張曉雅+馮淬靈+孟玉鳳+杜建超+岑錦裳+魏永杰

摘要：目的 觀察PM2.5致輔助性T細(xì)胞17（TH17）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）失衡誘發(fā)的大鼠肺損傷及不同中藥治法的干預(yù)作用。方法 將SPF級雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥1組和中藥2組。采用氣道滴注方法建立PM2.5致肺損傷模型，模型組和正常組予生理鹽水灌胃，中藥1組和及中藥2組分別予玉屏風(fēng)散及過敏煎合止嗽散灌胃。ELISA檢測各組肺泡灌洗液（BALF）及血清白細(xì)胞介素（IL）-17、IL-10、IL-8、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）、黏蛋白（MUC）5AC含量；免疫組化檢測肺組織Foxp3、IL-17的表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組血清和BALF IL-8、IL-17、NE、MUCAC含量顯著升高，IL-10含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），肺組織IL-17蛋白表達(dá)明顯增加、Foxp3蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥1組及中藥2組血清和BALF IL-8、IL-17、NE含量明顯降低，BALF IL-10明顯升高，中藥2組血清IL-10明顯升高（P<0.05），肺組織IL-17蛋白表達(dá)明顯降低、Foxp3蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01），病理學(xué)變化明顯改善。結(jié)論 PM2.5可通過引起Th17/Treg失衡誘發(fā)肺損傷，玉屏風(fēng)散及過敏煎合止嗽散均可明顯改善PM2.5致大鼠肺組織病理損害，并可改善PM2.5導(dǎo)致的TH17/Treg失衡。

關(guān)鍵詞：玉屏風(fēng)散；過敏煎合止嗽散；PM2.5；肺損傷；輔助性T細(xì)胞17；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.012

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）04-0045-05

Effects of Yupingfeng Powder and Guomin Decoction Combined with Zhisou Powder on Lung Injury Rats Caused by Imbalance of Th17/Treg Induced by PM2.5 ZHANG Xiao-ya1，2， FENG Cui-ling3， MENG Yu-feng1， DU Jian-chao1， CEN Jin-shang4， WEI Yong-jie5 （1. Dongzhimen Hospital Attached to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China； 2. Cangzhou Central Hospital， Cangzhou 061014， China； 3. Peoples Hospital of Peking University， Beijing 100044， China； 4. Sinopharm Group Guangdong Medi-World Pharmaceutical Co， Guangzhou 528303， China； 5. State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment， Chinese Research Academy of Environmental Sciences， Beijing 100012， China）

Abstract： Objective To observe the lung injury of rats caused by PM2.5 induced imbalance of TH17/Treg immune system and the intervention effect of two different TCM treatments. Methods Wistar male rats were randomly divided into normal group， model group， TCM-treated group1 and TCM-treated group 2. PM2.5-induced lung injury model was established by airway instillation. Model group was given normal saline for gavage. TCM- treated group 1 and 2 were given Yupingfeng Powder and Guomin Decoction combined with Zhisou Powder for gavage. The pathological changes of bronchial and lung tissues， the contents of IL-8， IL-10， IL-17， NE， and MUC5AC in serum and BALF were compared， and the expressions of Foxp3 and IL-17 in lung tissue of each group were analyzed. Results Compared with normal group， the contents of IL-8， IL-17， NE and MUC5AC in serum and BALF of model group increased significantly， while IL-10 decreased significantly （P<0.05， P<0.01）； the expression of IL-17 increased significantly and the expression of Foxp3 decreased significantly in lung tissue （P<0.01）. Compared with model group， the contents of IL-8， IL-17， and NE decreased in TCM-treated group 1 and 2， while the content of BALF IL-10 increased significantly （P<0.05）. The content of IL-10 in serum increased significantly in TCM-treated group 2 （P<0.05）； the protein expression of IL-17 of lung issue decreased significantly， and the protein expression of Foxp3 increased significantly （P<0.01）. The pathological changes were improved significantly. Conclusion PM2.5 can induce lung injury caused by the imbalance of TH17/Treg. Both two treatments can significantly improve the lung injury induced by PM2.5 and the imbalance of TH17/Tregs immune system.endprint

Key words： Yupingfeng Powder； Guomin Decoction combined with Zhisou Powder； PM2.5； lung injury； TH17； Treg； rats

