姚洪禮，李興江,2，鄭 志,2，宋 山，姜紹通,2，李 順，鄧永東，潘麗軍,2，吳學(xué)鳳,2,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

基于16S rDNA的醋酸菌篩選及其發(fā)酵特性

姚洪禮1，李興江1,2，鄭 志1,2，宋 山1，姜紹通1,2，李 順1，鄧永東1，潘麗軍1,2，吳學(xué)鳳1,2,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

醋酸菌是影響純種液態(tài)釀醋效率的關(guān)鍵因素。為獲得高質(zhì)量濃度醋酸生產(chǎn)菌，本研究將常規(guī)篩選方法與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行優(yōu)良醋酸菌的篩選。采用高質(zhì)量濃度酒精和醋酸培養(yǎng)基富集，挑取醋酸菌膜初步分離目的菌；借助生理生化特征與16S rDNA保守序列分析方法鑒定并獲得一株產(chǎn)酸高的巴氏醋酸桿菌JST-S（Acetobacter pasteurianus JST-S，BJST-S）；在與滬釀1.01（Acetobacter pasteurianus HN 1.01）進(jìn)行發(fā)酵特性對(duì)比研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，BJST-S在生長速率、產(chǎn)酸速率及耐醇和耐酸等方面均優(yōu)于滬釀1.01；半連續(xù)發(fā)酵3 批次BJST-S的產(chǎn)酸量維持在58.10～59.68 g/L，發(fā)酵強(qiáng)度維持在1.21～1.24 g/（L·h），說明該菌產(chǎn)酸特性穩(wěn)定。研究結(jié)果可為醋酸工業(yè)化生產(chǎn)以及優(yōu)良菌株的選育提供一定的理論參考。

巴氏醋酸桿菌；菌膜；16S rDNA；半連續(xù)發(fā)酵

醋是我國傳統(tǒng)發(fā)酵釀造的調(diào)味品之一[1]，食醋釀造大多是以醋酸菌為主的多種菌混合發(fā)酵。目前純種液態(tài)發(fā)酵釀醋已成為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的趨勢(shì)，菌種是影響釀醋品質(zhì)的重要因素之一，耐醇、耐酸醋酸菌的選育已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。由于醋醅[2]是多種菌（醋酸桿菌屬、葡萄糖醋桿菌屬、腸桿菌屬和乳酸桿菌屬）的混合體[3]，用單純的產(chǎn)酸為主的分離方法很難分離醋酸菌。此外，醋酸桿菌各種屬[4]（醋酸桿菌屬、葡萄糖醋桿菌屬、腸桿菌屬和乳酸桿菌屬）之間細(xì)胞形態(tài)和生理生化特征區(qū)別不明顯，因此采用菌體形態(tài)觀察和生理特性鑒定方法不夠準(zhǔn)確。

微生物染色體上編碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)基因組DNA上的一段基因序列稱為16S rDNA[5-7]。16S rDNA可以作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子[8]。隨著分子分類理論和方法的日趨成熟，16S rDNA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和菌種鑒定研究[9-10]。在醋酸菌的選育與同源性鑒定方面[11-14]也有一定的應(yīng)用。

本研究根據(jù)巴氏醋酸桿菌形成菌膜的特性，將生理生化特征鑒定與16S rDNA保守序列分析方法相結(jié)合，試圖獲得一株耐酸、耐醇、產(chǎn)酸高的醋酸菌，并將其與滬釀1.01（Acetobacter pasteurianus HN 1.01）進(jìn)行發(fā)酵特性對(duì)比分析，以評(píng)價(jià)篩選菌的產(chǎn)酸能力，擬為工業(yè)化醋酸生產(chǎn)和優(yōu)良菌株的選取提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

醋醅購自煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；滬釀1.01、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏于合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（YG1）：葡萄糖10 g/L、酵母膏5 g/L、MgSO41.1 g/L、K2HPO43.3 g/L，于0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min，取出冷卻，在無菌操作臺(tái)接種，并加入2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）無水乙醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基（YG2）：葡萄糖10 g/L、酵母膏5 g/L、MgSO41.1 g/L、K2HPO43.3 g/L，于0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min，取出冷卻，接種前根據(jù)具體情況加入無水乙醇。

