閆彩霞+張浩+李春娟+趙小波+王娟+單世華

摘要：為明確黃曲霉（Aspergillus flavus L.）侵染后花生（Arachis hypogaea）種仁的細(xì)胞學(xué)變化及抗黃曲霉相關(guān)種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)，將黃曲霉菌接種于高抗侵染種質(zhì)J11和高感病種質(zhì)泉花10號(hào)上，制成石蠟切片，數(shù)碼顯微鏡下觀察籽仁結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，與抗侵染種質(zhì)相比，黃曲霉侵染對(duì)感病種質(zhì)的胚細(xì)胞組織破壞更嚴(yán)重，其發(fā)生遠(yuǎn)早于黃曲霉在種皮上的定殖。根據(jù)46個(gè)SSR位點(diǎn)的等位變異矩陣，利用Structure 2.3.3軟件，采用基于貝葉斯數(shù)學(xué)模型的聚類方法對(duì)48個(gè)抗感黃曲霉相關(guān)材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)檢測(cè)，將供試材料劃分為兩大類4個(gè)亞群，分別命名為POP1、POP2、POP3和POP4，各亞群包含的材料數(shù)依次為8、13、9和15，另有3份材料屬于混合亞群。利用NTSYS-pc 2.l0e以UPGMA法對(duì)全部種質(zhì)進(jìn)行PCoA分析，分組結(jié)果與群體結(jié)構(gòu)中亞群劃分結(jié)果比較吻合，兩種分組結(jié)果均與種質(zhì)的抗性特點(diǎn)有明顯的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：花生；黃曲霉；顯微結(jié)構(gòu)；群體結(jié)構(gòu)；PCoA分析

ZTFLH：S435.652 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： To clarify the cytological change of peanut seeds after Aspergillus flavus L. infection and population structure of 48 resistant-related genotypes， A. flavus was inoculated into high-resistant peanut genotype J11 and susceptible peanut genotype Quanhua 10， and then the paraffin section of seeds were observed under a digital microscope. The results showed that the tissues of embryo cells of susceptible genotype were more seriously damaged than those of resistant genotype， and the cell disintegration and nutrient loss occurred earlier than the colonization of A. flavus in seed coat. Using the allele array of 46 SSR loci covering peanut genome and Bias mathematical model， 48 genotypes were divided into four conservative subpopulations named POP1， POP2， POP3 and POP4， which contained 8， 13， 9 and 15 accessions respectively， and the other 3 accessions belonged to mixed subpopulation. By UPGMA clustering method of NTSYS software， principal component analysis divided all accessions into four quadrants， the result was basically in accordance with the composition of subpopulations. Two grouping results were both obviously correlated with the resistant characteristics of peanut genotypes.

Key words： Peanut； Aspergillus flavus； Microstructure； Population structure； PCoA analysis

ZTFLH：S435.652； Document code：A

黃曲霉毒素（aflatoxin）主要是由黃曲霉菌（Aspergillus flavus L.）侵染花生、玉米、大米、大豆以及堅(jiān)果類寄主后產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的毒性和致癌特性[1-4]，嚴(yán)重威脅食品安全和人類健康。我國(guó)是世界上花生黃曲霉毒素污染較為嚴(yán)重的國(guó)家。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院油料作物研究所對(duì)全國(guó)22個(gè)省市區(qū)的花生仁和花生油進(jìn)行了黃曲霉毒素檢測(cè)，結(jié)果花生仁污染率為26.3%，花生油的污染率為47.3%[5]。黃曲霉毒素對(duì)花生的污染主要發(fā)生在兩個(gè)階段：一是在收獲前，土壤中發(fā)育莢果受黃曲霉菌侵染并產(chǎn)毒；二是在收獲后的干燥、貯藏及加工階段。花生結(jié)莢期遭遇干旱、高溫天氣，尤其是當(dāng)種子含水量降至31%以下以及溫度為28～30.5℃時(shí)，莢果很容易被黃曲霉菌侵染[6，7]?；ㄉv果的成熟程度和破損程度也與黃曲霉毒素污染有很大關(guān)系，不成熟的、較小的、過熟的以及昆蟲引起的受傷莢果，黃曲霉毒素的污染程度顯著高于完整莢果[8]?；ㄉ斋@后，含水量逐漸下降，當(dāng)莢果含水量降至12%～30%時(shí)，極易感染黃曲霉（高度危險(xiǎn)期），毒素污染程度與莢果干燥時(shí)間、貯藏花生含水量呈正相關(guān)[9]。

