李先良　李居寧　李傲　夏濤

摘要：為研究XTH基因與棉花（Gossypium spp.）纖維伸長的關系，克隆了兩個XTH基因，分別命名為GhXTH1（GenBank：AY189971）和GhXTH2（GenBank：JN968478）。GhXTH1編碼區(qū)全長870 bp，編碼289個氨基酸，GhXTH1全長885 bp，編碼294個氨基酸。序列分析表明，GhXTH1和GhXTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG。生物信息學分析表明，GhXTH1和GhXTH2均含有信號肽?？缒そY構預測表明，GhXTH1和GhXTH2均在N端存在跨膜螺旋。系統(tǒng)發(fā)生學分析表明，GhXTH1與擬南芥XTH6、XTH7親緣關系較近，GhXTH2與擬南芥XTH9親緣關系較近。半定量分析表明，GhXTH1和GhXTH2均隨著棉花纖維發(fā)育表達量降低，GhXTH2比GhXTH1表達量高。

關鍵詞：棉花（Gossypium spp.）纖維；木葡聚糖轉(zhuǎn)移/水解酶；克隆；表達分析；伸長

中圖分類號：S562；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0756-06

棉花（Gossypium spp.）纖維是由胚珠表皮細胞發(fā)育而來，成熟纖維細胞長度可為其直徑的1 000～3 000倍，有的可達35～40 mm[1]。海島棉（Gossypium barbadense，Gb）成熟棉纖比陸地棉（Gossypium hirsutum，Gh）長，但在開花后24 d，陸地棉纖維長度比海島棉纖維長[2]。棉纖維細胞的伸長開始于開花當天[3-5]，纖維細胞伸長速率最大的階段發(fā)生在開花后6～12 d和15～20 d，兩個階段伸長量可達最終長度的80%[6]。

棉纖細胞伸長由細胞內(nèi)膨壓驅(qū)動，并伴以細胞壁松弛過程。細胞內(nèi)滲透溶質(zhì)增加，促進細胞內(nèi)滲透壓增加，使細胞吸收大量水分，從而使細胞膨壓增加，使細胞滲透壓增加的溶質(zhì)主要是可溶性糖、蘋果酸鹽及鉀離子（K+）[7]。磷酸丙酮酸羧化酶（PEPC）[8]、胞間連絲[9，10]、蔗糖酶（Vacuelar invertase）[11]、水通道蛋白[12]與棉纖細胞膨壓產(chǎn)生或增加有關。

棉纖細胞壁是由纖維素、半纖維素和結構蛋白組成的動態(tài)網(wǎng)絡。半纖維素木葡聚糖是植物細胞初生壁的結構多糖，木葡聚糖鏈通過共價氫鍵綁附到纖維素鏈上，將臨近纖維素微纖絲交聯(lián)起來[13]。微纖絲之間木葡聚糖交聯(lián)結構是細胞伸長的主要限制因素之一。該交聯(lián)結構可以被木葡聚糖轉(zhuǎn)移/水解酶（Xyloglucan endotransglucosylase/Hydrolase，XTH）解開并重新連接，從而降低細胞伸長的阻力，因此XTH能通過松弛細胞壁進而促進細胞伸長。重組擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）XTH14和XTH26加到根系上，展現(xiàn)出對根系細胞伸長明顯的促進作用[14]。在擬南芥中，超表達AtXTH18、AtXTH19、AtXTH20能刺激下胚軸伸長[15]；在棉花中，超表達GhXTH1能增強XTH活性，使棉花纖維長度增加15%～20%[16]。XTH基因在棉花纖維中表達存在時間特異性和品種特異性[17]，在海島棉和陸地棉花棉花纖維中表達存在差異[18]。XTH基因表達模式與棉花纖維長度存在關聯(lián)。