斜面、平板培養(yǎng)基（YG3）：酵母提取物10 g/L、葡萄糖10 g/L、瓊脂20 g/L，pH 4.5，于0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min，使用前加3%無水乙醇，擺成斜面制成斜面保存培養(yǎng)基。

YPG培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、蛋白胨2 g/L、葡萄糖3 g/L。

分離培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、葡萄糖10 g/L、碳酸鈣10 g/L、瓊脂20 g/L，pH 4.5，于0.1 MPa、121℃條件下蒸汽滅菌20 min，使用前加3%無水乙醇分裝無菌培養(yǎng)皿，制成碳酸鈣平板分離培養(yǎng)基。

淀粉瓊脂平板、乙醇利用培養(yǎng)基、甘油利用培養(yǎng)基均參考文獻(xiàn)[15]配制。

1.1.3 試劑

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，S D S）、蛋白酶K、Tr i s-H C l、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 上海生物工程科技服務(wù)有限公司；苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V） 北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；無水乙醇、Triton X-100、Dupanol溶液、Mcllvaine緩沖液 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海品頓實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；721紫外-可見分光光度計(jì) 江蘇天瑞儀器股份有限公司；酒精計(jì) 衢州艾普計(jì)量儀器有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵醋醅中菌體富集

稱取固體醋醅樣品2 g于50 mL pH 4的YG2中，32 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 d。取1/3培養(yǎng)液接種在含6%無水乙醇和4%乙酸的50 mL的YG2（pH 4）中，32 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 d。如此循環(huán)重復(fù)6 d，獲得初篩醋酸菌富集培養(yǎng)液。

1.3.2 醋酸菌分離

初篩的富集培養(yǎng)液于32 ℃靜置培養(yǎng)3 d，表面會(huì)形成一層菌膜，用接種環(huán)在培養(yǎng)基溶液表面輕輕挑取菌膜，涂布在分離培養(yǎng)基上，32 ℃培養(yǎng)48 h，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的單菌落，于YG3中劃線保存[16]。

1.3.3 醋酸菌理化性質(zhì)鑒定

采用在YPG上培養(yǎng)36 h后的醋酸產(chǎn)生菌及對(duì)照菌滬釀1.01進(jìn)行生理生化反應(yīng)，具體鑒定方法和依據(jù)參照《伯杰細(xì)菌鑒定冊(cè)》[17]。

1.3.4 醋酸菌的16S rDNA鑒定

醋酸菌基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[18-20]。目的菌株的16S rDNA基因擴(kuò)增參照文獻(xiàn)[21-22]，引物序列為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1942R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

以篩選菌株基因組為模板，克隆得到目的基因。通過寶生物試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化收集，經(jīng)膠回收試劑盒純化后的16S rDNA基因送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，用DNAStar軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，提交到NCBI與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的菌株16S rDNA進(jìn)行BLAST對(duì)比[23]。下載與待檢菌株同源性較高的典型醋酸菌的16S rDNA核苷酸序列，用MEGA 2.5軟件采用鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)基本的進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，采用1 000次Bootstrap抽樣對(duì)待檢菌株的分類進(jìn)化地位進(jìn)行分析評(píng)價(jià)[24]。

1.3.5 培養(yǎng)與發(fā)酵

1.3.5.1 種子培養(yǎng)

將BJST-S和滬釀1.01接取1 環(huán)于50 mL YG1中，30 ℃條件下170 r/min培養(yǎng)，每隔6 h取樣檢測(cè)生物量。

1.3.5.2 醋酸發(fā)酵

接種BJST-S和滬釀1.01種子液按體積分?jǐn)?shù)2%接種于YG2中，30 ℃、170 r/min培養(yǎng)，每隔6 h取樣檢測(cè)指標(biāo)。

