何濤君，陸學(xué)東，龐曉莉，湯一葦

諾如病毒實(shí)驗(yàn)室診斷現(xiàn)狀與展望

何濤君，陸學(xué)東，龐曉莉，湯一葦

諾如病毒是引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病因，常常引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生與食品安全問(wèn)題。諾如病毒基因組的多樣性及其它們不斷的進(jìn)化和變異為臨床診斷及疫苗研制帶來(lái)了挑戰(zhàn)。本文就諾如病毒實(shí)驗(yàn)室診斷方法的研究進(jìn)展作一綜述，包括從傳統(tǒng)經(jīng)典的核酸檢測(cè)到應(yīng)用納米、芯片等高新技術(shù)的多重核酸定量檢測(cè)和高通量測(cè)序平臺(tái)，以及體外成功培養(yǎng)的報(bào)道等等。這些新技術(shù)的成功運(yùn)用將推動(dòng)諾如病毒實(shí)驗(yàn)室診斷的新發(fā)展，以滿足臨床診療及疫苗研制的新需求。

諾如病毒；實(shí)驗(yàn)室診斷；多重核酸定量檢測(cè)；高通量測(cè)序；病毒體外細(xì)胞培養(yǎng)

諾如病毒是一組小圓形（直徑30～38 nm）、無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒，屬杯狀病毒科諾如病毒屬。諾如病毒可分為7個(gè)基因組（GI～GVII組），40個(gè)基因型。GI、GII、GIV組主要引起人類感染，其中GI組有9個(gè)基因型，GII有22個(gè)基因型，而GIV僅有2個(gè)基因型[1-2]。在全球暴發(fā)流行的諾如病毒性胃腸炎中，85%以上是由感染不同的GII.4突變株所致，這也是造成散發(fā)性胃腸炎的最主要病因[3-7]。 2014年新發(fā)現(xiàn)的GII.17已超越GII.4成為2014—2015年中國(guó)冬季腹瀉暴發(fā)流行的主流株[8]。GII.17也相繼在非洲、亞洲、北美洲及南美洲有不同的散發(fā)性流行報(bào)道，其突變率明顯高于2012年流行的GII.4 悉尼株[9-11]。一種基因的重組型（GII.16_GII.4 Sydney）最先在2015年底出現(xiàn)，繼而在北美洲、歐洲及亞洲都有報(bào)道[12-14]。最新的一種基因重組型（GII.P16_GII.2的嵌合型）最早出現(xiàn)在2016年底，由德國(guó)人報(bào)道，并很快在北美洲及亞洲成為引起暴發(fā)性胃腸炎流行的主流株[15-17，43]。

諾如病毒感染是引起散發(fā)性和全球暴發(fā)流行性胃腸炎的最主要病因[18]。自1996年以來(lái)，諾如病毒引起了至少6個(gè)地區(qū)近50%～70%世界范圍內(nèi)胃腸炎的暴發(fā)流行[2]。隨著輪狀病毒疫苗在許多國(guó)家的預(yù)防接種，諾如病毒已迅速成為兒童及成人散發(fā)性胃腸炎的首要病因[18-20]。諾如病毒感染可導(dǎo)致易感人群患病率、住院率大大增加，甚至導(dǎo)致嬰幼兒、老人及免疫缺陷患者死亡。因此，快速準(zhǔn)確地鑒定病原對(duì)治療患者，預(yù)防和控制院內(nèi)感染及阻斷社區(qū)暴發(fā)流行至關(guān)重要。自1972年Dr. Kapikian通過(guò)免疫電子顯微鏡首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道諾如病毒后的40年里，其實(shí)驗(yàn)室診斷經(jīng)歷了顯著的變革和發(fā)展[21]。目前，PCR技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)諾如病毒的最為敏感的方法，簡(jiǎn)單快速的免疫學(xué)檢測(cè)方法由于敏感性低而應(yīng)用受限，新型納米技術(shù)為床旁檢測(cè)提供了快速可靠的方法……總之，諾如病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展將以簡(jiǎn)化方法、降低成本、提高效益、結(jié)果精準(zhǔn)為目標(biāo)。

