李言+王利芹+劉延嶺+趙聚萍+羅世菊+李曉捷+崔翠菊

摘要：將海帶種質的無菌采集與配子體固相保存相結合，對種海帶的處理、游孢子的采集、配子體的分離與固相接種等關鍵步驟進行了研究和改進，建立了一種高效的海帶配子體固相保存方法，此方法從源頭降低了細菌的污染，減少了配子體保存過程中污染細菌的機會，簡化了常規(guī)固相保存的菌處理流程，提高了保種效率，有利于固相保存方法的大規(guī)模應用。

關鍵詞：海帶；配子體；固相保存；無菌采集

海帶（Saccharina japonica）屬于褐藻門（Phaeophyta）、海帶目（Laminariales）、海帶科（Laminariaceae）、海帶屬（Saccharina），為大型經濟海藻，19世紀20年代從日本首次引進，并逐漸適應中國海域條件，現(xiàn)在是中國人工栽培歷史最長、產量最高的大型經濟海藻，在醫(yī)藥、食品、化工等方面都有廣泛的應用[1-5]。20世紀70年代建立了海帶配子體的采集和培養(yǎng)技術，為海帶的種質保存奠定了基礎[6-8]。利用傳統(tǒng)方法采集的配子體一般要分離到試管中并用棉花塞封口保存，通常每月更換一次培養(yǎng)液，工作量大，操作繁瑣，增加了細菌污染和種質丟失、混雜的機會[9]；2005年山東東方海洋科技股份有限公司和煙臺大學合作開發(fā)了海帶配子體固相保存技術[10]，但由于實驗室原有配子體克隆保存時間的延長、外界環(huán)境及海區(qū)水質的變化[11-15]及液相培養(yǎng)開放性操作等諸多因素的影響，至2008年底保存的海帶配子體克隆多有細菌污染，部分甚至出現(xiàn)真菌，并且污染菌的組成復雜，不是單一的一種菌[16]。采用常規(guī)的固相培養(yǎng)方法，前期處理海帶配子體所附帶細菌的流程比較復雜，同時處理污染較重的海帶雌雄配子體克隆，海帶雌雄配子體克隆往往很難達到無菌狀態(tài)，接種后極易長菌，導致固相培養(yǎng)失敗；超聲波粉碎對海帶配子體的狀態(tài)也有不可逆的負作用[17，18]；這些方面都影響了常規(guī)固相保存技術的推廣應用。為了促進海帶配子體固相保存技術的應用，本研究針對以上問題，從種質采集源頭出發(fā)，建立了一種種質無菌采集與固相培養(yǎng)相結合的方法，有效地解決了上述問題，為固相保存的大規(guī)模應用奠定了基礎。

1材料和方法

1.1實驗材料

在山東東方海洋科技股份有限公司實驗海區(qū)選取性狀優(yōu)良、成熟度好、孢子囊區(qū)突出明顯的種海帶運回實驗室，進行種質采集。

1.2實驗方法

1.2.1孢子囊海帶塊的無菌處理在海帶孢子囊區(qū)剪取2 cm×3 cm左右的長條，利用冷卻的煮沸海水和滅菌脫脂棉反復擦拭，去除藻體上所附著的雜藻、附泥及黏液。在無菌室外間，用高壓滅菌的冷卻海水和滅菌脫脂棉再次擦拭后，移入無菌室超凈工作臺內，首先利用含有100 mg/L的阿奇霉素和100 mg/L的環(huán)丙沙星的雙抗無菌海水浸泡20 min，再利用含有1.5% 碘化鉀的無菌海水浸泡10 min，抽濾海水浸泡5 min，重復一次抽濾海水浸泡5 min。