1.3.5.3 半連續(xù)發(fā)酵

醋酸發(fā)酵達(dá)到48 h時(shí)將發(fā)酵液全部取出，無菌條件下8 000×g離心10 min，將收集的菌體全部接入滅菌后含6%無水乙醇的YG3中，繼續(xù)按上述條件發(fā)酵，如此循環(huán)操作，實(shí)現(xiàn)半連續(xù)發(fā)酵。每隔6 h取樣檢測(cè)指標(biāo)。

1.3.6 指標(biāo)測(cè)定

生物量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[25]；產(chǎn)酸量的測(cè)定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》指示劑法；乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）活力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[26-27]及Wood氏法[28]；乙醇質(zhì)量濃度的測(cè)定參照文獻(xiàn)[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的篩選與鑒定

2.1.1 理化性質(zhì)的鑒定

按照1.3.1、1.3.2節(jié)菌株富集培養(yǎng)和分離的方法，將產(chǎn)生的菌膜涂布于分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取透明圈較大的優(yōu)勢(shì)單菌落保存，分別編號(hào)為1～10，并進(jìn)行淀粉水解實(shí)驗(yàn)、乙醇利用實(shí)驗(yàn)、甘油利用實(shí)驗(yàn)、革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 醋酸菌理化性質(zhì)鑒定結(jié)果Table1 Physiological and biochemical characteristics of acetic acid bacterial isolates

依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[17]與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[30]進(jìn)行菌株生理生化特征鑒定，3號(hào)菌株能夠利用乙醇和甘油，革蘭氏染色為陰性且能夠產(chǎn)酸，如表1所示，結(jié)合巴氏醋酸桿菌產(chǎn)生菌膜的特性可以初步確定3號(hào)菌株是巴氏醋酸桿菌。

2.1.2 16S rDNA的鑒定

2.1.2.1 基因片段提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1 3號(hào)醋酸菌的16S rDNA擴(kuò)增基因片段Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR-amplif i ed 16S rDNA gene fragments from acetic acid bacterial strain No. 3

對(duì)篩選菌株16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，如圖1所示，16S rDNA泳道顯示擴(kuò)增基因大小在1 500 bp左右，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)[31-32]可知，該基因片段符合實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)結(jié)果。

2.1.2.2 核苷酸序列分析

圖2 3號(hào)醋酸菌的16S rDNA核苷酸序列Fig.2 16S rDNA Nucleotide sequences of acetic acid bacterial strain No. 3

經(jīng)過篩選和鑒定的3號(hào)菌株的16S rDNA序列（圖2）上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫中，對(duì)比結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)3號(hào)菌株的16S rDNA序列與Acetobacter屬中編碼為IFO 3283-01的Acetobacter pasteurianus IFO 3283-01的16S rDNA序列有很高的相似度，達(dá)到97%。Weisburg等[21]研究表明：16S rDNA可變序列的相似度超過97%即為同一屬，達(dá)到99%即為同一種。因此可以確定篩選所得菌株為巴氏醋酸桿菌。

表2 3號(hào)醋酸菌的16S rDNA與NCBI的對(duì)比結(jié)果Table2 Results of 16S rDNA sequence alignment of acetic acid bacterial strain No. 3

2.1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 基于16S rDNA序列采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences constructed by the neighbor-joining method

如圖3所示，由系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示所篩選的3號(hào)菌株與Acetobacter pasteurianus IFO 3283-01菌株處于同一分支，經(jīng)過多次測(cè)試分析支持該分支；在NCBI數(shù)據(jù)庫中，與從傳統(tǒng)日本米醋發(fā)酵表面分離出的參考菌株Acetobacter pasteurianus IFO 3283-01有很高的相似度。綜合菌落形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果、16S rDNA序列同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果，鑒定篩選的3號(hào)菌株為醋酸桿菌屬（Acetobacter），將該菌命名為巴氏醋酸桿菌JST-S（Acetobacter pasteurianus JST-S，BJST-S）。

