王曉彬，黃文倩，王慶艷，劉 宸，王超鵬，楊桂燕，趙春江,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心，國家農(nóng)業(yè)智能裝備工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)信息技術(shù)重點實驗室，農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097）

苯甲酸添加劑的拉曼高光譜分析

王曉彬1,2，黃文倩2，王慶艷2，劉 宸2，王超鵬2，楊桂燕2，趙春江1,2,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心，國家農(nóng)業(yè)智能裝備工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)信息技術(shù)重點實驗室，農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097）

對拉曼高光譜成像光譜儀采集苯甲酸添加劑得到的拉曼光譜信號和高光譜圖像進行分析。采用小波去噪方法對原始拉曼光譜信號進行預(yù)處理，利用正交試驗方法確定小波去噪?yún)?shù)的最優(yōu)組合為小波基函數(shù)sym2、分解層數(shù)2、重調(diào)方式sln、閾值方案Rigrsure，此時信噪比為32.092。對去噪后的拉曼光譜進行譜峰歸屬和分析，得到了苯甲酸分子在不同波數(shù)范圍內(nèi)的特征振動模式，其中在1 636、1 603、1 000、793、615 cm-1和420 cm-1處的拉曼信號較強，可作為苯甲酸的拉曼特征頻率。分析不同特征頻率條件下的灰度圖像，發(fā)現(xiàn)圖像的亮度與特征頻率的峰強相關(guān)且變化順序具有一致性。研究結(jié)果為苯甲酸添加劑的檢測分析提供研究基礎(chǔ)。

苯甲酸；小波去噪；譜峰歸屬；圖像分析

苯甲酸（benzoic acid，BA），是一種弱酸，主要用于增塑劑、定香劑、抗微生物劑、食品防腐劑等的制作，也用于聚酰胺樹脂和醇酸樹脂的改性劑及鋼鐵設(shè)備的防銹劑。BA作為常用的酸性食品防腐劑，對霉菌、酵母和細菌有較好的抑制作用。但食用過多含BA添加劑的食品，會造成血液酸堿度失調(diào)、腸胃功能紊亂，特別是對一些特殊人群，可能會帶來蕁麻疹、代謝性酸中毒、哮喘等不良反應(yīng)[1]。目前，對BA的檢測方法主要有：高效液相色譜法[2-3]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4]、氣相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]等，但這些方法存在樣品檢測成本高、前處理程序繁瑣、檢測速度慢等缺陷。

拉曼光譜是一種光的非彈性散射光譜，不同的散射頻率反映了分子中不同基團的振動和轉(zhuǎn)動信息，為研究分子結(jié)構(gòu)提供了一種重要的方法[7]。Peica等[8]在pH 3～8的范圍內(nèi)分析了食用染料E102的表面增強拉曼光譜，得到了不同基團的振動頻率，并對其進行了譜峰歸屬和分析。Xie Yunfei等[9]對偶氮甲酰胺添加劑的紅外光譜、拉曼光譜和表面增強拉曼光譜進行了研究，在密度泛函理論計算的基礎(chǔ)上對不同的振動頻率進行了歸屬，結(jié)果顯示計算出的拉曼光譜與實驗拉曼光譜吻合得很好。高光譜圖像技術(shù)是一種“圖譜合一”技術(shù)，通過光譜儀采集待測物的高光譜圖像，該圖像同時包含了待測物外部的圖像信息和待測物內(nèi)部的光譜信息[10-12]。拉曼高光譜成像技術(shù)是拉曼光譜技術(shù)和高光譜成像技術(shù)高精度融合的技術(shù)，兼有2 種技術(shù)的優(yōu)勢，在獲得待測物拉曼光譜的同時對其可視化，該技術(shù)在食品的添加劑和摻雜物檢測方面得到了較好的應(yīng)用。Dhakal等[13]利用點掃描拉曼光譜成像系統(tǒng)對奶粉中不同濃度的三聚氰胺進行檢測，最低檢測量為0.005%；檢測到的三聚氰胺濃度和混合物實際濃度之間具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.99。Qin Jianwei等[14]采用拉曼成像光譜系統(tǒng)對脫脂奶粉中的多種摻雜物（硫酸銨、雙氰胺、三聚氰胺和尿素）進行檢測，基于摻雜物拉曼峰的單波段無熒光圖像開發(fā)了一種圖像分類方法，找到了摻雜物像素數(shù)目與摻雜物濃度之間的線性關(guān)系。