1 諾如病毒的表型及免疫學(xué)檢測(cè)方法

電子顯微鏡下僅需少量樣本并簡(jiǎn)單處理后，就可直觀地從外形上將諾如病毒與多數(shù)病毒區(qū)分開(kāi)來(lái)。但電子顯微鏡下區(qū)分小圓病毒的敏感性差，例如諾如病毒、札幌病毒及星狀病毒的外形和大小極其相似，單純電子顯微鏡觀察尚無(wú)法區(qū)分三者。一項(xiàng)前瞻性研究對(duì)2486份糞便樣本分析發(fā)現(xiàn)，有403份諾如病毒反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）陽(yáng)性的樣本在電子顯微鏡下被漏檢[22]。電子顯微鏡因保養(yǎng)維護(hù)成本及技術(shù)要求高，而對(duì)病毒的檢出靈敏度低、特異性差，故不適用于臨床。

自2003年以來(lái)，許多針對(duì)抗原的檢測(cè)方法因其快速、低廉、操作程序簡(jiǎn)單而被廣泛應(yīng)用于諾如病毒抗原的檢測(cè)[23]。常見(jiàn)的方法包括：傳統(tǒng)的96微孔板的酶免疫測(cè)定（EIA）法、快速膜基免疫層析法以及生物素發(fā)光EIA法。目前，可應(yīng)用的諾如病毒抗原檢測(cè)方法仍然有限，其原因是缺乏可用于捕獲及檢測(cè)高變異諾如病毒的保守性抗原的特異性抗體。由于諾如病毒抗原具有高度多樣性，對(duì)該檢測(cè)方法的敏感度相對(duì)較低，但還是比電子顯微鏡的觀察更為敏感。目前，正在開(kāi)發(fā)的諾如病毒多種抗原檢測(cè)的商品化試劑盒，大多僅具有體外診斷的歐洲CE標(biāo)識(shí)，尚無(wú)法在美國(guó)使用。僅有一種出自德國(guó)拜發(fā)公司的第三代諾如病毒EIA檢測(cè)試劑盒獲得了美國(guó)FDA的初步鑒定，該方法可在病毒暴發(fā)流行期檢測(cè)多個(gè)樣本，但因其敏感度和特異性有限，目前仍然難以用于病毒胃腸炎的常規(guī)臨床診斷[24]。對(duì)檢測(cè)諾如病毒抗原的商業(yè)化EIA和免疫層析試劑盒進(jìn)行的研究評(píng)估顯示，這兩種方法的靈敏度均低于RT-PCR對(duì)諾如病毒GI和GII的檢測(cè)結(jié)果[25]。

2 以核酸為基礎(chǔ)的諾如病毒檢測(cè)

自1990年以來(lái)，以核酸為基礎(chǔ)的RT-PCR技術(shù)是諾如病毒實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[1，26]。該方法極其靈敏，能快速準(zhǔn)確的檢出臨床樣本中的病毒[22]。但是臨床上解釋諾如病毒核酸陽(yáng)性結(jié)果較為復(fù)雜，因?yàn)榇嬖跓o(wú)癥狀病毒攜帶者，特別是接受了器官或骨髓移植的患者[27-29]。因此無(wú)法評(píng)估這類患者在病毒感染傳播中的作用以及是否需要對(duì)其作為感染源危險(xiǎn)人群實(shí)施控制和監(jiān)測(cè)。以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)主要用于流行病學(xué)病因的檢測(cè)以及醫(yī)院內(nèi)感染的的鑒別和感控的隨訪。

2.1 常規(guī)RT-PCR技術(shù)（cRT-PCR） cRT-PCR是指在核酸的擴(kuò)增過(guò)程中，其擴(kuò)增產(chǎn)物可以累積，并在進(jìn)行檢測(cè)或分析前隨著熱循環(huán)的完成或終止時(shí)達(dá)到平臺(tái)。這類PCR產(chǎn)物通常采用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行長(zhǎng)度判別，從而檢測(cè)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。Jiang等[30]于1992年首次采用cRTPCR技術(shù)鑒定并報(bào)道了諾如病毒感染。cRT-PCR主要的缺陷在于步驟繁雜、勞動(dòng)強(qiáng)度大且耗時(shí)長(zhǎng)；產(chǎn)量低、變異率高；擴(kuò)增產(chǎn)物須要置于開(kāi)放體系中操作，污染風(fēng)險(xiǎn)高。由于設(shè)計(jì)了型特異性引物，使得cRT-PCR已廣泛應(yīng)用于確定諾如病毒進(jìn)化的分子流行病學(xué)調(diào)查。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序已廣泛應(yīng)用于研究諾如病毒株的基因變異，及暴發(fā)流行的調(diào)查研究。