1.2.2海帶游孢子的放散、附著及萌發(fā)將無菌處理的海帶塊直接放入藍蓋血清瓶，加抽濾的高壓滅菌的冷卻海水進行孢子放散。取6～8滴海帶孢子水在顯微鏡下觀察，查看海帶游孢子的活力和數(shù)量，海帶游孢子密度每視野（160倍鏡下）達5個左右時，移出海帶塊，停止放散。使用300目篩絹過濾海帶孢子液中的黏液及雜質，將海帶孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中進行海帶孢子體的附著、萌發(fā)。培養(yǎng)條件：光照強度1 200～1 500 lx，24 h光照，溫度10～12 ℃，待48 h海帶孢子體附著牢靠后，更換染色缸中的抽濾的高壓滅菌的冷卻海水，5～7 d鏡檢一次。在顯微鏡下，海帶孢子體轉化為海帶配子體雌雄可辨時，即可挑取分離海帶雌雄配子體。

1.2.3固相保存培養(yǎng)基的配制配制PESI固體培養(yǎng)基，每100 mL的PESI液體培養(yǎng)基中添加0.6～0.8 g瓊脂粉，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，在121 ℃，0.1 MPa，30 min條件下高溫滅菌；PESI固體培養(yǎng)基高溫滅菌后冷卻至60 ℃后分別添加阿奇霉素、利福平、制霉菌素，使PESI固體培養(yǎng)中的阿奇霉素濃度為10 mg/L、利福平濃度為10 mg/L、制霉菌素濃度為10 mg/L（即抗生素的最終濃度），混勻后用9 cm直徑的培養(yǎng)皿倒平板，冷凝備用。

1.2.4海帶配子體的分離與接種在超凈工作臺內的顯微鏡下，從事先備好的附有海帶配子體的載玻片上挑取狀態(tài)優(yōu)良、特征明顯的配子體；利用毛細玻璃管將挑取的海帶配子體先移到蓋玻片上，鏡檢確保是一個雌配子體或是一個雄配子體后，再利用毛細管重新吸入植入固體培養(yǎng)基中，完成此操作后需要鏡檢蓋玻片和毛細玻管，看是否有海帶配子體殘留，每個PESI固體培養(yǎng)板接10～15個海帶配子體，接種后利用parafilm封口膜密封。

1.2.5固相保存的培養(yǎng)將接種的PESI固體培養(yǎng)板放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h光照，光強1 200～1 500 lx ，10 ℃左右，保存2個月左右，可見培養(yǎng)基中長出的海帶配子體克隆系藻斑10～15 mm，肉眼可見，此時將其轉入暗光低溫冷藏柜中保存（光照強度0～100 lx，4 ℃左右），使海帶配子體細胞進入休眠狀態(tài)，進行長期保存，根據培養(yǎng)基表面干燥程度添加滅菌的PESI培養(yǎng)液（一般是一年添加一次滅菌的PESI培養(yǎng)液）。

2結果與分析

2.1海帶配子體的分離及固相保存

本實驗中海帶配子體附著培養(yǎng)35 d左右挑取分離雌雄配子體（圖1a，圖2a、2d），利用毛細玻璃管接種到0.8%的PESI固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)90 d左右，長出1.0～1.5 mm的藻斑（圖1b）。

a.附著在載玻片上的海帶雌雄配子體； b.固相保存的海帶配子體藻斑圖1海帶配子體及固相保存

2.2固相保存海帶配子體的復蘇

用滅菌牙簽從PESI固體培養(yǎng)板上挑取肉眼可見的海帶配子體克隆系藻斑（圖2b、2e），接種于滅菌的PESI培養(yǎng)液中，溫度8～12 ℃，光照強度1 000～1 500 lx，24 h光照條件下培養(yǎng)50～60 d即可長成簇狀的海帶配子體克隆系（圖2c、2f）。

a.固相保存接種前的海帶雌配子體；b.固相保存中的海帶雌配子體；c.復蘇培養(yǎng)60 d的海帶雌配子體；d.固相保存接種前的海帶雄配子體；e.固相保存中的海帶雄配子體； f.復蘇培養(yǎng)50 d的海帶雄配子體圖2固相保存的海帶配子體的復蘇