近年來，空氣污染加重，霧霾頻現(xiàn)。細(xì)顆粒物（paticulate matter，PM）是霧霾的主要成分。PM2.5有粒徑小、面積大、活性強(qiáng)，易附帶有毒、有害物質(zhì)，且在大氣中的停留時間長、輸送距離遠(yuǎn)等特點(diǎn)。PM2.5的這些特性決定其表面可以吸附更多有害物質(zhì)，并且可以自如避開呼吸系統(tǒng)的天然屏障如鼻毛、支氣管纖毛等而進(jìn)入細(xì)小支氣管及肺組織內(nèi)，對人體造成更大的損傷。本研究運(yùn)用過敏煎合止嗽散及玉屏風(fēng)散干預(yù)PM2.5致大鼠肺損傷模型。前者可祛風(fēng)固衛(wèi)、宣肺止咳，后者偏于益氣固表、防邪外侵。初步探討2種不同治法的干預(yù)作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

清潔級雄性Wistar大鼠24只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量（200±20）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號11400700124029。飼養(yǎng)于20～25 ℃、12 h光照清潔的動物房，自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.2 藥物及制備

玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成，國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司加工成浸膏劑，用去離子水配制成0.8 g/mL；過敏煎合止嗽散由銀柴胡10 g、防風(fēng)10 g、烏梅 6 g、五味子10 g、陳皮10 g、桔梗10 g、炙紫菀10 g、制百部10 g、荊芥10 g、白前10 g、生甘草4 g組成，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房，北京康仁堂藥業(yè)有限公司制成顆粒，用去離子水配制成0.172 g/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

PM2.5石英纖維膜由中國環(huán)境科學(xué)院提供，采集機(jī)器為TH-16A型大氣顆粒物智能采樣儀，采集時間為2015年1月-3月，采集地點(diǎn)為中國環(huán)境科學(xué)院北段大樓樓頂。每張膜約含PM2.5量120 mg，共6張膜，制成PM2.5懸液。大鼠白細(xì)胞介素（IL）-8酶聯(lián)免疫試劑盒（E02I0056，Blue Gene），IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒（CSB-E04595r，武漢華美），IL-17酶聯(lián)免疫試劑盒（CSB-E07451r，武漢華美），黏蛋白/黏液素5AC（MUC5AC）酶聯(lián)免疫試劑盒（CSB-E16223r，武漢華美），中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）酶聯(lián)免疫試劑盒（CSB-E08847r，武漢華美），兔抗IL-17多克隆抗體（ab79056，Abcam），鼠抗Foxp3單克隆抗體（sc-130666，Santa Cruz）。精密天平（BSA223S-CW，上海人和科學(xué)儀器有限公司），超聲震蕩器（JP-C100，廣州市吉普超聲波電子設(shè)備有限公司），低溫冷凍干燥機(jī)（LGJ-10 普通型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，Thermo Scientific），電熱恒溫培養(yǎng)箱（SKP-02.600，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司），離心機(jī)（3K18，Sigma公司），攝像裝置（Moticcam 2306，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司），成像軟件系統(tǒng)（Motic Images Advanced 3.2，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥1組和中藥2組，每組6只。正常組正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)；模型組實(shí)驗(yàn)第1日開始第1次氣道滴注PM2.5懸液染毒，染毒濃度為8 mg/kg，滴注方法參照文獻(xiàn)[1]，后每隔2 d染毒1次，共10次，最后1次染毒48 h后處死大鼠，給予生理鹽水灌胃；中藥組PM2.5染毒同模型組，中藥1組予玉屏風(fēng)散灌胃，中藥2組予過敏煎合止嗽散灌胃。給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)30 d。

2.2 一般觀察

分別于實(shí)驗(yàn)第1、10、20、30日觀察大鼠活動度、呼吸及胸廓起伏、體質(zhì)量等。

2.3 肺組織形態(tài)觀察

大鼠10%戊巴比妥（0.3 mL/kg）腹腔注射麻醉，開胸取右側(cè)肺組織，用4%、pH 7.4多聚甲醛緩沖液固定48 h，乙醇石蠟包埋，切片（厚度5 μm），供HE染色及免疫組化測定使用。

