汪 麗 王劍雄 胥方元

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000)

miR-181a在腦缺血神經(jīng)損傷與神經(jīng)康復(fù)中的作用

汪 麗 王劍雄 胥方元

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000)

目的 探討miR-181a在腦缺血損傷與神經(jīng)康復(fù)中的作用機(jī)制。方法 構(gòu)建腦缺血大鼠模型和miR-181a過表達(dá)載體，通過尾靜脈注射促進(jìn)腦缺血大鼠腦組織中miR-181a的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)24 h后腦組織miR-181a的表達(dá)水平。Tunel檢測(cè)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況。對(duì)腦缺血大鼠模型進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。Western印跡檢測(cè)大鼠腦組織中白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6的表達(dá)水平。結(jié)果 腦缺血處理的大鼠缺血組、對(duì)照組、促進(jìn)組的miR-181a水平均明顯高于正常組，促進(jìn)組高于對(duì)照組和缺血組(P<0.01)，對(duì)照組和缺血組無顯著差異(P>0.05)。尾靜脈注射的rAAV-miR-181a載體可以有效促進(jìn)大鼠腦組織中miR-181a的表達(dá)。Tunel結(jié)果顯示，促進(jìn)組中腦組織海馬區(qū)的陽性細(xì)胞比例高于對(duì)照組。促進(jìn)腦缺血大鼠miR-181a的表達(dá)，腦組織中細(xì)胞凋亡率增高。促進(jìn)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論 miR-181a在腦缺血組織中過表達(dá)，可以促進(jìn)腦組織細(xì)胞凋亡和炎癥的發(fā)生，加重神經(jīng)損傷的嚴(yán)重程度。

miR-181a；腦缺血；神經(jīng)損傷；凋亡

腦缺血與高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等的發(fā)生有密切關(guān)系，腦缺血可發(fā)生于任何年齡階段〔1〕。小分子RNA(miRNA)在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，在胚胎系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多種組織器官中發(fā)揮重要作用〔2，3〕。有研究表明，miR-376b、miR-497、miR-210等多種miRNA參與腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔4〕，但尚未見miR-181a與腦缺血中神經(jīng)損傷的相關(guān)研究。本研究擬探究miR-181a在腦缺血神經(jīng)損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性健康大鼠40只，體重220～240 g，購于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。主要儀器及試劑：水浴鍋(長(zhǎng)沙基隆儀器儀表有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司)，PCR儀(賽飛(中國(guó))有限公司)，顯微鏡(日本尼康)，流式細(xì)胞儀(杭州聯(lián)科生物科技有限公司)，離心機(jī)(鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，紫外分光光度計(jì)(江蘇天瑞儀器股份有限公司)，PVDF膜(美國(guó)Sigma)，PBS(鼎國(guó)生物試劑有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海易利生物科技有限公司)，熒光定量PCR試劑盒(上海易利生物科技有限公司)，IL-6單克隆抗體(上海文淵閣生物科技有限公司)，IL-1β單克隆抗體(上海文淵閣生物科技有限公司)，TNF-α單克隆抗體(上海文淵閣生物科技有限公司)，β-actin單克隆抗體(上海文淵閣生物科技有限公司)，辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(上海文淵閣生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 miR-181a過表達(dá)載體構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組 準(zhǔn)備腺病毒感染的HEK293細(xì)胞，利用磷酸鈣將包裝質(zhì)粒和miR-181a cDNA載體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。反復(fù)凍融細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞裂解液在55℃孵育30 min。1 000 r/min離心10 min，棄細(xì)胞碎片。純化粗提物，測(cè)定病毒的滴度。40只健康雄性大鼠分為正常組、缺血組、對(duì)照組和促進(jìn)組，其中對(duì)照組和促進(jìn)組分別尾靜脈注射對(duì)照質(zhì)粒(rAAV-GFP)和miR-181a過表達(dá)載體(rAAV-miR-181a)。