2.2 BJST-S和滬釀1.01的發(fā)酵特性對(duì)比

2.2.1 BJST-S和滬釀1.01生長曲線

圖4 BJST-S和滬釀1.01的生長曲線Fig.4 Growth curves of BJST-S and HN 1.01

由圖4可知，BJST-S和滬釀1.01的生長曲線相似，在0～36 h為對(duì)數(shù)生長期，但是BJST-S菌種的OD600nm增長速率大于菌種滬釀1.01，說明在相同時(shí)間內(nèi)BJST-S菌種生長速率高于滬釀1.01。36 h后則進(jìn)入生長穩(wěn)定期，且最終BJST-S菌種的OD600nm明顯高于菌種滬釀1.01。處于對(duì)數(shù)生長期的菌種活性最高，對(duì)外界因素敏感，此時(shí)接種可使菌體活性最高，因此選取種子培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

2.2.2 不同無水乙醇用量BJST-S和滬釀1.01產(chǎn)酸對(duì)比

圖5 不同無水乙醇用量條件下滬釀1.01（A）和BJST-S（B）產(chǎn)酸對(duì)比Fig.5 Acid production of HN 1.01 (A) and BJST-S (B) at different initial alcohol concentrations

由圖5可知，無水乙醇用量從0%增加到6%，滬釀1.01和BJST-S產(chǎn)酸量都有明顯增加，且在6%乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)測(cè)得發(fā)酵液產(chǎn)酸量最高，滬釀1.01最高產(chǎn)酸量達(dá)到50.80 g/L，BJST-S的最高產(chǎn)酸量達(dá)到了53.88 g/L。當(dāng)?shù)孜餆o水乙醇用量增加至8%時(shí)，測(cè)得發(fā)酵液中總酸量下降且二者差異明顯，BJST-S的產(chǎn)酸達(dá)到24.57 g/L，而滬釀1.01只有15.04 g/L。這是由于酒精有抑制細(xì)菌生長的作用，在發(fā)酵初期，無水乙醇用量過高反而會(huì)抑制醋酸菌的繁殖代謝，使產(chǎn)酸量增長變緩甚至下降。通過比較可知，BJST-S對(duì)乙醇耐受性要高于滬釀1.01，而在最優(yōu)無水乙醇用量條件下，BJST-S的產(chǎn)酸能力略高于滬釀1.01的產(chǎn)酸能力。

2.2.3 不同接種量BJST-S和滬釀1.01產(chǎn)酸對(duì)比

圖6 不同接種量條件下滬釀1.01（A）和BJST-S（B）產(chǎn)酸對(duì)比Fig.6 Acid production of HN 1.01 (A) and BJST-S (B) under different inoculums sizes

采用6%無水乙醇的YG2培養(yǎng)基進(jìn)行不同接種量BJST-S和滬釀1.01產(chǎn)酸對(duì)比研究，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在所選接種量區(qū)間中，兩種醋酸菌的產(chǎn)酸量均隨接種量的升高有緩慢增加。當(dāng)接種量為2%時(shí)，兩者產(chǎn)酸量均在84 h達(dá)到峰值；接種量為10%時(shí)，滬釀1.01在48 h接近峰值，而BJST-S在60 h達(dá)到峰值，且測(cè)得滬釀1.01總酸為53.74 g/L，BJST-S總酸57.48 g/L。這是因?yàn)楫?dāng)接種量較少時(shí)，乙醇對(duì)菌種的生長起到一定的抑制作用，使得菌種生長和產(chǎn)酸速率緩慢，峰值出現(xiàn)遲緩；當(dāng)接種量為10%時(shí)，環(huán)境含氧量為抑制菌體生長的主要影響因素，呼吸強(qiáng)度較高的BJST-S對(duì)環(huán)境含氧量較敏感，三角瓶中氧含量不足時(shí)，更不利于菌種BJST-S生長繁殖和代謝，導(dǎo)致BJST-S最高產(chǎn)酸量峰值遲于滬釀1.01。通過比較可知，在最優(yōu)接種量條件下，BJST-S的產(chǎn)酸量高于滬釀1.01，滬釀1.01最高產(chǎn)酸量為53.74 g/L，BJST-S最高產(chǎn)酸量為57.48 g/L。

