朱旭 劉顏良 孟陽 左騰 付濤

水通道蛋白8對結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

朱旭 劉顏良 孟陽 左騰 付濤

目的探討水通道蛋白8（aquaporin 8，AQP8）與結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法應用免疫組組織化學鏈霉卵白素-過氧化物酶連結(jié)（SP）法檢查18例發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌、15例未發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌原發(fā)腫瘤組織中AQP8的表達水平差異；結(jié)腸癌細胞系Caco-2細胞中過表達AQP8后聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白（鈣黏蛋白和波形蛋白）；Transwell侵襲實驗檢測過表達AQP8后細胞的侵襲能力，定量分析穿膜細胞數(shù)量。結(jié)果AQP8在發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中高表達；AQP8能促進EMT的發(fā)生，細胞表型由上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化；Transwell實驗顯示，過表達AQP8后腫瘤細胞穿膜數(shù)為88.0±7.2，顯著高于對照組（51.6±4.0；P＜0.01）。結(jié)論AQP8通過促進EMT的發(fā)生，促進結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。

結(jié)腸癌；水通道蛋白8；上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

結(jié)腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)仍然是引起腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因［1］。轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸癌預后的最重要因素，腫瘤局限時，5年生存率為90.3%，一旦轉(zhuǎn)移，5年生存率下降到70.4%［2－4］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展被認為是一系列基因改變所導致，癌基因的突變和抑癌基因的失活是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）被認為與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能。

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是對水轉(zhuǎn)移的跨膜通道蛋白，在動植物及微生物中普遍存在。文獻報道在結(jié)腸癌中可能存在著水通道蛋白表達水平的變化，提示水通道蛋白在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著功能［5］。水通道蛋白8（aquaporin 8，AQP8）在結(jié)腸黏膜表達，但是對于其在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的研究并未見有類似的報道。本文針對AQP8對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移做一初步研究。

材料與方法

一、材料及試劑

研究中所用標本來自于胃腸外科手術(shù)病人，根據(jù)術(shù)后病檢分為發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（18例，平均年齡59.7歲）及未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（15例，平均年齡54.5歲），所有標本均取自術(shù)中。本次實驗均告知病人，并取得書面知情同意書。人結(jié)腸癌細胞系Caco-2購自中科院上海細胞研究所；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；Opti-MEM購自Gibco公司；Transwell-3422型小室購自美國Corning Costar公司。兔抗人AQP8抗體購自Santa Cruz公司（編號sc-28624）。

二、細胞培養(yǎng)

Caco-2細胞采用含10%的胎牛血清（杭州四季青公司）的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)（DMEM），常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%的CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

三、細胞轉(zhuǎn)染

設(shè)置陰性對照組（轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒Vector）和過表達AQP8的質(zhì)粒。取對數(shù)生長期的Caco-2細胞，消化細胞，接種至6孔板中，當細胞融合度在50%左右時，用Opti-MEM稀釋Lipofectamine2000和過表達AQP8質(zhì)粒，靜置5 min?；旌腺|(zhì)粒以及Lipofectamine2000，靜置20 min，將混合物加入6孔板內(nèi)。6 h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞提取蛋白做下游蛋白檢測，或者體外細胞實驗。

四、聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡（Western blot）法檢測EMT相關(guān)蛋白的表達

收集Caco-2細胞，細胞裂解液乙基苯基聚乙二醇（NP40）裂解細胞，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取50μg蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）分離蛋白，聚偏氟乙烯膜（PVDF）轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，洗脫液（TBS-T）漂洗3次，每次10 min。加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫90 min。洗膜，曝光。

五、Transwell侵襲實驗

按照BD公司Matrigel基質(zhì)膠說明書，將基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室中。收集之前轉(zhuǎn)染的各組細胞，調(diào)整細胞密度為2.5×105/ml，取200μl細胞懸液于小室上方，下室加入600μl完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出上室，4%多聚甲醛固定15 min，0.01%結(jié)晶紫染色，200倍光學顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)，隨機取5個視野，取其平均值。本實驗重復3次。

六、免疫組織化學

標本石蠟包埋后，脫蠟至水，H2O2孵育10 min滅活內(nèi)源性酶，抗原修復。山羊血清封閉，室溫20 min，加入AQP8一抗（濃度為1∶100），4℃過夜，二氨基聯(lián)苯氨（DAB）染色，蘇木素復染。根據(jù)染色深淺判斷陽性和陰性。

七、統(tǒng)計學處理

使用SPSS（17.0版）軟件對數(shù)據(jù)進行分析，t檢驗法進行分析，GraphPad Prism5作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、AQP8在結(jié)腸癌組織標本中表達水平

免疫組織化學結(jié)果顯示，AQP8分子主要表達于結(jié)腸的上皮組織，呈棕黃色，與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織相比，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中AQP8的表達水平明顯增加（圖1）。

二、AQP8對EMT相關(guān)蛋白表達水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，在Caco-2細胞系中，過表達AQP8能顯著增強間質(zhì)細胞表型標記波形蛋白（Vimentin）的表達，而降低上皮細胞表型標記鈣黏蛋白（E-Cadherin）的表達。提示過表達AQP8能增強細胞由上皮細胞表型向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變，利于細胞的侵襲轉(zhuǎn)移（圖2）。

