(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

雞傳染性腔上囊病病毒(IBDV)感染雛雞免疫器官巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化

趙霞，張瑞莉，欒亞男，羅海燕，劉瑞，葛銘

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

為明確傳染性腔上囊病病毒(IBDV)感染雛雞免疫器官巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化，將50只14日齡SPF雛雞隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組。感染組經(jīng)點(diǎn)眼、滴鼻途徑每只感染傳染性腔上囊病病毒，6×106．5TCID50。對(duì)照組經(jīng)相同途徑給予相同劑量PBS。于感染后第1、4、7、21天及35天快速采取胸腺、腔上囊及脾臟并制成冰凍切片，應(yīng)用間接免疫熒光法檢測(cè)免疫器官巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化。結(jié)果顯示，感染組雛雞胸腺巨噬細(xì)胞數(shù)量在感染后第1－4天明顯升高(P＜0．01或P＜0．05)，腔上囊、脾臟巨噬細(xì)胞數(shù)量于感染后第1－7天明顯高于對(duì)照組(P＜0．01或P＜0．05)，隨后降低，于第35天恢復(fù)正常(P＞0．05)。結(jié)果表明，IBDV可導(dǎo)致雛雞免疫器官內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量先升高后降低，之后隨著機(jī)體的自我調(diào)節(jié)逐漸恢復(fù)正常。

IBDV;雛雞;免疫器官;巨噬細(xì)胞

雞傳染性腔上囊病是由傳染性腔上囊病病毒(IBDV)引起雞的一種急性高度接觸性傳染病，IBDV主要侵害中樞免疫器官-腔上囊，其中對(duì)B淋巴細(xì)胞的損傷尤為嚴(yán)重。IBDV不僅侵害腔上囊，對(duì)胸腺、脾臟等免疫器官也有一定的損傷，導(dǎo)致雛雞免疫功能抑制，增加對(duì)其他禽病的感染性，降低對(duì)疫苗的應(yīng)答，導(dǎo)致免疫失敗。巨噬細(xì)胞是吞噬細(xì)胞的一種，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。巨噬細(xì)胞不僅能夠吞噬病原微生物，還能夠吞噬被病原微生物感染的細(xì)胞。組織中的巨噬細(xì)胞是從離開血液循環(huán)進(jìn)入周圍組織的單核細(xì)胞分化而來，其主要功能是識(shí)別進(jìn)而吞噬入侵微生物并將其降解。降解產(chǎn)物抗原肽能夠與巨噬細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合并表達(dá)于細(xì)胞表面以激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞。巨噬細(xì)胞也因此被歸為抗原提呈細(xì)胞。另外，其表面具有多種趨化因子的受體，在感染部位趨化介質(zhì)的作用下，它們能夠沿趨化介質(zhì)的濃度梯度運(yùn)動(dòng)，從而迅速抵達(dá)感染部位。

近年來，許多學(xué)者都致力于研究IBDV對(duì)雛雞腔上囊的侵害及其對(duì)淋巴細(xì)胞的影響。而IBDV對(duì)雛雞巨噬細(xì)胞損傷的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過研究IBDV對(duì)雛雞胸腺、腔上囊及脾臟巨噬細(xì)胞數(shù)量變化的影響，進(jìn)一步明確IBDV的致病機(jī)理，為傳染性腔上囊病的防治提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IBDV JIC7株，TCID50為105．5/0．1 mL，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

14日齡SPF雛雞，50只，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1．2 主要試劑鼠抗雞Monocyte/Macrophage單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Southern Biotech公司;異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗鼠IgG，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;濃縮型正常山羊血清，購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理50只SPF雛雞隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，每組25只。感染組經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻途徑，每只感染傳染性腔上囊病毒，6×106．5TCID50，對(duì)照組經(jīng)相同途徑給予相同劑量PBS。于感染后第1、4、7、21天及35天快速采取胸腺、腔上囊及脾臟于－80℃保存。

1．4 間接免疫熒光檢測(cè)雛雞免疫器官巨噬細(xì)胞數(shù)量將組織從－80℃取出，修成3×2×0．5 cm大小的組織塊，置于冰凍切片機(jī)中制成7 μm的冰凍切片。切片于室溫晾1 h，置于丙酮中－20℃固定20 min，室溫晾干。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。即用型正常山羊血清用PBS緩沖液1∶100稀釋，室溫封閉20 min。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。鼠抗雞Monocyte/Macrophage單克隆抗體1∶100稀釋，37℃孵育2 h。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗鼠IgG 1∶300稀釋，于37℃避光孵育1．5 h。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。PBS緩沖液洗3次，每次5 min。甘油與蒸餾水1∶1混合液封片。