2.3固相保存配子體克隆系的無菌檢測

即固相保存海帶配子體克隆系是否為細菌或真菌污染的檢測：在超凈工作臺中按表1設置檢驗，28 ℃搖菌培養(yǎng)3 d，看培養(yǎng)液是否有菌污染。

進行配子體保存以及其后所進行的固相保存海帶配子體的復蘇過程是否會造成海帶配子體為細菌和真菌所污染，采用搖菌的方法進行初步判定。實驗設計見表1，檢測方法是設置陽性和陰性對照，陽性對照即為已分別接種污染有細菌的配子體的液體培養(yǎng)基—2216E培養(yǎng)液和已接種污染有真菌的配子體的液體培養(yǎng)基—沙堡培養(yǎng)液，陽性對照28 ℃在搖床中搖菌，培養(yǎng)液會變渾濁；陰性對照即為未添加任何污染物的細菌培養(yǎng)液---2216E培養(yǎng)液和真菌培養(yǎng)液—沙堡培養(yǎng)液，陰性對照28 ℃在搖床中搖菌，正常操作下培養(yǎng)液是澄清的；將被檢測物分別加入細菌培養(yǎng)液和真菌培養(yǎng)液中，和陽性、陰性對照在相同條件下?lián)u菌，看渾濁或澄清狀況來判斷是否為細菌或真菌污染，在此實驗中被檢測物為雌性海帶配子體♀、雄性海帶配子體♂復蘇培養(yǎng)液，如果搖菌結果渾濁表明海帶配子體有菌污染，如果搖菌結果澄清表明海帶配子體無菌污染[19-22]。檢測實驗結果見圖3，結果顯示，利用固相保存方法復蘇的配子體未污染細菌和真菌，無菌效果良好。

3討論

3.1接種前配子體處理方式

常規(guī)固相保存需要采用超聲波多次粉碎液體培養(yǎng)的配子體克隆簇狀體，將配子體克隆粉碎為1～4個細胞，超聲波在粉碎處理時，對配子體的機械損傷很嚴重，即使粉碎的同時對樣品進行冰浴，但樣品內部升溫也很快且高，對配子體克隆也會造成很大的損傷，短時間內配子體克隆狀態(tài)難恢復；超聲波粉碎后形成的細胞混液中克隆段大小難控制，配子體克隆上的附菌被打落進入懸液也很難清除，接種固相培養(yǎng)基時更易造成污染；超聲波粉碎儀刀頭清理不當也易造成種間污染；新固相保存方法不需經超聲波粉碎，而是通過采集種質的載玻片進行分離單個的雌雄配子體，當載玻片上附著的孢子萌發(fā)為配子體，經10 d培養(yǎng)，雌雄可辨且每個配子體長到含有十個細胞左右，使用毛細玻璃管轉入固相培養(yǎng)基，對克隆零損傷，也不會帶入過多的培養(yǎng)液造成培養(yǎng)基的污染。

3.2實驗中抗生素的選擇和添加

3.2.1孢子囊海帶塊的雙抗海水處理常規(guī)處理孢子囊海帶塊的雙抗藥物是鏈霉素和青霉素組合，但是本實驗所采用的阿奇霉素和環(huán)丙沙星雙抗組合，是微生物實驗室通過近5年來實驗室人員出海收集的全國各地海區(qū)的海帶樣品，刮取其表面附菌，分離純化菌種，藥敏實驗，最低抑菌濃度實驗，生物學統(tǒng)計，最終得出結論：阿奇霉素和環(huán)丙沙星對95%以上的配子體污染菌都有效（多為高敏或極高敏）；經最低抑菌濃度實驗和反復驗證100 mg/L阿奇霉素和100 mg/L環(huán)丙沙星效果最好[23-25]。

3.2.2固相培養(yǎng)基中添加的抗生素常規(guī)的固相保存需要通過對保存的配子體克隆進行藥敏實驗確定固相培養(yǎng)基中添加抗生素的種類，保存一個配子體就需要做一次藥敏，工作很繁瑣；而此種固相保存培養(yǎng)基中添加的抗生素種類的確定是通過近5年來對每一批新采集的海帶配子體進行跟蹤藥敏實驗，對數(shù)據進行歸納統(tǒng)計總結出對98%的新采集來的海帶配子體附菌均有效的抗生素藥物是阿奇霉素和利福平[23]；同時對污染的真菌也進行了分離純化，藥敏實驗，現(xiàn)有11種常用真菌抗生素，制霉菌素和特比萘芬效果較好[23]；為了防止周圍環(huán)境中的真菌尤其是夏天培養(yǎng)箱潮濕環(huán)境中的真菌污染，在培養(yǎng)基中添加制霉菌素；采用此種方法無須每個樣品都需要做藥敏，大大節(jié)省了固相前處理的一系列預備工作。