圖1 AQP8在結(jié)腸癌組織中的表達水平［免疫組織化學鏈霉卵白素-過氧化物酶連結(jié)（SP）法，×200］

圖2 Caco-2細胞中AQP8對EMT相關(guān)蛋白的影響

三、過表達AQP8后對細胞運動侵襲能力的影響

進一步行Transwell侵襲實驗來證明細胞的運動侵襲能力的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達AQP8后，穿過Transwell基質(zhì)膠的腫瘤細胞數(shù)量明顯增多（88.0±7.2），顯著高于對照組（51.6±4.0），兩者之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3）。

圖3 過表達AQP8后對細胞運動侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

討 論

水通道蛋白在不同的腫瘤中呈現(xiàn)過表達狀態(tài)，且已經(jīng)證明與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成、腫瘤細胞的黏附以及腫瘤相關(guān)的水腫等相關(guān)。水通道蛋白與結(jié)直腸組織中腸黏膜吸收水和腺體分泌功能等密切相關(guān)。在結(jié)直腸中主要表達AQP1、AQP3、AQP4、AQP5及AQP8［6］。結(jié)腸癌中AQP1具有癌基因的特性，在疾病早期即呈現(xiàn)過表達狀態(tài)［7］，其過表達狀態(tài)與腫瘤的進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及淋巴血管侵犯相關(guān)［8］。AQP5與病人預后相關(guān)，并且是獨立的預后指標。有報道稱AQP5與循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)量呈現(xiàn)強陽性相關(guān)，AQP5過表達病人更易出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移［9］。結(jié)腸癌中水通道蛋白的異常激活與EGFR、MAPK、cyclinD1/CDK4等多條信號通路相關(guān)［1011］，抑制相關(guān)的通路在腫瘤的靶向治療中可能發(fā)揮作用。

本項研究顯示，AQP8在發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌原發(fā)組織中表達明顯升高，提示AQP8可能與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。不同的水通道蛋白在結(jié)腸癌組織中表達水平并不一致［12］，并不是單純與水的吸收與分泌相關(guān)，可能還參與了其他的信號通路。AQP8報道發(fā)現(xiàn)與腫瘤的血管生成相關(guān)［13］，本文針對其在轉(zhuǎn)移中的功能做進一步的研究。EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟，腫瘤細胞在經(jīng)歷EMT過程后丟失正確的靶向識別能力，以此避免細胞凋亡。上皮細胞通過重排細胞骨架形成間質(zhì)細胞的特征，并且丟失細胞間的黏附結(jié)構(gòu)和極性?；|(zhì)膠被認為類似于體內(nèi)的基底膜，發(fā)生EMT的細胞能夠在基質(zhì)膠上生長并穿透，在體內(nèi)可能是腫瘤細胞突破基底膜浸潤生長的一個重要機制。發(fā)生EMT的細胞還具有更為強烈的遷移能力，細胞劃痕實驗證明細胞能更快地遷移［14］。在EMT改變中，一個重要的標識是間質(zhì)細胞的特定標志物Vimentin蛋白上調(diào)，上皮細胞的標志物E-Cadherin蛋白表達水平下調(diào)［15］。在本實驗中，過表達AQP8能促進EMT的發(fā)生，使上皮來源的腫瘤細胞向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變，進一步的Transwell侵襲實驗證實了腫瘤的運動侵襲能力增強，這種表型為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了基礎(chǔ)，可部分解釋腫瘤轉(zhuǎn)移這樣一個復雜的生物學行為的一個方面。當然腫瘤的轉(zhuǎn)移并非僅僅EMT能單獨解釋，AQP8是否影響腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的其他生物學行為，這是我們下一步所需要研究的。

基于AQPs在腫瘤中的作用，針對水通道蛋白抑制劑的研究也已經(jīng)成為腫瘤靶向治療的一個熱點［1617］。目前針對AQPs靶向抑制劑包括半胱氨酸反應性重金屬抑制劑、小分子抑制劑（抑制AQPs表達或者AQPs所誘導的水滲透）以及AQPs特異性抗體。Baum等［18］報道在一期臨床實驗中11例接受AQP1靶向治療的頭頸部腫瘤病人，但是其治療的安全性及有效性需要進一步的研究。隨著水通道蛋白在腫瘤中作用的闡明，水通道蛋白抑制劑的研制，為腫瘤的靶向治療提供了新的選擇。

1 Vatandoust S，Price TJ，Karapetis.Colorectal cancer：Metastases to a single organ.World J Gastroenterol，2015，21：11767-11776.DOI：10.3748/wjg.v21.i41.11767.

2 Sundlisaeter E，Dicko A，Sakariassen PO，et al.Lymphangiogenesis in colorectal cancer-prognostic and therapeutic aspects.Int J Cancer，2007，121：1401-1409.DOI：10.1002/ijc.22996.