結(jié)果判定:巨噬細(xì)胞呈熒光綠。

巨噬細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:每張切片在40倍顯微鏡下選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算平均巨噬細(xì)胞數(shù)量［5］。

1．5 數(shù)據(jù)處理采用SPASS 17．0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法進(jìn)行各組間多重比較，結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差

2 結(jié)果

2．1 IBDV感染雛雞胸腺巨噬細(xì)胞數(shù)量變化雛雞感染IBDV后，其胸腺巨噬細(xì)胞數(shù)量變化如圖1，感染組雛雞胸腺巨噬細(xì)胞數(shù)量在感染后第1-4天明顯高于對(duì)照組(P＜0．01或P＜0．05)，之后逐漸減少，于7－35 d與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0．05)。

圖1 雛雞胸腺巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化

2．2 IBDV感染雛雞腔上囊巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化

雛雞感染IBDV后，其腔上囊巨噬細(xì)胞數(shù)量變化如圖2，感染組雛雞腔上囊巨噬細(xì)胞數(shù)量在感染IBDV后第1天極顯著升高(P＜0．01)，之后逐漸減少，但在感染后第4－7天仍極顯著高于對(duì)照組雛雞(P＜0．01)。而在感染后第21天卻明顯降低(P＜0．05)。隨后在感染后第35天升高但差異不顯著(P＞0．05)。

圖2 雛雞腔上囊巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化

2．3 IBDV感染雛雞脾臟巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化

雛雞感染IBDV后，其脾臟巨噬細(xì)胞數(shù)量變化如圖3，感染組雛雞感染IBDV后1－7 d，其脾臟巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0．01或P＜0．05)。且在感染后第4天達(dá)到峰值。之后減少，逐漸恢復(fù)(P＞0．05)。

2．4 IBDV感染雛雞初期免疫器官巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化雛雞感染IBDV后，在初期其胸腺、腔上囊及脾臟的巨噬細(xì)胞數(shù)量變化如圖4，感染組細(xì)胞數(shù)量均比對(duì)照組明顯增多。

圖3 雛雞脾臟巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化

圖4 雛雞免疫器官巨噬細(xì)胞數(shù)量變化

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，參與非特異性及特異性免疫并且在抗病原體感染中發(fā)揮重要作用。當(dāng)病原體侵入機(jī)體，巨噬細(xì)胞首先發(fā)揮免疫防御作用，吞噬并清除入侵的病原體，并且能夠吞噬凋亡細(xì)胞［3－4］。另外，巨噬細(xì)胞具有免疫自穩(wěn)作用，即吞噬并清除機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中產(chǎn)生的衰老、損傷、變性及死亡的細(xì)胞。此外，巨噬細(xì)胞還具有免疫調(diào)節(jié)作用:一方面，可以啟動(dòng)和增強(qiáng)免疫應(yīng)答發(fā)揮正相調(diào)節(jié)作用;另一方面，若巨噬細(xì)胞過度激活可成為抑制性巨噬細(xì)胞，抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)或直接損傷淋巴細(xì)胞，抑制活化的巨噬細(xì)胞從而發(fā)揮負(fù)相調(diào)節(jié)作用［5］。巨噬細(xì)胞表面具有眾多模式識(shí)別受體，其識(shí)別病原體后激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，釋放促炎性細(xì)胞因子及趨化因子，以阻止病原體擴(kuò)散，促進(jìn)機(jī)體康復(fù)［5－6］。

