zhuǎn)錄，隨著作用濃度的增加，抑制作用加強(qiáng)。姜黃素可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞Eca-109中GSK-3β的轉(zhuǎn)錄，隨著作用濃度的增加，促進(jìn)作用加強(qiáng)。見(jiàn)表2。

2.4 Western印跡檢測(cè)β-catenin、GSK-3β、c-myc的表達(dá) 各濃度姜黃素作用后的Eca-109細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)率、GSK-3β蛋白表達(dá)率、c-myc蛋白表達(dá)率與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。姜黃素可以抑制β-catenin、c-myc蛋白的表達(dá)，且隨著作用濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。姜黃素可以促進(jìn)GSK-3β蛋白的表達(dá)，且隨著作用濃度的增加促進(jìn)作用增強(qiáng)。見(jiàn)表3，圖1。

表2 RT-PCR檢測(cè)姜黃素作用后細(xì)胞中β-catenin、 GSK-3β、c-myc 表達(dá)率

與0 μmol/L比較：1)P<0.05；與0 μmol/L比較：2)P<0.01，下表同

表3 Western印跡檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞中β-catenin、 GSK-3β、c-myc蛋白表達(dá)率

圖1 Western印跡檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞中β-catenin、 GSK-3β、c-myc蛋白表達(dá)

3 討 論

姜黃素是一種用從姜科植物中提取的植物色素。姜黃素的藥用歷史悠久，具有多種藥用價(jià)值，在治療胸脅刺痛、風(fēng)濕引起的肩膀疼痛、閉經(jīng)、跌打腫痛等方面療效顯著。另外姜黃素還可以調(diào)節(jié)血脂、消炎、抗纖維化、抗動(dòng)脈硬化、預(yù)防癌癥、治療癌癥。姜黃素有多種用途，在臨床上也具有極高的應(yīng)用價(jià)值〔5〕。由于姜黃素提取至植物中，副作用小，姜黃素的抗腫瘤功效越來(lái)越成為研究熱點(diǎn)。研究表明，姜黃素具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用〔6〕。

細(xì)胞凋亡是一種正常情況下的細(xì)胞程序性死亡，受多基因調(diào)控〔7〕。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡是一種嚴(yán)格程序下細(xì)胞自我毀滅的死亡。細(xì)胞凋亡涉及一系列復(fù)雜的過(guò)程，受多種機(jī)制調(diào)控，與多種信號(hào)通路有關(guān)，受多種凋亡因子作用。正常情況下，細(xì)胞的增殖與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)〔8〕。腫瘤的發(fā)生是腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡平衡被打破造成的。研究表明，姜黃素可以通過(guò)作用于細(xì)胞線粒體，改變細(xì)胞線粒體膜通透性，細(xì)胞色素C趁機(jī)被釋放而引起細(xì)胞凋亡〔9〕。另外，姜黃素可以促進(jìn)凋亡基因Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究顯示藥物作用后的食管癌Eca-109細(xì)胞增殖作用明顯減弱，藥物濃度越大，姜黃素抑制作用越明顯，藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，姜黃素抑制作用也越明顯。TUNEL結(jié)果顯示，姜黃素可以促進(jìn)食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡。

Wnt信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖分化有密切關(guān)系。Wnt信號(hào)通路是由跨膜蛋白(Fz)、Wnt、大腸腺瘤息蛋白(APC)、β-catenin等組成，這些蛋白分子將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f至細(xì)胞內(nèi)。β-catenin的多少?zèng)Q定了Wnt信號(hào)通路開(kāi)啟還是關(guān)閉〔10〕。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平升高，Wnt信號(hào)通路開(kāi)啟，β-catenin蛋白表達(dá)水平降低，Wnt信號(hào)通路關(guān)閉。β-catenin蛋白的表達(dá)受相關(guān)因子的調(diào)控，GSK-3β、APC可以阻礙β-catenin蛋白作用，而散亂蛋白(Dishevelled)可以促進(jìn)β-catenin蛋白的作用。正常情況下，細(xì)胞漿內(nèi)的一部分β-catenin蛋白結(jié)合在細(xì)胞膜上，另一部分蛋白被GSB-3β、APC、Axin復(fù)合物降解。當(dāng)Wnt蛋白與Frzzelds、LRP-5、LRP-6形成的跨膜受體結(jié)合，降解GSB-3β、APC、Axin形成的復(fù)合物，使β-catenin蛋白降解受阻。聚集在細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin蛋白受到相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子作用進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)癌基因的惡性增殖。其中GSB-3β是細(xì)胞質(zhì)中β-catenin升高的關(guān)鍵酶，可以負(fù)調(diào)控β-catenin蛋白〔11〕。c-myc是信號(hào)通路Wnt的一個(gè)靶基因，在細(xì)胞持續(xù)增殖過(guò)程中起重要作用，屬于細(xì)胞核內(nèi)的癌基因。當(dāng)信號(hào)通路Wnt激活后，靶基因c-myc被激活，大量表達(dá)，細(xì)胞惡性增殖〔12〕。

本研究提示姜黃素可以抑制食管癌Eca-109細(xì)胞的增殖分化，通過(guò)干擾細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。姜黃素能促進(jìn)GSB-3β的表達(dá)而促進(jìn)β-catenin降解，減少細(xì)胞中β-catenin的含量從而阻礙c-myc癌基因表達(dá)，干擾癌細(xì)胞的Wnt信號(hào)通路，抑制癌細(xì)胞增殖。

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〔2016-06-21修回〕

(編輯 袁左鳴)

李立德(1981-)，男，主治醫(yī)師，主要從事食道癌研究。

金宇斌(1973-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事食道癌研究。

R735

A

1005-9202(2017)04-0806-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.010

1 牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院教研科