2.2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 核酸序列依賴性擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based ampli fi cation, NASBA） 技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal ampli fi cation,LAMP）技術(shù)均屬于等溫?cái)U(kuò)增法，可用于檢測(cè)糞便樣本中的諾如病毒。該方法的優(yōu)點(diǎn)為單一溫度條件下的擴(kuò)增，無(wú)需熱循環(huán)儀，類似實(shí)時(shí)PCR，且敏感性極高。NASBA技術(shù)可用于檢測(cè)諾如病毒RNA，但其特異性還沒(méi)有達(dá)到臨床診斷的要求，由于在相對(duì)較低的溫度條件下（-40℃）擴(kuò)增病毒RNA時(shí)，其特異性會(huì)隨之降低。LAMP技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)在單管中進(jìn)行，且反應(yīng)時(shí)間少于1 h。通常溫度要求在60～65℃，無(wú)需大型設(shè)備，只需簡(jiǎn)單的加熱器或水浴即可。結(jié)果的判讀只需直觀的觀察渾濁度或采用濁度閱讀器，也可添加金屬熒光指示劑來(lái)提高濁度的可讀性。LAMP技術(shù)已應(yīng)用于檢測(cè)GI和GII型諾如病毒，可提供與實(shí)時(shí)熒光定量反 轉(zhuǎn) 錄PCR（real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR）相當(dāng)?shù)臋z測(cè)結(jié)果。近來(lái)商業(yè)化的諾如病毒GI和GII型LAMP試劑盒已被日本Eiken Chemical公司開(kāi)發(fā)，其敏感性高于實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的LAMP技術(shù)[31]。未來(lái)LAMP技術(shù)將作為可選擇性、快速準(zhǔn)確的檢出諾如病毒的方法之一。

2.3 qRT-PCR技術(shù) 該技術(shù)的原理是通過(guò)非特異性熒光染料偶聯(lián)到目標(biāo)特異性探針上，實(shí)時(shí)檢測(cè)特異性的核酸生成，且每一輪PCR循環(huán)后均可檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。諾如病毒開(kāi)放性讀碼框ORF1/2連接區(qū)是其最保守的基因區(qū)，該區(qū)域的靶向引物可用于實(shí)時(shí)檢測(cè)諾如病毒不同基因型并具有高度敏感性。針對(duì)諾如病毒個(gè)體基因組的特異性引物（GI和GII），現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出具有高敏感性且能分型諾如病毒的多重qRT-PCR技術(shù)，能廣譜地檢測(cè)許多基因型的諾如病毒，包括新近報(bào)道的GII.17型突變株[1，8，11，32]。盡管如此，基于保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物和探針不能確保對(duì)突變株檢測(cè)的均一敏感性。由于存在不可預(yù)測(cè)的單核苷酸的多態(tài)性[33]，因此，設(shè)計(jì)的引物和探針應(yīng)當(dāng)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整以滿足檢測(cè)所需。Pang等[26]設(shè)計(jì)了針對(duì)諾如病毒GI和GII的特異性引物，構(gòu)建了多重qRT-PCR技術(shù)用于區(qū)分并檢測(cè)不同基因組的諾如病毒。多重檢測(cè)技術(shù)將檢測(cè)時(shí)間縮短了至少50%，并降低了試劑成本，從而提高了檢測(cè)效率。目前已開(kāi)發(fā)的包含引物和探針的LightCyclerq RT-PCR技術(shù)檢測(cè)GIV型諾如病毒，已在全球特別是北美的臨床型和研究型實(shí)驗(yàn)室得到了廣泛應(yīng)用[29，34-36]。近來(lái)出現(xiàn)了許多諾如病毒實(shí)時(shí)定量檢測(cè)的商業(yè)化試劑盒，經(jīng)應(yīng)用證實(shí)只有少數(shù)有較為可靠和滿意的檢測(cè)結(jié)果：RIDAGENE（德國(guó)）針對(duì)諾如病毒I和II型的qRT-PCR技術(shù)能廣譜測(cè)定各型的諾如病毒感染情況，并具有很好的敏感性和特異性[25]。