2.4 肺泡灌洗液和血清相關(guān)指標(biāo)測定

麻醉大鼠剪開腹部皮膚及皮下組織，暴露腹主動脈，抽血8 mL，4 ℃、1000 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存。剪開頸部、胸部皮膚，暴露氣管及肺臟，剝離氣管及左側(cè)肺臟、心臟及胸腺，找到氣管分支，結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)氣管注入無菌生理鹽水4 mL至左主支氣管和左肺，再慢慢回抽，回抽液大約2～3 mL，反復(fù)3次，于4 ℃、1000 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃低溫冰箱保存。ELISA檢測大鼠肺泡灌洗液（BALF）和血清IL-8、IL-10、IL-17、NE和MUC5AC含量；免疫組化法檢測大鼠肺組織IL-17、Foxp3蛋白表達(dá)。取大鼠右下肺切片，每張切片加50 μL生物素標(biāo)記一抗（1∶100），37 ℃孵育40 min，0.01 mmol/L PBS浸泡5 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育20 min，0.01 mmol/L PBS浸泡5 min×3次，每張切片加100 μL新配制的DAB工作液，鏡下觀察隨時終止反應(yīng)，自來水浸泡5 min，蘇木素復(fù)染3～10 min，自來水浸泡5 min，晾干，中性樹膠封固。應(yīng)用Image Pro Plus6.0圖像處理軟件進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)處理，計(jì)算每張切片的平均光密度（IOD）值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，非正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)。組間比較，若服從正態(tài)分布則采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若不服從正態(tài)分布則采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

4 結(jié)果

4.1 一般情況

正常組大鼠毛發(fā)光澤度好，飲食正常，呼吸運(yùn)動正常，體質(zhì)量緩慢增長；模型組大鼠毛發(fā)光澤度較正常組差，呼吸運(yùn)動基本正常，時有躁動，體質(zhì)量增長較緩慢；中藥1組和中藥2組大鼠毛發(fā)光澤度與模型組相差不大，呼吸基本正常，體質(zhì)量緩慢增長，平時較安靜。結(jié)果見表1。

4.2 中藥對模型大鼠病理形態(tài)的影響

正常組大鼠支氣管和肺組織周圍有極少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)完整，分布均勻，肺毛細(xì)血管管壁結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠肺組織支氣管、血管及肺泡間隔內(nèi)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞浸潤；小支氣管管壁增厚，可見少量杯狀細(xì)胞增生，管腔內(nèi)伴有少量出血及滲出；肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡間隔斷裂，肺泡腔增大，肺泡結(jié)構(gòu)消失；肺毛細(xì)血管管壁增厚明顯。中藥組大鼠支氣管、肺泡間隔及肺毛細(xì)血管周圍炎性浸潤情況明顯改善，支氣管黏膜損傷改善，肺泡間隔增生緩解，肺毛細(xì)血管壁增厚減輕，結(jié)構(gòu)較完整。結(jié)果見圖1。

4.3 中藥對模型大鼠血清和肺泡灌洗液中相關(guān)指標(biāo)含量的影響

與正常組比較，模型組血清和及BALF IL-8、IL-17、NE、MUC5AC含量明顯升高，IL-10含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，中藥組血清和BALF IL-8、IL-17、NE含量明顯降低（P<0.05），中藥1組BALF和中藥2組血清和BALF IL-10明顯升高（P<0.05）。結(jié)果見表2、表3。

4.4 中藥對模型大鼠肺組織白細(xì)胞介素-17、Foxp3蛋白表達(dá)的影響

模型組較正常組IL-17蛋白表達(dá)明顯升高、Foxp3蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）；中藥1組和中藥2組肺組織較模型組IL-17蛋白表達(dá)明顯降低、Foxp3蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見表4、圖2和圖3。

5 討論

PM2.5指空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的顆粒物，是霧霾的重要組成部分。近年流行病學(xué)研究顯示，大氣中PM2.5濃度升高與呼吸系統(tǒng)疾病的病死率關(guān)系密切[2-7]。