2.2.4 不同初始醋酸含量BJST-S和滬釀1.01產(chǎn)酸對(duì)比

圖7 不同初始醋酸含量下的滬釀1.01（A）和BJST-S（B）產(chǎn)酸對(duì)比Fig.7 Acid production of HN 1.01 (A) and BJST-S (B) under different initial acetic acid concentrations

分別向含6%無水乙醇的YG2培養(yǎng)基中接入10%種子培養(yǎng)液，進(jìn)行不同初始醋酸含量BJST-S和滬釀1.01產(chǎn)酸對(duì)比研究結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，初始醋酸含量從1.0 g/L增加到8.2 g/L的過程中，滬釀1.01的產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量升高，當(dāng)初始醋酸含量超過4.6 g/L時(shí)產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量則有所下降；而BJST-S在初始醋酸含量從1.0 g/L增加到6.4 g/L的過程中產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量升高，在6.4 g/L初始醋酸含量總酸含量最大；滬釀1.01的最大總酸含量為61.04 g/L，BJST-S的最大總酸含量為64.09 g/L；當(dāng)初始醋酸含量超過6.4 g/L時(shí)產(chǎn)酸速率和總酸含量則有所下降。說明BJST-S和滬釀1.01在過酸、堿性環(huán)境下不宜生長繁殖和代謝，且機(jī)體中的大多數(shù)反應(yīng)與酶有關(guān)，過酸、過堿都會(huì)導(dǎo)致酶活力降低，從而導(dǎo)致產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量下降；同時(shí)，也說明了在相同發(fā)酵條件下BJST-S的生長繁殖和代謝速率快且對(duì)乙酸的耐受力強(qiáng)。

2.2.5 BJST-S、滬釀1.01的ADH和ALDH活力對(duì)比

圖8 BJST-S和滬釀1.01的ADH/ALDH活性對(duì)比Fig.8 ADH/ALDH activities of BJST-S and HN 1.01

由圖8可知，2 種菌種的ADH和ALDH活力存在差異性，但在不同無水乙醇用量條件下的變化趨勢(shì)一致。在無乙醇情況下，2 種菌種的ADH和ALDH活力較低。無水乙醇用量在2%～4%間，隨著培養(yǎng)基中無水乙醇用量的升高，ADH和ALDH活力也提高，并在4%時(shí)兩種菌株酶活力達(dá)到最高，且滬釀1.01和BJST-S的ADH活力分別為3.50、3.72 U/mg，ALDH活力分別為2.25、2.48 U/mg，且BJST-S的ADH及ALDH活力明顯高于滬釀1.01。當(dāng)無水乙醇用量在4%～8%間，2 種菌種的ADH及ALDH活性水平均下降。這與上述菌體的生長代謝一致，在低無水乙醇用量條件下，菌體產(chǎn)酸速率相對(duì)較快，表現(xiàn)為最先達(dá)到最高產(chǎn)酸量峰值；但在高用量無水乙醇脅迫下，菌種需要一定的時(shí)間適應(yīng)生長環(huán)境，而導(dǎo)致產(chǎn)酸速率相對(duì)較慢，表現(xiàn)為延遲發(fā)酵周期。

2.2.6 BJST-S半連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定性

圖9 BJST-S的批次搖瓶發(fā)酵過程中的變化曲線Fig.9 Time-course curves of batch fermentation of BJST-S in shaking fl asks

由圖9可知，發(fā)酵在0～36 h階段，產(chǎn)酸量呈線性上升，乙醇質(zhì)量濃度降低；48 h時(shí)產(chǎn)酸量最大，為58.10 g/L，此時(shí)產(chǎn)酸強(qiáng)度為1.21 g/（L·h）；第2批次發(fā)酵48 h，最大產(chǎn)酸量為58.60 g/L，此時(shí)產(chǎn)酸強(qiáng)度為1.22 g/（L·h）；第3批次發(fā)酵48 h，最大產(chǎn)酸量為59.68 g/L，此時(shí)產(chǎn)酸強(qiáng)度為1.24 g/（L·h）。在半連續(xù)發(fā)酵3 批次中，BJST-S產(chǎn)酸量維持在58.10～59.68 g/L，發(fā)酵強(qiáng)度維持在1.21～1.24 g/（L·h），半連續(xù)發(fā)酵過程中產(chǎn)酸量和產(chǎn)酸強(qiáng)度變化趨勢(shì)基本一致，說明BJST-S產(chǎn)酸穩(wěn)定性良好。