在對(duì)諾如病毒的前期研究中，我們采用Pang等[22，26]構(gòu)建的qRT-PCR技術(shù)分型檢測(cè)腫瘤患者糞便中的諾如病毒感染情況，并與目前FDA認(rèn)證的Luminex多重檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了平行對(duì)比，一致率達(dá)到100%。所有標(biāo)本我們都進(jìn)行了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做了組內(nèi)及組間的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其組間的變異CV=2.42%，組內(nèi)的變異 CV=0.83%，提示了Pang等構(gòu)建的熒光定量PCR技術(shù)在組內(nèi)及組間具有非常高的精密度和準(zhǔn)確度。在對(duì)患腫瘤的免疫缺陷病人檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)諾如GII型的感染率及病毒載量明顯高于GI型。在對(duì)臨床資料的多因素分析中，我們發(fā)現(xiàn)感染GII的患者呈現(xiàn)出更為嚴(yán)重的臨床癥狀。

2.4 多重PCR檢測(cè)技術(shù) 基于固相或懸浮芯片的多重PCR檢測(cè)技術(shù)，為臨床多種病原的快速篩查帶來(lái)了便利。目前采用的寡核苷酸芯片技術(shù)以固相載體為支持的膜芯片，雖檢測(cè)信息量大，但受表面張力、空間效應(yīng)等影響重復(fù)性不好，無(wú)法定量檢測(cè)。Luminex公司開(kāi)發(fā)的多指標(biāo)同步分析功能的芯片技術(shù)也稱為液態(tài)芯片或懸浮芯片，可實(shí)現(xiàn)對(duì)一份微量樣品同時(shí)進(jìn)行多達(dá)100種不同分析指標(biāo)的檢測(cè)，具有快速、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好、高通量等優(yōu)點(diǎn)。Zhang等[36]回顧了兩個(gè)商業(yè)化的多重檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，Luminex公司（美國(guó)德克薩斯州，奧斯汀）開(kāi)發(fā)的胃腸道病菌檢測(cè)系統(tǒng)（GPP）和BioFire公司（美國(guó)猶他州，鹽湖城）開(kāi)發(fā)的薄膜陣列式胃腸檢測(cè)系統(tǒng)（GI Panel）都可以用于檢測(cè)GI和GII型諾如病毒，據(jù)報(bào)道上述兩種方法比傳統(tǒng)的多重檢測(cè)方法的靈敏度更高。這些全封閉的自動(dòng)化系統(tǒng)，在鑒別散發(fā)性或暴發(fā)流行性胃腸炎的多種復(fù)雜病原體方面展現(xiàn)了巨大的潛能：處理樣本僅需2～5 min，上機(jī)時(shí)間少于1 h[37]。這些將有助于臨床醫(yī)生作出迅速的判斷和臨床干預(yù)，已期達(dá)到有效控制感染傳播的目的。2.5 基因分析檢測(cè) 基因分型有助于更好的理解諾如病毒的基因進(jìn)化、分類和分子流行病學(xué)特征，多應(yīng)用于研究機(jī)構(gòu)和公共健康實(shí)驗(yàn)室。人類諾如病毒可分為不同的基因組、基因型及突變株。因其基因組的高度多變性，基因分型多需要結(jié)合RTPCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序鑒定。根據(jù)基因組A～E區(qū)的5個(gè)不同區(qū)域可以對(duì)諾如病毒基因分型。最新研究發(fā)現(xiàn)基于C～E區(qū)設(shè)計(jì)的外殼蛋白基因引物用于分型有獨(dú)特之處，因?yàn)椴《镜耐鈿さ鞍字苯臃从沉怂拗?受體相互作用、免疫應(yīng)答及相關(guān)的基因突變信息[3，5]。就目前的認(rèn)識(shí)而言，諾如病毒基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)是VP1外殼全基因測(cè)序。但由于臨床樣本中的病毒攜帶量較低，擴(kuò)增并測(cè)序部分病毒外殼序列進(jìn)行分型比全外殼序列更具有可操作性。Hasing等[38]報(bào)道基于開(kāi)放性讀碼框ORF1/2連接區(qū)設(shè)計(jì)的引物可以更好的鑒定發(fā)生了抗原漂移的諾如病毒。目前，與諾如病毒胃腸炎相關(guān)的至少有40種基因型，可歸為兩大基因組（GI和GII）。