3 Wang TB，Huang YH，Lan P，et al.Correlation of lymphangiogenesis to progression of colorectal cancer.Ai Zheng，2005，24：1276-1279.

4 DeSantis CR，Lin CC，Mariotto AB，et al.Cancer treatment and survivorship statistics，2014.CA Cancer J Clin，2014，64：252-271.DOI：10.3322/caac.21235.

5 Zhu J，Li C，Ji W.Identification of genes in ulcerative colitis associated colorectal cancer based on centrality analysis of co-expression network.Neoplasma，2015，62：756-764.DOI：10.4149/neo.2015.090.

6 Wang J，F(xiàn)eng L，Zhu Z，et al.Aquaporins as diagnostic and therapeutic targets in cancer：how far we are？.J Transl Med，2015，12：96.DOI：10.1186/s12967-015-0439-7.

7 Moon C，Soria JC，Jang SJ，et al.Involvement of aquaporins in colorectal carcinogenesis.Oncogene，2003，22：6699-6703.DOI：10.1038/sj.onc.1206762.

8 Yoshida T，Hojo S，Sekine S，et al.Expression of aquaporin-1is a poor prognostic factor for stage II and III colon cancer.Mol Clin Oncol，2013，1：953-958.DOI：10.3892/mco.2013.165.

9 Shan T，Cui X，Li W，et al.AQP5：a novel biomarker that predicts poor clinical outcome in colorectal cancer.Oncol Rep，2014，32：1564-1570.DOI：10.3892/or.2014.3377.

10 Kang SK，Chae YK，Woo J，et al.Role of human aquaporin 5 in colorectal carcinogenesis.Am J Pathol，2008，173：518-525.DOI：10.2353/aipath.2008.071198.

11 Li A，Lu D，Zhang Y，et al.Critical role of aquaporin-3 in epidermal growth factor-induced migration of colorectal carcinoma cells and its clinical significance.Oncol Rep，2013，29：535-540.DOI：10.3892/or.2012.2144.

12 Wang W，Li Q，Yang T，et al.Expression of AQP5 and AQP8 in human colorectal carcinoma and their clinical significance.World J Surg Oncol，2012，10：242.DOI：10.1186/1477-7819-10-242.

13 Hung KC，Hsieh PM，Hsu CY，et al.Expression of aquaporins in rat liver regeneration.Scand J Gastroenterol，2012，47：676-685.DOI：10.3109/00365521.2012.674969.

14 Kim CW，Hwang KA，Choi KC.Anti-metastatic potential of resveratrol and its metabolites by the inhibition of epithelial-mesenchymal transition，migration，and invasion of malignant cancer cell.Phytomedicine，2016，23：1787-1796.DOI：10.1016/j.phymed.2016.10.016.

15 Wang G，Yang X，Li C，et al.PIK3R3 induces epithelial-to-mesenchymal transition and promotes metastasis in colorectal cancer.Mol Cancer Ther，2014，13：1837-1847.DOI：10.1158/1535-7163.MCT-14-0049.

16 Iqarashi H，Tsujita M，Suzuki Y，et al.Inhibition of aquaporin-4 significantly increases regional cerebral blood flow.Neuroreport，2013，24：324-328.DOI：10.1097/WNR.0b013e32835fc827.

17 Shi YH，Tuokan T，Lin C，et al.Aquaporin 8 involvement in human cervical cancer SiHa migration via the EGFR-Erk1/2 pathway.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15：6391-6395.

18 Baum BJ，Alevizos I，Zheng C，et al.Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction？.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109：19403-19407.

Effect of aquaporin 8 on invasion and metastasis of colon cancer cells

Zhu Xu，Liu Yanliang，Meng Yang，Zuo Teng，F(xiàn)u Tao.Second Department of Gastrointestinal Surgery，Renmin Hospital，Wuhan University，Wuhan 430060，China

Fu Tao，Email：futao1975@tom.com

ObjectiveTo investigate the role of aquaporin8（AQP8）in invasion and metastasis of colon cancer cells.MethodsThe expression of AQP8 was detected using immunohistochemical staining with streptavidin peroxidase in colon cancer tissues（cancer with metastasis，n＝18；cancer without metastasis，n＝15）.After overexpression of AQP8 in Caco-2 cells，epithelial mesenchymal transition（EMT）related protein（E-Cadherin and Vimentin）was detected by polyacrylamide gel electrophoresis method.The ability of cell invasion was tested using Transwell chamber invasion model，and the number of transmembrane cells was quantitatively analyzed.ResultsThe AQP8 expression was increased in colon cancer tissues.AQP8 enhanced EMT，and cell phenotype changed from epithelial to mesnchymal cells.Overexpression of AQP8 could increase the invasion ability of Caco-2 cells.Conclusions AQP8 enhances invasion and metastasis of colon cancer cells through EMT.

Colon cancer；Aquaporin 8；Epithelial mesenchymal transition

R735.3

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2017.01.017

2016-12-15）

國家自然科學基金（81472289，81000898）

430060 武漢，武漢大學人民醫(yī)院胃腸外Ⅱ科

付濤，Email：futao1975@tom.com