本研究利用拉曼高光譜成像光譜儀采集了BA添加劑的拉曼光譜和高光譜圖像。采用正交試驗方法得到最優(yōu)的小波參數(shù)去除原始拉曼信號中的高頻噪聲；依據(jù)不同官能團的振動模式對去噪后的拉曼光譜分為3 個波段進行譜峰的歸屬和分析，尋找BA的拉曼特征頻率；對特征頻率條件下的灰度圖像進行分析，探索圖像亮度與頻率強度之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BA（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

I0785MM8000MF-1X20B-SCAN型激光器（功率10 W） 美國Innovative Photonic Solutions公司；LPD01-785RU-25型分光片 美國Semrock公司；InSpector R10E光譜儀 芬蘭Specim公司；iKon-MDU934P-BEX2-DD型電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）相機 英國Andor公司；培養(yǎng)皿（直徑38 mm，深度5 mm） 科晶生物科技有限公司；研缽（外徑8.2 cm，內(nèi)徑6.8 cm） 上?？道噬锟萍加邢薰?。

1.3 方法

1.3.1 拉曼高光譜成像系統(tǒng)

圖1 拉曼高光譜成像系統(tǒng)Fig.1 Raman hyperspectral imaging system

如圖1所示，系統(tǒng)采用波長785 nm線激光器作為激發(fā)光源，激光線投射到45°角放置的波長785 nm分光片上，分光片使得反射激光線垂直入射到樣品表面。光譜儀安裝在16 位的CCD相機上，CCD具有1 024×1 024像素的區(qū)域陣列，波長800 nm時量子效率大于90%，波長1 000 nm時量子效率大約為45%，在圖像采集過程中，CCD熱電冷卻到-65 ℃以盡量減少暗電流。樣品經(jīng)激光線照射后發(fā)生散射，透過分光片散射信號通過由拉曼成像光譜儀和CCD相機組成的檢測模塊采集。相機通過USB電纜連接至電腦，實現(xiàn)相機的控制和數(shù)據(jù)的傳輸。樣品放置于單軸機動定位平臺，該平臺通過計算機控制步進電機發(fā)生移動，工作距離為20 cm，系統(tǒng)采用推掃方式獲取高光譜數(shù)據(jù)。整個系統(tǒng)除計算機外放置在一個黑色的箱子中，以避免環(huán)境光的影響。使用五鈴光學(xué)開發(fā)的Spectral Image-VNIR-R軟件實現(xiàn)相機和步進電機的控制以及數(shù)據(jù)的采集。

1.3.2 數(shù)據(jù)采集

將BA標準品置于研缽中，研磨為粉末后移入培養(yǎng)皿中。調(diào)整焦距確定鏡頭到樣品表面的距離為20 cm。將樣品放置在線激光的中心位置，平臺以0.074 3 mm/s的速率移動，拉曼光譜采集范圍為785～1 000 nm（對應(yīng)拉曼位移0～2 728 cm-1），分辨率為0.278 nm，積分時間為1 000 ms。