國(guó)內(nèi)外多年研究結(jié)果表明，花生對(duì)黃曲霉毒素污染的抗性主要有兩種類型：一種是基于種皮結(jié)構(gòu)及生化成分的抗性，即抗侵染，黃曲霉菌在具有這種抗性的花生上很難侵染和定殖；另一種是抗產(chǎn)毒，即在黃曲霉菌侵染后抑制其產(chǎn)生毒素，該抗性與花生的種皮及胚均有關(guān)系[10，11]。顯微和超顯微觀察顯示，抗性品種細(xì)胞壁較厚、表皮細(xì)胞間結(jié)合緊密、柵欄組織細(xì)胞層較密和厚、裂縫和氣孔較少等；感病品種的種皮細(xì)胞壁相對(duì)較薄、細(xì)胞間結(jié)合較疏松、裂縫和氣孔較大[12， 13]。此外，品種的抗性與種臍的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，通?？剐云贩N的種臍較小且關(guān)閉，而感病品種種臍較長(zhǎng)且開放[14]。抗性品種種皮蠟質(zhì)層較厚，滲透性低，具有較多的木質(zhì)素和酚類化合物，在莢果的中心區(qū)域有密集的木質(zhì)化細(xì)胞，在正常的情況下不易破損[15-17]，而感病品種則反之。

不同花生品種或種質(zhì)對(duì)黃曲霉侵染抗性的差異以及表現(xiàn)方式為抗黃曲霉種質(zhì)資源的篩選提供了理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。Gopalan[18]首先在世界范圍內(nèi)鑒定出了第一個(gè)抗黃曲霉產(chǎn)毒花生種質(zhì)US26。Mixon和Rogers[19]最早報(bào)道了兩個(gè)抗黃曲霉侵染的花生種質(zhì)P1337394F和P1337409，種子侵染率在5%以下。Mixon[20]在1986年又鑒定出GFA-l、GFA-2、AR-1、AR-2、AR-3、AR-4等6個(gè)抗侵染花生種質(zhì)。Pua等[21]報(bào)道了4個(gè)抗侵染花生種質(zhì)ACC63、CES48-30、Celebes和UplPN4。Mehan等[22]發(fā)掘出UF71513、Ah7223、J11、Var.27、RMP12等近20份抗侵染花生種質(zhì)。Wilson等[23]鑒定出低產(chǎn)毒花生品種Tifton-8。Waliyar[24]證實(shí)了花生J11、55-437、ICGV81707、ICGV87094、ICGV87110的田間侵染抗性。Xiao等[25]鑒定出兩個(gè)產(chǎn)毒量較低的花生種質(zhì)91322、91048。以上品種均是由田間侵染鑒定獲得的，受環(huán)境影響較大，耗時(shí)耗力且易對(duì)環(huán)境造成污染。分子標(biāo)記及基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為花生黃曲霉抗性篩選和鑒定提供了有力的研究手段。Hong等[26]鑒定到5個(gè)和抗黃曲霉侵染高度相關(guān)的SSR標(biāo)記，其中標(biāo)記pPGSseq19D9能區(qū)分所有的抗感品種。黃莉等[27]檢測(cè)到16個(gè)SSR位點(diǎn)與黃曲霉侵染病情指數(shù)、黃曲霉產(chǎn)毒量相關(guān)聯(lián)，表型變異解釋率為5.23%～17.19%。Wang等[28]比較了收獲后黃曲霉侵染的抗感花生品種的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式，得到了842個(gè)防御相關(guān)基因。