2.6 高通量測(cè)序 下一代基因測(cè)序（即高通量測(cè)序）技術(shù)已從研究領(lǐng)域逐步進(jìn)入應(yīng)用和診斷領(lǐng)域。因其具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)的研究。諾如病毒的基因組全長(zhǎng)7500 bp，相對(duì)較小，采用全基因測(cè)序?qū)⑹茄芯恐Z如病毒的新方法。最新的基因測(cè)序擴(kuò)增子文庫(kù)給研究者提供了快速擴(kuò)增諾如病毒基因組不同區(qū)域的基因信息，采用此方法，成千上萬(wàn)個(gè)擴(kuò)增子可同時(shí)生成并用于檢測(cè)[39-42]。高通量測(cè)序可使研究者在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)分析感興趣的全部基因信息。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序可從臨床樣本中鑒定諾如病毒的常見(jiàn)株及突變株。并可追蹤諾如病毒的基因進(jìn)化和發(fā)現(xiàn)新突變株，潛在的預(yù)測(cè)諾如病毒胃腸炎的暴發(fā)流行。目前高通量測(cè)序多應(yīng)用于研究型實(shí)驗(yàn)室，隨著標(biāo)準(zhǔn)化試劑和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的研發(fā)，該技術(shù)將會(huì)在不久的將來(lái)被診斷型實(shí)驗(yàn)室所采用。

3 結(jié)論及展望

當(dāng)前用于檢測(cè)諾如病毒的方法都存在一些優(yōu)缺點(diǎn)，沒(méi)有一種方法堪稱為完美無(wú)缺。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)結(jié)合自身的需求和目的（診斷或研究），實(shí)驗(yàn)室背景（參考性或地方診斷性實(shí)驗(yàn)室），儀器及專業(yè)性技術(shù)的需求等來(lái)選擇合適的檢測(cè)方法。諾如病毒的免疫學(xué)方法檢測(cè)主要用于監(jiān)測(cè)可疑的諾如病毒性胃腸炎的暴發(fā)流行，由于其靈敏度低而不推薦用于常規(guī)的診斷實(shí)驗(yàn)室。qRT-PCR技術(shù)是檢測(cè)糞便、食物及環(huán)境中諾如病毒的最佳方法。盡管如此，由于諾如病毒的基因型多樣性和持續(xù)的基因進(jìn)化，當(dāng)僅采用單對(duì)特異性引物擴(kuò)增時(shí)，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。設(shè)計(jì)能靶向諾如病毒不同基因組區(qū)域的多元引物集簇的方法可以提高病毒的檢出率。此外，還可以利用已知諾如病毒家族成員序列變異的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。一些新技術(shù)如以LAMP技術(shù)，納米技術(shù)為基礎(chǔ)的多重檢測(cè)平臺(tái)和高通量測(cè)序系統(tǒng)已發(fā)展成為研究機(jī)構(gòu)檢測(cè)諾如病毒的主要方法，期待在不久的將來(lái)把這些新技術(shù)、新方法運(yùn)用到診斷實(shí)驗(yàn)室中去，以滿足服務(wù)臨床，精準(zhǔn)診療的新需求。

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Laboratory diagnosis of norovirus: present and future

HE Tao-jun*, LU Xue-dong, PANG Xiao-li, TANG Yi-wei
Laboratory Department, Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Shenzhen 518033, China

Norovirus is recognized as the primary cause of nonbacterial acute gastroenteritis and often causes serious public health and food safety concern. Fast evolution and continuous drifting of norovirus genome have posed challenges for clinical diagnosis and vaccine development. This review updates the research of laboratory diagnosis of norovirus, from classic nucleic detection to recent application of nanotechnology and chip, such as a multiplex RT-qPCR detection and high-throughput sequencing. A very recent breakthrough in cell culture of norovirus in vitro is also introduced. The latest advance of technology improves the laboratory diagnosis of norovirus, thus meeting the requirement of clinical diagnosis and vaccine development.

norovirus; laboratory diagnosis; multiplex RT-qPCR; high-throughput sequencing; in vitro cell culture

R373

A

1007-8134(2017)05-0265-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.05.005

美國(guó)NIH科研基金（P30 CA008748）

518033 深圳，中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部（何濤君、陸學(xué)東）；T6G 2J6 加拿大埃德蒙頓，阿爾博塔省立公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室（龐曉莉）；阿爾博塔大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)和病理學(xué)系（龐曉莉）；10021 紐約，美國(guó)紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心（湯一葦）

何濤君，E-mail： htjjocelyn@126.com

*Corresponding author, E-mail: htjjocelyn@126.com

（2017-09-17收稿 2017-10-09修回）

（本文編輯 趙雅琳）