1.3.3 光譜處理和圖像分析

由于受激光光源強度變化、CCD熱穩(wěn)定噪聲以及外界雜散光等不確定因素的影響，采集到的拉曼信號中含有大量的高頻噪聲，對拉曼峰的位置和強度產(chǎn)生影響。為去除高頻噪聲影響，提高拉曼信號的質(zhì)量，需對采集到的原始拉曼信號進行預(yù)處理[15]。小波分析具有基函數(shù)選擇靈活、去相關(guān)性和良好的時頻局部性等優(yōu)點，在拉曼信號去噪方面具有較好的應(yīng)用，其去噪過程為：首先選擇合適的小波基函數(shù)對拉曼信號進行不同層數(shù)分解，其次通過閾值量化分離出每一層的高頻信號，最后對處理后的光譜信號進行重構(gòu)以去除噪聲[16]。本研究采用小波去噪方法對BA的拉曼光譜信號進行預(yù)處理，從而獲得高質(zhì)量的拉曼信號。

用小波分析對光譜信號進行去噪時，需要選擇的參數(shù)有：小波基函數(shù)、分解層數(shù)、重調(diào)方式和閾值方案。小波分析具有不同的小波族，每種小波族包含多種小波基函數(shù)，本實驗參照文獻[17-19]，選用haar、db2、sym2和coif1 4 種常用的小波基函數(shù)。分解層數(shù)對去噪效果的影響較大，分解層數(shù)過多（大于5）時，低頻信號的信息丟失嚴重，造成信噪比下降；分解層數(shù)為1時，信號中依然存在大量高頻噪聲，去噪效果不理想，因此分解層數(shù)選擇為2、3、4、5 層。小波分析有2 種重調(diào)方式：sln和mln，前者是依據(jù)第1層的系數(shù)來調(diào)整閾值，后者是依據(jù)每一層的噪聲估計來調(diào)整閾值。常用的閾值方案有4 種，分別為Rigrsure、Heursure、Sqtwolog和Minimaxi。合理的參數(shù)選擇不僅可以完整的保存低頻信號而且可以最大限度的去除高頻噪聲。以上述4 項參數(shù)為正交試驗的因素，不同參數(shù)條件下的數(shù)值為正交試驗的水平，建立L16（21×43）的混合正交試驗用于選擇最優(yōu)的小波去噪?yún)?shù)，試驗結(jié)果以信噪比（signal to noise ratio，RSN）為評價指標，按下式計算。

RSN越高，光譜的去噪效果越好。正交試驗因素水平設(shè)計如表1所示。

表1 小波去噪混合正交試驗的因素和水平Table1 Factors and levels used in orthogonal arry design for the optimization of wavelet de-noising

采用小波分析對拉曼光譜進行預(yù)處理，找到BA的拉曼特征頻率。通過對比不同拉曼特征頻率條件下的灰度圖像，獲取BA的圖像特征。數(shù)據(jù)處理和分析過程基于Matlab 7.11軟件平臺完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 BA的拉曼高光譜

圖2 BA分子結(jié)構(gòu)圖（A）和高光譜示意圖（B）Fig.2 Molecular structure diagram and hyperspectral image of BA

BA的分子式為C7H6O2，其分子結(jié)構(gòu)如圖2A所示。BA分子結(jié)構(gòu)主要由苯基和羧基組成，其中含有C—C、C＝C、C—O、C＝O、C—H等官能團。不同官能團包含不同的振動模式，依據(jù)不同官能團的不同振動模式產(chǎn)生的振動頻率，對BA的拉曼光譜進行歸屬和分析，找出BA的拉曼特征頻率[20]。

如圖2B所示，背景和培養(yǎng)皿不會對BA的拉曼信號產(chǎn)生干擾，但BA拉曼光譜信號中存在大量噪聲，因此須對BA原始拉曼光譜信號進行預(yù)處理，以最大限度地去除噪聲影響，從而更清晰地對BA的拉曼光譜進行歸屬和分析。