3.3接種工具和接種方式

常規(guī)固相操作中，配子體的接種是在超凈工作臺中，用10 mL的一次性無菌注射器取2 mL粉碎的配子體細胞懸液，逐點注射入一個平板內，帶有菌的培養(yǎng)液也被轉入固相培養(yǎng)基中，不但易造成污染，并且一個平板內只保存了一個克隆系，保存的量有限；新固相保存操作中配子體的接種是在超凈工作臺中的顯微鏡下，從附有海帶配子體的載玻片上挑取性狀優(yōu)良、特征明顯的海帶配子體克隆，使用內徑約為200 μm的毛細玻璃管針吸出符合要求的配子體，先轉移到滅菌的蓋玻片上，鏡檢保證是符合要求的那個配子體，并且只有一個配子體后，再重新使用毛細玻璃管吸入并植入固相培養(yǎng)基的表層，此操作完成后再鏡檢一下蓋玻片和毛細玻璃管針，看是否有配子體克隆殘留，沒有殘留則完成海帶配子體的接種；不會帶入過多的培養(yǎng)液造成培養(yǎng)基的污染，一個平板可以保存多個配子體，每一個配子體長成將成為一個克隆系，也就是一個平板能保存多個克隆系，更大地節(jié)省了空間。

3.4PESI固體培養(yǎng)基中瓊脂的濃度

本方法中接種工具和接種方式是使用內徑約為200 μm的毛細玻璃管針，固相培養(yǎng)基硬的話很易折斷針頭，不利于配子體克隆的接種及挑?。煌瑫r含有十幾個細胞的配子體在固相培養(yǎng)基中的生長對濕潤環(huán)境要求更嚴格，經反復試驗確定06%～0.8% 瓊脂濃度使固相培養(yǎng)基更軟彈，固相培養(yǎng)基水分保持較好，更有利于接種配子體的成活。此配方中節(jié)省了瓊脂粉的使用量，降低了成本。

4結論

本研究將海帶配子體的無菌采集和固相保存結合起來，即對種海帶進行擦洗，并立即進行無菌采克隆，待海帶游孢子附著萌發(fā)轉為海帶配子體，當海帶配子體大小適中，密度均勻，雌雄可辨時，分離單個配子體并進行固相保存。具有如下優(yōu)點：節(jié)省空間，利用現(xiàn)有方法試管保存新分離的配子體克隆，占用光照培養(yǎng)箱較大面積，而固相保存，可大大節(jié)省空間面積，并且沒有試管液體保存出現(xiàn)的皮筋老化，試管液體倒、灑等問題。比液相保存更省時省力，保存可長達三年，不用添加培養(yǎng)基或更換培養(yǎng)基，而液相培養(yǎng)一般一個月更換一次培養(yǎng)液，并且操作比較開放，種質污染、混雜機會增加，同時傾倒培養(yǎng)液的過程也是散播污染菌的過程，也會造成不同種污染菌之間的交叉污染。將海帶配子體的無菌采集和固相保存結合起來，通過無菌采集海帶配子體，在源頭就抑制細菌的污染，降低了海帶配子體污染細菌的機會，也大大簡化了海帶配子體固相保存前期的無菌處理流程，降低固相培養(yǎng)前期處理海帶配子體所附帶細菌的難度?，F(xiàn)有方法液相保存有可能會造成種質本身的老化，固相保存可使克隆進入休眠狀態(tài)，減緩海帶配子體克隆的新陳代謝，延長保存時間，便于固相保存方法的推廣應用。

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（收稿日期：2016-12-28）