TH17/Treg免疫平衡是機(jī)體除TH1/TH2之外的又一重要的免疫機(jī)制，其免疫失衡與氣道炎癥、氣道黏液高分泌及氣道重構(gòu)均密切相關(guān)。PM2.5可導(dǎo)致TH17/Treg失衡。有研究表明，PM2.5引起小鼠BALF IL-17顯著升高，IL-10顯著降低，肺組織RORγt mRNA表達(dá)升高，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)降低[8]，從而直接參與了TH17/Treg免疫失衡。PM2.5還可通過多種途徑誘發(fā)TH17/Treg免疫失衡。有研究表明，PM2.5可使小鼠IL-6及轉(zhuǎn)化生長因子-β升高[9]。PM2.5可明顯抑制人胚肺細(xì)胞IL-2的生成[10]，這一結(jié)果在大鼠動物實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)[11]。TGF-β和IL-6可通過誘導(dǎo)大量的RORγt表達(dá)進(jìn)而啟動RORγt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。TGF-β和IL-6還可誘導(dǎo)RORa的表達(dá)，此過程依賴于STAT3。過高表達(dá)的RORa可通過誘導(dǎo)IL-17和IL-17F來促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，而RORa缺陷時則可導(dǎo)致體內(nèi)外IL-17 明顯減少。RORγt和RORa兩者共存可協(xié)同促進(jìn)Th17細(xì)胞的表達(dá)。Laurence A等[12]研究發(fā)現(xiàn)，IL-2可以通過STAT5抑制RORγt活性抑制Th17細(xì)胞的分化。

玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)及防風(fēng)組成。黃芪味甘性溫，歸肺、脾經(jīng)，益氣固表；白術(shù)味甘、苦，性溫，歸肺、脾經(jīng)，可益氣健脾止汗；防風(fēng)味辛、甘，性溫，歸膀胱、肝、脾經(jīng)，可解表祛風(fēng)。本方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，補(bǔ)中寓疏，散中寓補(bǔ)，具有固表而不留邪、祛邪而不傷正的特點(diǎn)。臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示，本方對呼吸系統(tǒng)損傷有很好的干預(yù)作用[13-16]。

過敏煎（祝諶予方）由銀柴胡、防風(fēng)、烏梅、五味子組成。銀柴胡味甘性微寒，歸肝、胃經(jīng)，可清熱涼血；烏梅味酸、澀性平，歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)，五味子味酸甘性溫，歸肺，心、腎經(jīng)，兩藥配合，斂肺益氣生津；防風(fēng)味辛甘性溫，歸膀胱、肝、脾經(jīng)，功能抗過敏。本方組方嚴(yán)謹(jǐn)，寒熱共濟(jì)，有收有散。止嗽散源于清代程國彭所著《醫(yī)學(xué)心悟》，方由桔梗、荊芥、紫菀、百部、白前、甘草、陳皮組成。方中紫菀、百部為君，其性溫而不熱，潤而不寒，皆可止咳化痰，新久咳嗽都能使用；桔梗味苦辛，善于開宣肺氣，白前味辛甘，長于降氣化痰，兩者協(xié)同，一宣一降，以復(fù)肺氣之宣降，為臣藥；荊芥、陳皮為佐藥，荊芥辛而微溫，疏風(fēng)解表利咽，以除在表之余邪，陳皮理氣化痰；甘草緩急和中，調(diào)和諸藥之升降收散，合桔梗、荊芥又有利咽止咳之功，是佐使之用。本方具有溫而不燥、潤而不膩、散寒不助熱、解表不傷正的特點(diǎn)，故對新久咳嗽、咳痰不爽者，加減運(yùn)用得宜，均可獲效。過敏煎合止嗽散加強(qiáng)了祛風(fēng)理肺之力，止嗽散合過敏煎則熄風(fēng)理肺之力更強(qiáng)。兩方合用，疏風(fēng)解表宣肺，理氣化痰止咳，治療咳嗽屬風(fēng)邪犯肺，療效明顯。臨床和實(shí)驗(yàn)研究均顯示，兩方對多種肺系疾病均有較好的治療作用[17-20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PM2.5可導(dǎo)致大鼠Th17/Treg失衡，引發(fā)肺組織損傷，玉屏風(fēng)散及過敏煎合止嗽散均可改善PM2.5致大鼠肺組織病理損害；降低PM2.5導(dǎo)致的血清及BALF中IL-8、IL-17、NE含量，升高IL-10含量。同時可降低肺組織IL-17的蛋白表達(dá)，上調(diào)Foxp3的蛋白表達(dá)，進(jìn)而對PM2.5致肺損傷起到保護(hù)作用。

結(jié)合玉屏風(fēng)散及過敏煎合止嗽散方義，前者可能偏于調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、提高機(jī)體免疫力，后者抗炎、抗過敏作用更明顯。玉屏風(fēng)散更適合預(yù)防性給藥，后續(xù)研究將在本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，分時段給藥，分時段取材，選取針對免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的效應(yīng)指標(biāo)，進(jìn)一步比較研究兩者改善PM2.5致肺損傷的具體機(jī)制、作用靶點(diǎn)及最佳干預(yù)時機(jī)。

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