2.2 小波去噪?yún)?shù)的選擇

由表2可看出，因素D（閾值方案）對結(jié)果影響最大，在該因素條件下極差為3.861；其次為因素B（分解層數(shù)），各水平間RSN的極差為2.087；再者為因素A（小波基函數(shù)），極差為0.825；對結(jié)果影響最小的為因素C（重調(diào)方式），極差僅為0.215。各因素間綜合比較，得到對BA原始拉曼光譜去噪的最佳參數(shù)組合為A3B1C1D1，即小波基函數(shù)sym2、分解層數(shù)2、重調(diào)方式sln、閾值方案Rigrsure，此時獲得最佳的去噪效果，RSN為32.092。采用上述參數(shù)對BA原始拉曼信號去噪后的光譜信號，如圖3所示，與原始拉曼光譜信號相比，信號中的高頻噪聲明顯減少，拉曼信號更加明顯，有利于譜峰的歸屬和分析。

表2 小波去噪混合正交試驗結(jié)果Table2 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of wavelet de-noising

圖3 小波去噪后的BA拉曼光譜Fig.3 Raman spectrum of BA after wavelet de-noising

為了更清楚地表征BA分子的拉曼光譜特征，根據(jù)苯基和羧基的不同振動模式，對照其他具有相同基團或官能團的物質(zhì)的振動光譜，將去噪后的BA拉曼光譜分為1 700～1 200、1 200～700 cm-1和700～200 cm-13 個波數(shù)段進行譜峰歸屬和分析。

2.3 1 700～1 200 cm-1波數(shù)段的BA拉曼光譜

圖4 1 700～1 200 cm－1范圍內(nèi)BA拉曼光譜Fig.4 Raman spectrum of BA in the range of 1 700–1 200 cm-1

如圖4所示，BA在此波數(shù)范圍內(nèi)的拉曼峰數(shù)目較少，其中1 636 cm-1和1 603cm-1處拉曼強度較高，其他譜峰的強度較弱，分別位于1 514、1 444、1 320 cm-1和1 285 cm-1。在BA的拉曼譜峰中，該波數(shù)范圍內(nèi)的拉曼譜峰主要由苯環(huán)和羧酸的伸縮振動引起[21-23]。

苯的簡并環(huán)伸縮振動在1 596 cm-1附近產(chǎn)生2 個拉曼頻率，其不受取代基的影響，該振動的出現(xiàn)可表明芳香環(huán)的存在。在BA的拉曼光譜中，該振動分別位于1 603 cm-1和1 636 cm-1處。

在苯衍生物的光譜中，1 630～1 450 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)碳碳伸縮振動譜帶，各譜帶的強度與取代基的位置及其推電子或接受電子的性質(zhì)有關(guān)。從圖4可看出，這些振動分別位于1 514 cm-1和1 444 cm-1處。

羧酸會發(fā)生強烈地締合，以二聚體形式呈現(xiàn)。在羧酸的二聚體光譜中，有一處耦合振動：O—H鍵的變形振動（1 440～1 395 cm-1）和C—O鍵的伸縮振動（1 300～1 250 cm-1），該振動可在1 320 cm-1和1 285 cm-1處找到。

2.4 1 200～700 cm-1波數(shù)段的BA拉曼光譜

圖5 1 200～700 cm－1范圍內(nèi)BA拉曼光譜Fig.5 Raman spectra of BA in the range of 1 200–700 cm-1

如圖5所示，在這個波數(shù)范圍內(nèi)，BA拉曼光譜譜峰強度較高，主要由C—H鍵的面內(nèi)面外彎曲振動、苯環(huán)的呼吸振動和C—C鍵的伸縮振動引起[22-24]。

苯環(huán)中C—H面內(nèi)變形振動在1 200～960 cm-1范圍內(nèi)具有一系列的譜帶，這些譜帶通常靠近1 160、1 100、1 070 cm-1和1 030 cm-1。對BA來說，在1 179 cm-1和1 128 cm-1處可觀察到該振動譜帶。

對于單取代苯，最有價值的是1 030 cm-1附近的譜帶和伴隨出現(xiàn)在1 000 cm-1附近很強的環(huán)呼吸振動譜帶。在BA中，這兩處拉曼峰分別位于1 025 cm-1和1 000 cm-1處。