1.2.2 腦缺血大鼠模型構(gòu)建 用濃度為10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠四肢和頭部固定。小心剪毛后，在頸部中線小心切開4 cm，將皮下組織鈍性分開后，將頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)分離并暴露后，凝閉頸動(dòng)脈的分叉處和甲狀腺上的動(dòng)脈發(fā)出的枕動(dòng)脈，凝閉用電凝器操作。根據(jù)ICA找到翼腭動(dòng)脈(PPA)后阻斷血流，阻斷血流用微動(dòng)脈夾操作。凝閉ECA的遠(yuǎn)端并用1號(hào)線打結(jié)，同時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈和ICA的血流。將ECA切斷后，拴線從ECA、ICA插入到大腦動(dòng)脈(MCA)從而阻斷血流。結(jié)扎ECA后，清理血塊，去掉動(dòng)脈夾，將傷口縫合。其中正常組分離頸總動(dòng)脈，不阻斷血流不插入拴線。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織中miR-181a水平 大鼠腦缺血損傷后24 h，麻醉后斷頭處死，取大鼠的腦組織剪碎。在研缽中加入液氮后，將剪碎的組織置于研缽中研磨，觀察研磨成粉狀后，取80 mg粉末至EP管中，在EP管中加入1 ml的Trizol裂解液，混合均勻后放置于室溫下裂解5 min。在EP管中加入氯仿200 μl，上下劇烈搖動(dòng)15 s，10 000 r/min，4℃離心5 min，吸取上層水相層至新的EP管中，用500 μl的異丙醇抽提RNA，上下溫和顛倒10次，在室溫下靜置10 min，10 000 r/min離心10 min。棄上清液，加入濃度為75%的乙醇懸浮RNA沉淀，10 000 r/min，4℃離心15 min，棄上清液。將EP管放置于超凈工作臺(tái)風(fēng)干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水懸浮，紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成miR-181a的cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-181a的水平。

1.2.4 Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡 大鼠腦缺血損傷后24 h，麻醉后斷頭處死，制作石蠟包埋的腦組織海馬區(qū)組織切片。將腦組織切片放置于二甲苯中浸泡2次，5 min/次。分別用100%、95%、90%、80%、70%的濃度梯度乙醇浸泡，每個(gè)濃度梯度浸泡3 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，4 min/次。加入Proteinase K溶液孵育30 min。用蒸餾水洗滌切片4次，3 min/次。取末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)緩沖液滴加至切片上，放置于室溫下孵育5 min。取50 μl TdT酶緩沖液，放置于濕盒中，37℃孵育1 h。其中陰性對(duì)照組中加入不含有TdT的酶反應(yīng)液。將切片放置于Tunel緩沖液中，在染色缸中加入反應(yīng)終止緩沖液和洗滌緩沖液，37℃孵育30 min，用PBS洗滌組織切片后，取過氧化物酶標(biāo)記的抗體滴加至切片上，放置于濕盒中，37℃孵育30 min。滴加PBS洗滌后，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，用蘇木素復(fù)染后，用自來水沖洗，濃度梯度酒精脫水，二甲苯透明2次，中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)的比值。

1.2.5 神經(jīng)功能評(píng)分 神經(jīng)功能評(píng)分設(shè)置為0～4分，評(píng)分越高，說明神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。大鼠可以自主活動(dòng)，無異常反應(yīng)，未表現(xiàn)出神經(jīng)功能損傷的癥狀計(jì)0分；大鼠左前爪不能完全伸展，有輕度神經(jīng)損傷的計(jì)1分；觀察大鼠在自由活動(dòng)時(shí)，身體不由自主地向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，存在中度神經(jīng)功能損傷癥狀的計(jì)2分；大鼠在自主活動(dòng)時(shí)，身體不由自主地向左側(cè)傾斜，具有重度神經(jīng)功能損傷的計(jì)3分；大鼠不具備自由活動(dòng)能力，不能行走，喪失意識(shí)，有極重度神經(jīng)功能損傷計(jì)4分。

1.2.6 Western印跡檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6的表達(dá)水平 大鼠腦缺血損傷后24 h，取大鼠腦組織，剪碎后放置于勻漿器中，在勻漿器中加入含有苯甲基磺酸氟(PMSF)儲(chǔ)備液的裂解液，放置于冰上充分研磨，轉(zhuǎn)移組織研磨液至EP管中，12 000 r/m，4℃離心10 min。吸取蛋白上清液至新EP管中，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度及純度。取蛋白樣品與loading buffer充分混合后，放置于100℃煮沸5 min。在蛋白膠上樣孔中加入50 μl的蛋白樣品，蛋白電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電壓至120 V。電泳結(jié)束后取出蛋白凝膠，按照濾紙、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、蛋白凝膠、濾紙的順序，4℃轉(zhuǎn)膜過夜，轉(zhuǎn)膜電壓為90 V。取出PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，5 min/次，分別依次與一抗和二抗孵育后，在暗室中顯影，曝光，分析蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差表示。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測(cè)大鼠腦組織中miR-181a表達(dá)結(jié)果 腦缺血處理的大鼠缺血組(1.98±0.02)、對(duì)照組(2.01±0.04)、促進(jìn)組(3.21±0.08)的miR-181a的水平均明顯高于正常組(1.02±0.01)，促進(jìn)組高于對(duì)照組和缺血組(均P<0.01)，對(duì)照組和缺血組無顯著性差異(P>0.05)。尾靜脈注射的rAAV-miR-181a載體可以有效促進(jìn)大鼠腦組織中miR-181a的表達(dá)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腦組織中miR-181a表達(dá)水平