本研究從陸地棉中克隆分離兩個XTH基因，對其進行序列分析、系統(tǒng)發(fā)生學分析和表達分析，以期為了解XTH基因及其家族與棉花纖維伸長之間的關系奠定基礎，從而為棉花纖維品質(zhì)改良特別長度品質(zhì)改良提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用的棉花材料為陸地棉珂字201、華棉99，海島棉為軍海1號。分別取開花后4、9、14、19、24 d棉瓣放入液氮，然后存入-80 ℃冰箱備用。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α為實驗室保存，中間載體pMD18-T購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

棉花纖維總RNA用熱硼酸法提取[19]，并按DNase I試劑盒所示方法處理總RNA，以去除其中DNA，然后用15 μL DEPC ddH2O溶解，分光光度計測定RNA濃度。最后按照Promega反轉(zhuǎn)錄酶體系進行操作，合成第1鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于-20 ℃。

1.3 GhXTH1和GhXTH2克隆

在NCBI中有一個XTH全長編碼序列（AY189971），另外還存在一個EST序列（DV848907）。對于AY189971，根據(jù)其全長序列，從兩端設計引物（GhXET-OE-F：5′-AAAGTCGACATTCTCTTTCTGTTTCTCTGGTTTA-3′；GhXET-OE-R：5′-AAAGGTACCTCAGATGATGGACATGCACTC-3′），以14 d棉花纖維cDNA為模板，PCR擴增后測序。對于DV848907，將其與AtXTH序列比對，發(fā)現(xiàn)該段EST序列與AtXTH基因5′端同源程度較高，而且同源區(qū)包含起始密碼子。根據(jù)此段EST序列設計引物進行3′RACE（Rapid-amplification of cDNA ends），測序得到一段DNA序列，以該序列與EST序列拼接翻譯，發(fā)現(xiàn)以EST序列的第三個堿基開始翻譯能翻譯出一個完整蛋白序列。在該序列內(nèi)存在兩個起始密碼子，以第一個起始密碼子翻譯到蛋白序列長度相對符合XTH蛋白序列長度。RACE方法見參考文獻[20]。

1.4 GhXTH生物信息學分析

利用ClustalW軟件進行多序列對齊和排序， 使用GenDOC和MEGA5.0軟件輸出同源比對和進化樹構建結果[21]；用SingaIP進行信號肽預測[22]；用ProtParam計算蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和理論等電點[23]；利用TMHMM預測蛋白質(zhì)的跨膜結構域。

1.5 GhXTH1和GhXTH2表達分析

UBQ7為RT-PCR分析內(nèi)參基因，設計引物序列為：GhUBI-RT-F：GAAGGCATTCCACCTGACCAAC；GhUBI-RT-F：CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG。GhXTH引物序列為：GhXTH1-RT-F：TCCGTGACAGC

AGATGAGATC；GhXTH1-RT-R：TGGTGCAAACTTA

ACTCCGAC。GhXTH2引物序列為：GhXTH2-RT-F：GGTTTCCGTGACAGCAGATG；GhXTH2-RT-F：GTGCAAACTTAACTCCGACATT。PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。

2 結果與分析

2.1 GhXTH1和GhXTH2全長序列克隆和分析

GhXTH1在NCBI中存在一個全長序列（AY189971），根據(jù)該序列設計引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1A），片段大小在750～1 000 bp間。測序結果表明，該序列與AY189971存在一個堿基差別，但蛋白序列完全相符。將該基因命名為GhXTH1。

在NCBI存在GhXTH的一個EST序列DV848907，將該序列與擬南芥中XTH序列比對，發(fā)現(xiàn)該序列覆蓋該基因的5′端，因此，僅需要進行3′-RACE可得到該基因全長序列，根據(jù)試劑盒（SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit）說明書，進行3′-RACE，擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1B）。將該片段測序，測序后所得序列與EST拼接，將所得序列在Premier軟件進行翻譯，發(fā)現(xiàn)從第3個堿基開始能翻譯出一個蛋白序列。以第一個起始密碼子為起始，能翻譯出289個氨基酸（aa）。以編碼該序列的DNA序列為模板設計引物，用該引物進行PCR擴增（圖1C），對該片段進行測序，所得序列與前面的拼接序列完全吻合。將該序列提交NCBI庫（JN968478）。