苯環(huán)的C—H面外彎曲振動譜帶位置取決于鄰近的與苯環(huán)相連接的氫原子的數(shù)目，氫原子數(shù)為1時，位于900～860 cm-1。對BA而言，該振動可在868 cm-1處找到。

C—C鍵在拉曼光譜中產(chǎn)生強譜帶，793 cm-1歸屬于苯基和羧基相連接的C—C鍵的伸縮振動，Balachandran等[24]在對m-三氟甲基BA的振動光譜（拉曼和紅外光譜）研究中也發(fā)現(xiàn)該處為C—C鍵的伸縮振動，與本實驗吻合。

2.5 700～200 cm-1波數(shù)段的BA拉曼光譜

圖6 700～200 cm－1范圍內(nèi)BA拉曼光譜Fig.6 Raman spectra of BA in the range of 700–200 cm-1

如圖6所示，在此波數(shù)范圍內(nèi)拉曼譜峰數(shù)目較少且強度相對較弱：615 cm-1和420 cm-1處拉曼峰明顯，其他譜峰分別位于657、496 cm-1和340 cm-1處。主要由苯環(huán)變形振動和整個骨架的振動引起[22-23,25]。

苯環(huán)變形振動譜帶的頻率隨取代基類型的不同而發(fā)生變化，通常出現(xiàn)在650～620、580～430 cm-1范圍及450 cm-1附近。在BA中，該振動分別位于657、615 cm-1和496 cm-1處。

較低頻率譜帶一般由整個骨架的振動引起。420 cm-1歸屬于整個骨架的面外彎曲變形；340 cm-1歸屬于整個骨架的伸縮振動。

2.6 BA的拉曼特征頻率

通過對去噪后BA拉曼光譜的譜峰歸屬和分析，得到了BA分子不同波段的特征振動模式。在1 636、1 603、1 000、793、615 cm-1和420 cm-1處有6 個強度較高的譜峰，這些譜峰代表了苯基和羧基的振動頻率，因此，這6 個譜峰可作為BA的拉曼特征峰。依據(jù)BA的拉曼特征峰頻率，選取高光譜圖像中特征頻率對應(yīng)的灰度圖像，對BA的形態(tài)進行表征。

2.7 BA拉曼特征頻率的圖像分析

圖7 掩膜處理后BA拉曼特征頻率的灰度圖像Fig.7 Gray images obtained from Raman characteristic frequencies of BA after mask processing

圖8 BA拉曼特征頻率的灰度直方圖Fig.8 Gray histograms obtained from Raman characteristic frequencies of BA

對BA拉曼特征頻率的灰度圖像進行掩膜處理以屏蔽背景區(qū)，如圖7所示，在6 個拉曼特征頻率條件下，待測物BA均可辨識，但不同頻率條件下灰度圖像的亮度不同。為更清楚地表示出不同特征頻率灰度圖像亮度的高低，計算目標區(qū)BA的灰度值，如圖8所示，直方圖傾向于灰度級高（255）的一側(cè)，圖像越明亮；直方圖傾向于灰度級低（0）的一側(cè)，圖像越灰暗。對比不同圖像的灰度直方圖可看出，1 000 cm-1對應(yīng)的灰度值主要集中在130～170處，灰度圖像最明亮；793 cm-1對應(yīng)的灰度值主要集中在90～130處，亮度次之；1 603 cm-1對應(yīng)的灰度值主要集中在90～110處，亮度再次之；1 636 cm-1和615 cm-1對應(yīng)的灰度值均主要集中于50～85處，但傾向于灰度級高的一側(cè)，1 636 cm-1對應(yīng)的像素點數(shù)大于615 cm-1處，因此1 636 cm-1較為明亮；420 cm-1灰度值主要集中在50～75處，圖像最為灰暗。結(jié)合圖3可看出，灰度圖像亮度的高低與該頻率條件下的拉曼峰強有關(guān)：峰強越強，亮度越高；峰強越弱，亮度越低。BA拉曼特征頻率的峰強由強到弱分別為1 000、793、1 603、1 636、615、420 cm-1，灰度圖像亮度的變化順序與其相一致。