2.2 Tunel檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡結(jié)果 促進(jìn)組中腦組織的陽性細(xì)胞比例(0.74±0.05)高于對(duì)照組(0.26±0.03)(P<0.01)。促進(jìn)腦缺血大鼠miR-181a的表達(dá)，腦組織中細(xì)胞凋亡率增高。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果 促進(jìn)組的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(3.69±0.24)明顯高于對(duì)照組(2.43±0.16)(P<0.05)。大鼠中過表達(dá)miR-181a可以促進(jìn)大鼠神經(jīng)損傷的發(fā)生。

2.4 Western印跡檢測(cè)IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)結(jié)果 促進(jìn)組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。見圖2，表1。

圖2 腦缺血大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá)水平

組別IL-1βTNF-αIL-6對(duì)照組0.09±0.010.12±0.020.15±0.04促進(jìn)組0.26±0.031)0.32±0.041)0.42±0.051)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01

3 討 論

腦缺血是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的腦血管疾病，主要是由于腦組織中血液供應(yīng)不足引起的〔5〕。腦缺血發(fā)生于多種疾病中，與糖尿病、高血壓、血小板減少密不可分。腦缺血伴隨的神經(jīng)損傷是腦缺血致病的重要因素。有研究表明，腦缺血引起的神經(jīng)損傷與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)〔6〕。

miRNA發(fā)現(xiàn)于真核生物中，由20～25個(gè)核苷酸組成，是一類非編碼的具有調(diào)控功能的RNA。miRNA沒有開放閱讀框(ORF)〔7〕。成熟的miRNA是由一系列復(fù)雜的核酸酶加工剪切而成〔8〕。將剪切后的RNA被組裝到沉默復(fù)合體中，可以通過堿基互補(bǔ)作用與靶mRNA結(jié)合。miRNA可以阻止mRNA的翻譯或者直接降解mRNA。一般情況下，miRNA與靶mRNA不能完全互補(bǔ)的時(shí)候，可以阻止相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)〔9〕。miRNA如果可以完全與靶mRNA互補(bǔ)，就可以直接降解靶mRNA。隨著人們對(duì)miRNA的不斷研究，miRNA的功能也越來越受到重視。已經(jīng)有研究證明，miRNA參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，與心臟的發(fā)育、胚胎發(fā)育、神經(jīng)元的形成、癌癥的發(fā)生等有密切關(guān)系〔10〕。miR-273調(diào)控線蟲神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，miR-196在哺乳動(dòng)物四肢的發(fā)育中具有調(diào)控功能，miR-1參與心臟的發(fā)育。miR-143在癌細(xì)胞中低表達(dá)，抑制了癌細(xì)胞的凋亡。miRNA在腦缺血疾病中發(fā)揮重要作用〔11〕。

miR-181a是一種小分子RNA，在神經(jīng)系統(tǒng)中存在表達(dá)。miR-181a是miR-181家族中的一個(gè)成員〔12〕。miR-181a由23個(gè)核苷酸組成。miR-181a可以促進(jìn)B細(xì)胞分化，與T細(xì)胞表面受體有關(guān)〔13〕。此外，miR-181a還與血管的發(fā)育、腫瘤的轉(zhuǎn)移、心律失常等有密切關(guān)系〔14〕。本研究結(jié)果顯示，miR-181a在腦缺血大鼠腦組織中過度表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證腦缺血大鼠腦組織中miR-181a在神經(jīng)損傷中的作用，構(gòu)建了過表達(dá)miR-181a的質(zhì)粒。通過尾靜脈注射，促進(jìn)缺血大鼠腦組織中miR-181a的表達(dá)。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，過表達(dá)載體可以有效促進(jìn)腦缺血大鼠腦組織中miR-181a的表達(dá)。

腦缺血發(fā)生的神經(jīng)損傷中，神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡是造成神經(jīng)損傷的重要原因。利用Tunel法檢測(cè)腦缺血大鼠中細(xì)胞凋亡結(jié)果，提示過表達(dá)miR-181a可以促使腦缺血大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)腦缺血大鼠的神經(jīng)損傷進(jìn)行評(píng)分。結(jié)果提示miR-181a可以加重大鼠腦缺血的神經(jīng)損傷。Western印跡檢測(cè)結(jié)果說明miR-181a可以促進(jìn)腦缺血大鼠腦組織中炎癥的發(fā)生。

綜上所述，miR-181a在腦缺血大鼠腦組織中過表達(dá)。miR-181a加重腦缺血神經(jīng)損傷，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。這為進(jìn)一步研究miR-181a在腦組織神經(jīng)損傷中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為治療腦缺血提供了新的思路。

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〔2016-06-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

胥方元(1970-)，男，碩士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)康復(fù)、骨科康復(fù)研究。

汪 麗(1987-)，女，醫(yī)師，在讀碩士，主要從事神經(jīng)康復(fù)、骨科康復(fù)研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)04-0831-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.020