2.2 GhXTH1和GhXTH2蛋白特征分析

GhXTH1全長序列包含289個氨基酸，GhXTH2包含294個氨基酸。將擬南芥和其他幾種植物中XTH與克隆得到XTH多序列比對。結果表明，棉花XTH序列與其他XTH序列有比較高的保守性，所有序列都存在維持XTH活性的保守序列DEIDFEFLG[24，25]，但有些序列與之相差1～2個氨基酸（圖2）。GhXTH1保守序列與此相差1個氨基酸，第3個氨基酸由異亮氨酸（I）變成了亮氨酸（L）；GhXTH2保守序列與此相差2個氨基酸，第1個氨基酸從天冬氨酸（D）變成天冬酰胺（N），第3個氨基酸從異亮氨酸變成苯丙氨酸（F）。擬南芥XTH家族中多個XTH保守序列存在1～2個氨基酸變化。

XTH是一種細胞壁蛋白，因此，對所獲得的兩個棉花XTH進行信號肽預測、亞細胞定位預測及等電點等蛋白特征分析。有助于了解其生物學功能。經(jīng)Protparam程序預測，GhXTH1理論分子質(zhì)量33.07 ku，理論等電點（pI）為6.38，GhXTH2理論分子質(zhì)量33.61 ku，理論pI為5.40。通過SignalP 4.1 Server預測，顯示GhXTH1和GhXTH2在N端均存在一段信號肽（圖3），位置位于第1～25 aa。該信號肽的作用是將該蛋白定位至細胞壁。TMHMM預測GhXTH1和GhXTH2均存在1個跨膜結構（圖4），該跨膜結構位于N端，在蛋白序列中信號肽的后面。N-糖基化對維持XTH活性具有重要作用[26]。用NetNGlyc 1.0 Server分析GhXTH1和GhXTH2中 N（天冬酰胺）-糖基化位點。結果表明，GhXTH1存在1個糖基化位點，GhXTH2有兩個糖基化位點，GhXTH1和GhXTH2保守序列DEIDFEFLG后面均存在1個糖基化位點。

2.3 GhXTH1和GhXTH2系統(tǒng)發(fā)育分析

為了解GhXTH1、GhXTH2與擬南芥XTH之間進化關系，進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖6）。AtXTHs可以分3類，大部分Ⅰ類XTH成員包含4個外顯子，Ⅱ類XTH成員具有2或3個外顯子，Ⅲ類XTH成員具有4或5個外顯子，且3類XTH C端存在特征序列[25]。但隨著AtXTHs與水稻XTHs（OsXTHs）疊加系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類和Ⅱ類XTH成員分歧已不明顯[27]；Ⅲ類顯示具有木葡聚糖水解酶活性而不是轉(zhuǎn)糖基酶活性[28]。但酶活性分析表明Ⅲ類酶并不都具有水解酶活性，番茄中的一個Ⅲ類XTH（SIXTH5）表現(xiàn)出轉(zhuǎn)糖基酶活性[29]。因此，XTH系統(tǒng)發(fā)生學分類與其活性之間并無關系。GhXTH1與AtXTH6、AtXTH親緣關系較近，GhXTH2與AtXTH9親緣關系較近，均屬于Ⅰ/Ⅱ類XTH。

2.4 GhXTH1和GhXTH2在棉花纖維發(fā)育中的表達分析

為獲得兩個XTH在不同棉花纖維中隨發(fā)育時期的表達模式，用克隆到兩個XTH序列設計引物，進行半定量分析，以了解兩個XTH在陸地棉和海島棉棉花纖維發(fā)育中的表達模式（圖7）。結果表明，GhXTH1和GhXTH2在陸地棉和海島棉表達量均隨著棉花纖維發(fā)育而下降。在棉花纖維發(fā)育的初生壁時期，細胞伸長較快，XTH大量表達能松弛初生細胞壁進而釋放因細胞伸長而產(chǎn)生的阻力。在陸地棉和海島棉中，GhXTH2表達量比對應發(fā)育時期GhXTH1表達量高。