機(jī)體感染病毒后，先天性免疫立即啟動(dòng)而特異性免疫大約在一周后形成［5］。龍塔等以21日齡SPF雛雞為對(duì)象感染IBDV，發(fā)現(xiàn)雛雞脾臟在感染后6 h即可檢出IBDV，其與腔上囊是病毒含量最多的器官［7］。高以鳴等以28日齡的SPF雛雞為對(duì)象感染IBDV后，在雛雞腔上囊中最早檢出IBDV并且病毒含量最高，含毒時(shí)間最長(zhǎng)，而脾臟和胸腺分別在病毒感染后1．5 d和2．5 d檢出IBDV［8］。上述結(jié)果表明，不同日齡的SPF雛雞感染IBDV后其體內(nèi)IBDV的分布是不同的。本試驗(yàn)的另部分結(jié)果已證明，雛雞在感染IBDV后第1天，外周血液淋巴細(xì)胞內(nèi)即檢測(cè)到IBDV［9］。這就提示我們，在感染后1 d感染組雛雞胸腺、腔上囊及脾臟中可能有IBDV病毒存在。當(dāng)IBDV進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)誘導(dǎo)感染部位的巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞分泌大量的炎性因子及趨化因子，從而進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞［1］。這就佐證了我們的試驗(yàn)結(jié)果，即感染組雛雞在感染IBDV后1－4 d免疫器官巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯上調(diào)(P＜0．01或P＜0．05)。而在胸腺及腔上囊中感染后第4天較第1天巨噬細(xì)胞減少可能是由于巨噬細(xì)胞被過度激活而成為抑制性巨噬細(xì)胞，從而抑制了活化的巨噬細(xì)胞。在胸腺中，感染組雛雞巨噬細(xì)胞數(shù)量在感染后7－35 d與對(duì)照組無顯著差異(P＞0．05)。胸腺是T淋巴細(xì)胞大量定居的地方，而巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分化和增殖，維持胸腺細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境的作用［5］。在感染后7 d左右特異性免疫被激活，淋巴細(xì)胞受刺激而增殖，并且胸腺病毒含量相對(duì)于腔上囊較少，巨噬細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常水平。在腔上囊中，感染組雛雞巨噬細(xì)胞數(shù)量在感染后第7天仍高于對(duì)照組(P＜0．01或P＜0．05)，這一結(jié)果與劉玉峰等人的試驗(yàn)結(jié)果相一致。其研究發(fā)現(xiàn)，用IBDV超強(qiáng)毒株感染SPF雛雞后1－7 d，雛雞腔上囊內(nèi)可見大量凋亡的淋巴細(xì)胞［10］。而凋亡的淋巴細(xì)胞由巨噬細(xì)胞吞噬清除［11］，并且巨噬細(xì)胞吞噬凋亡的淋巴細(xì)胞后發(fā)生自噬與異噬現(xiàn)象［12］。我們的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在感染后第21天，感染組雛雞巨噬細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最低峰(P＜0．05)。推測(cè)其原因，一方面，可能與巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞而發(fā)生自噬與異噬有關(guān);另一方面，可能是因?yàn)殡S著病毒的入侵，腔上囊發(fā)生萎縮、壞死而導(dǎo)致。在脾臟中，感染組雛雞巨噬細(xì)胞數(shù)量在感染后第7天仍明顯上調(diào)(P＜0．01或P＜0．05)，這可能是因?yàn)槠⑴K是巨噬細(xì)胞分布最多也是最復(fù)雜的器官［5］，所以其負(fù)反饋調(diào)節(jié)出現(xiàn)的較晚所導(dǎo)致的?？赡苡捎谄⑴K在IBDV的感染中受損相對(duì)較輕，所以感染組在感染后第21天開始恢復(fù)正常。我們的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雛雞在感染IBDV后第35天免疫器官的巨噬細(xì)胞數(shù)量基本恢復(fù)正常，且已有研究表明，雛雞在感染IBDV后一個(gè)月左右機(jī)體基本恢復(fù)正常［3］。

綜上所述，雛雞在感染IBDV后其免疫器官的巨噬細(xì)胞被大量激活，之后隨著機(jī)體的自身調(diào)節(jié)而逐漸趨于正常。

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The Number of Macrophage inImmune Organs of Chicken Infected With IBDV

ZHAO Xia，ZHANG Rui-li，LUAN Ya-nan，LUO Hai-yan，LIU Rui，GE Ming
(College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the number of macrophages in immune organs of chicken infected with infectious bursal disease virus(IBDV)，fifty 14-day-old specific pathogen free(SPF)chickens were randomly divided into two groups: the infected group and the control group．The chickens of infected group were treated with IBDV by intraocularly and intranasally with 0．6 ml per chicken．Meanwhile，the control group chickens were administrated with PBS by the same way．The immune organs were sampled at 1，4，7，21 and 35 days after infection and were prepared into frozen sections．The number of macrophages in immune organs were detected by the indirect immunofluorescence．The results showed that the number of macrophage of infected group in thymus at 1-4 day were significantly up-regulated(P＜0．01 or P＜0．05)．The indexes in the spleen and bursa of Fabricius at 1-7 day were significantly upregulated when compared with that in the control group(P＜0．01 or P＜0．05)．And then the indexes were gradually decreased and restored at 35．The results illustrate that the IBDV could increase the number of macrophages in immune organs firstly and then decrease the number of macrophages．The number of macrophage in immune organs was restored gradually because of the self-regulation．

IBDV;chickens;immune organs;macrophage

GE Ming

S831．7

A

0529-6005(2017)01-0030-04

2015-09-28

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C201119);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31272533)

趙霞(1991-)，女，碩士生，從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail:15765520651@163．com

葛銘，E-mail:gemingdn@sohu．com