3 結(jié) 論

本研究利用醋酸發(fā)酵過程中巴氏醋桿菌形成菌膜的特性，對(duì)醋醅中混合菌進(jìn)行初步分離，采用生理生化特征與16S rDNA保守序列分析相結(jié)合的方法對(duì)分離出的醋酸產(chǎn)生菌進(jìn)行鑒定，獲得了BJST-S菌株；在與滬釀1.01進(jìn)行發(fā)酵特性對(duì)比研究中，BJST-S菌株具有良好的生長特性和發(fā)酵產(chǎn)酸能力，且耐醇及耐酸特性優(yōu)于滬釀1.01；在3批次半連續(xù)發(fā)酵中，BJST-S產(chǎn)酸量維持在58.10～59.68 g/L，發(fā)酵強(qiáng)度維持在1.21～1.24 g/（L·h），說明該菌產(chǎn)酸特性穩(wěn)定，可進(jìn)一步進(jìn)行菌種選育，為純種液態(tài)釀造食醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

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Screening and Fermentation Characteristics of an Acetic Acid Bacterial Strain Based on 16S rDNA for Vinegar Production

YAO Hongli1, LI Xingjiang1,2, ZHENG Zhi1,2, SONG Shan1, JIANG Shaotong1,2, LI Shun1, DENG Yongdong1, PAN Lijun1,2, WU Xuefeng1,2,*
(1. School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, Hefei 230009, China)

Acetic acid bacteria are an important factor that inf l uences the eff i ciency of vinegar production by pure culture liquid-state fermentation. The goal of this study was to obtain an outstanding acetic acid bacterial strain for vinegar production by routine screening combined with molecular biological techniques. The target strain was isolated from the biof i lm formed in enrichment culture in the presence of high concentrations of alcohol and acetic acid. It was identif i ed as Acetobacter pasteurianus JST-S (BJST-S) based on physiological and biochemical characteristics combined with 16S rDNA sequence analysis. Comparative analysis of fermentation characteristics indicated that the BJST-S was better than Acetobacter pasteurianus CICC 20001 in term of growth rate, acid production rate, alcohol resistance and acid resistance. The concentration of acetic acid was maintained in the range of 58.10–59.68 g/L and the fermentation strength in the range of 1.21–1.24 g/(L·h) in three batches of semi-continuous fermentation, implicating that the fermentation characteristics of BJST-S were stable. Our fi ndings in this work may provide a valuable reference for strain breeding for the improvement of industrial vinegar production.

Acetobacter pasteurianus; bacterial biof i lm; 16S rDNA; semi-continuous fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201704002

TS255.1

A

1002-6630（2017）04-0006-07

姚洪禮, 李興江, 鄭志, 等. 基于16S rDNA的醋酸菌篩選及其發(fā)酵特性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 6-12. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201704002. http://www.spkx.net.cn

YAO Hongli, LI Xingjiang, ZHENG Zhi, et al. Screening and fermentation characteristics of an acetic acid bacterial strain based on 16S rDNA for vinegar production[J]. Food Science, 2017, 38(4): 6-12. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704002. http://www.spkx.net.cn

2016-06-28

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31601465）；安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（1408085MKL17）；安徽省科技重大專項(xiàng)（15CZZ03100）；合肥工業(yè)大學(xué)青年創(chuàng)新項(xiàng)目（JZ2014HGQC0124）

姚洪禮（1992—），男，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：yaohongli-@hotmail.com

*通信作者：吳學(xué)鳳（1981—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵工程。E-mail：applewuxf@hotmail.com