3 討論

利用傳統(tǒng)PCR技術和RACE技術，從棉花纖維中分離到兩個XTH基因，分別命名為GhXTH1和GhXTH2。序列比對發(fā)現(xiàn)它們均存在XTH家族保守基序DEIDFEFLG，該基序不僅在XTH家族中保守，在XTH所隸屬的GH16家族中也相對保守[30，31]。從擬南芥和水稻XTH家族保守序列看，該基序在某些位點有些變化。因此，GhXTH1和GhXTH2在該基序上有1～2氨基酸殘基變化不影響其成為XTH家族成員。

擬南芥XTH家族包含33個成員，從系統(tǒng)發(fā)生學角度可分為3類[32]，GhXTH1和GhXTH2均屬于其中Ⅰ類（Group Ⅰ/Ⅱ）。Ⅰ類XTH具有一個共同特征，XTH基因由4個外顯子組成，其保守基序位于3個外顯子上。但系統(tǒng)發(fā)育分類與XTH活性無關[29]，在水稻中，Ⅲ類中兩個XTH（OsXTH19，OsXTH20）僅表現(xiàn)出水解酶活性，而Ⅰ類中的OsXTH1具有內(nèi)轉(zhuǎn)移酶活性和水解酶活性[33]。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，GhXTH1與AtXTH6、AtXTH7親緣關系密切，而GhXTH2與AtXTH9親緣關系較近。將GhXTH1和具有水解酶活性XTH（TmNGX1）進行三維結構比較可知，其在負責水解活性的保守環(huán)狀結構上存在差異，因此，GhXTH1主要是轉(zhuǎn)糖基酶活性[17]。AtXTH9活性還無報道，但從系統(tǒng)發(fā)生分析看，AtXTH9、GhXTH2與GhXTH1關系較近，它們在酶活性上應該是類似的，AtXTH9表達受遠紅光的正調(diào)控[34]。因此，GhXTH2的表達有可能受到紅外光的正調(diào)控。

XTH具有多種生理功能，包括有細胞生長[15，16，35]、水果軟化[29，36]、器官脫落[37，38]、維管形成[39-42]等。水稻3個XTH酶活性類型不同，將它們在水稻中超表達或抑制表達，均不能明顯改變水稻表型，說明這3個XTH存在功能冗余[33]。GhXTH1和GhXTH2在棉纖中有較高的表達，說明其與棉花纖維發(fā)育有關。GhXTH1在具有更長棉花纖維的棉花品種或者海島棉中上調(diào)表達[17]，說明GhXTH1與棉纖伸長有關，GhXTH1在棉花中超表達后，棉纖轉(zhuǎn)糖基酶活性增加，成熟纖維長度也有增加。GhXTH2在棉花纖維中表達高于GhXTH1，因此，GhXTH2在棉花纖維伸長方面的作用可能比GhXTH1強，但也不能排除GhXTH1和GhXTH2在棉花纖維伸長方面存在功能冗余。

4 結論

獲得了兩個全長木葡聚糖轉(zhuǎn)移/水解酶基因GhXTH1和GhXTH2全長cDNA序列，GhXTH1和GhXTH2均含有信號肽和跨膜結構，這表明其是定位于質(zhì)膜上的分泌性蛋白。GhXTH1和GhXTH2均含有XTH家族的保守基序DEIDFEFLG，且在基序后存在糖基化位點，該基序和糖基化是XTH產(chǎn)生活性必需的，這說明所獲得兩個序列具有該家族的一般特性。系統(tǒng)發(fā)生學分析表明，GhXTH1與擬南芥XTH6、XTH7親緣關系較近，GhXTH2與擬南芥XTH9親緣關系較近。GhXTH1和GhXTH2均隨著棉花纖維發(fā)育表達量降低，GhXTH2比GhXTH1表達量高。

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