3 結(jié)論

本實驗采用拉曼高光譜成像光譜儀采集BA添加劑的拉曼光譜和高光譜圖像。對采集到的拉曼光譜信號進行小波去噪預(yù)處理，正交試驗設(shè)計找出去除高頻噪聲的最佳參數(shù)組合，結(jié)果顯示小波分析方法具有較好的去噪效果。將去噪后的BA拉曼光譜分為3 個波數(shù)段進行譜峰歸屬和分析，得到不同波段條件下基團的振動模式，其中6處強度較高的拉曼信號，可作為BA的拉曼特征頻率。對高光譜圖像中拉曼特征頻率對應(yīng)的灰度圖像進行分析，計算對應(yīng)的灰度直方圖，結(jié)合BA的拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)灰度圖像亮度變化順序與特征頻率峰強的強弱變化順序相一致。研究結(jié)果為BA添加劑的拉曼光譜分析提供判別依據(jù)，將促進食品中BA添加劑的快速檢測研究。

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Analysis of Benzoic Acid by Raman Hyperspectral Imaging

WANG Xiaobin1,2, HUANG Wenqian2, WANG Qingyan2, LIU Chen2, WANG Chaopeng2, YANG Guiyan2, ZHAO Chunjiang1,2,*
(1. College of Information and Electrical Engineering, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. Key Laboratory of Agri-informatics, Ministry of Agriculture, Beijing Key Laboratory of Intelligent Equipment Technology for Agriculture, National Research Center of Intelligent Equipment for Agriculture, Beijing Research Center of Intelligent Equipment for Agriculture, Beijing 100097, China)

Raman spectral signals and hyperspectral images of benzoic acid were collected by a Raman hyperspectral imaging spectrometer, and the information was analyzed. The original Raman signal of benzoic acid was preprocessed by a wavelet de-noising method. Optimal parameters for wavelet de-noising that provided the best signal-to-noise ratio (32.092) was determined using an orthogonal array design were established as follows: sym2 wavelet function was used, decomposition level was 2, reset mode was ‘sln’, and threshold option scheme was ‘Rigrsure’. The de-noised Raman spectra were assigned and analyzed. The characteristic vibration modes of benzoic acid in different wavenumber ranges were obtained. The strong spectral peaks at 1 636, 1 603, 1 000, 793, 615 and 420 cm-1could be used as the Raman characteristic frequency of benzoic acid. The Raman characteristic frequencies corresponding to the gray level image obtained from the hyperspectral image were analyzed. The brightness of the image was correlated with the peak intensity of the characteristic frequency, and both changed in the same order. These research results provide a basis for the detection and analysis of benzoic acid.

benzoic acid; wavelet de-noising; spectral peak assignment; image analysis

10.7506/spkx1002-6630-201704047

O657.31；TS211.7

A

1002-6630（2017）04-0290-06

王曉彬, 黃文倩, 王慶艷, 等. 苯甲酸添加劑的拉曼高光譜分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 290-295. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201704047. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaobin, HUANG Wenqian, WANG Qingyan, et al. Analysis of benzoic acid by Raman hyperspectral imaging[J]. Food Science, 2017, 38(4): 290-295. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704047. http://www.spkx.net.cn

2016-07-11

北京市優(yōu)秀人才項目（2015000021223ZK40）；北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金項目（QNJJ201423）

王曉彬（1989—），男，博士，研究方向為智能檢測技術(shù)。E-mail：tawangxiaobin@126.com

*通信作者：趙春江（1964—），男，研究員，博士，研究方向為農(nóng)業(yè)信息化技術(shù)。E-mail：zhaocj@nercita.org.cn