到目前為止，有關(guān)抗感黃曲霉花生超微結(jié)構(gòu)差異的研究主要集中于種皮，且未施加任何處理，針對(duì)侵染后花生胚的發(fā)育動(dòng)態(tài)、抗病種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)、抗黃曲霉與抗旱、抗旱與抗其他真菌病的關(guān)系等的研究均鮮見報(bào)道。本研究利用數(shù)碼顯微鏡觀察黃曲霉菌侵染后花生胚細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)變化、SSR標(biāo)記檢測(cè)抗感黃曲霉相關(guān)種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)以及利用PCoA分析抗病種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，從組織病理學(xué)和群體分化角度探討花生對(duì)黃曲霉的抗性機(jī)制，為花生抗病育種提供有價(jià)值的抗源材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察材料 試驗(yàn)對(duì)象為高抗黃曲霉侵染花生種質(zhì)J11和高感黃曲霉侵染花生種質(zhì)泉花10號(hào)（Quanhua10），種仁表面用70%乙醇均勻消毒，無菌水沖洗，種植于盛有滅菌土壤的花盆中，25～30℃溫室培養(yǎng)。

1.1.2 群體結(jié)構(gòu)分析材料 選用國(guó)內(nèi)外已鑒定的48份抗感黃曲霉相關(guān)種質(zhì)為材料（包括7份抗其它真菌和8份抗旱種質(zhì)，見表1），每份資源材料選取3粒種子，水培法生長(zhǎng)至三片真葉出現(xiàn)，剪取三片幼葉液氮研磨，CTAB法提取基因組DNA備用，工作濃度為30 ng/μL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃曲霉菌的培養(yǎng)和侵染 產(chǎn)黃曲霉毒素菌株A. flavus 2810來自福建農(nóng)林大學(xué)油料作物研究所，在察氏培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)7 d后，用無菌水沖洗，配制成濃度為1×106 個(gè)/mL的孢子懸浮液，接種玉米粕，待玉米粕長(zhǎng)滿綠色的黃曲霉菌后備用。將J11和泉花10號(hào)花生材料分別分試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10株，分別種植在不同的鑒定池中，收獲前30 d開始對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組花生植株分別進(jìn)行干旱處理，試驗(yàn)組于處理15 d后撥開根周土壤，將玉米粕均勻?yàn)⒃谥仓昊浚? d后再接種1次，之后每隔3 d從植株基部取花生莢果一次，每次5粒，共3次，取后直接投入10%戊二醛中保存?zhèn)溆?。?duì)照組不做任何接種處理，取樣時(shí)間和方式與試驗(yàn)組相同。

1.2.2 細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)研究的樣品制備和觀察 剝?nèi)≡囼?yàn)組和對(duì)照組的花生種仁，迅速投入廣口瓶中采用10%戊二醛進(jìn)行前固定，乙醇梯度（80%、95%、100%）脫水，二甲苯： 100%乙醇（1：1）透明，熔點(diǎn)為54～56℃的切片石蠟透蠟2次，包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度（100%、95%、80%、50%）復(fù)水，1‰蘇木素和1%曙紅染色，乙醇梯度（95%、100%）脫水，二甲苯透明，最后封片。在Leica DMS1000數(shù)碼顯微鏡下放大40倍觀察。

1.2.3 SSR標(biāo)記的多態(tài)性與群體結(jié)構(gòu)分析

46個(gè)多態(tài)性高、條帶單一的多態(tài)性標(biāo)記用于分析48份抗感黃曲霉及相關(guān)種質(zhì)的遺傳多樣性[29]，其引物序列及所在連鎖群見表2。利用Quantityone 4.6.2軟件獲得目的條帶的分子量，根據(jù)SSR重復(fù)單元進(jìn)行矯正，確定每一位點(diǎn)在不同材料中的等位變異，形成等位變異矩陣。利用軟件Stucture 2.3.3進(jìn)行基于貝葉斯（Bayesian Clustering）數(shù)學(xué)模型的亞群劃分，估測(cè)群體結(jié)構(gòu)，并計(jì)算材料相應(yīng)的Q值[30]。采用Admixed Model估計(jì)最佳群體數(shù)K，取值范圍為1～10，參數(shù)Iterations設(shè)為50 000，Burnin-period設(shè)為50 000，每個(gè)K 值重復(fù)運(yùn)行3次，然后依據(jù)似然值最大原則選取一個(gè)合適的△K 值。

1.2.4 種質(zhì)的主成分分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果以“0，1”方式統(tǒng)計(jì)，即在相同遷移率位置上，有帶的賦值為1，無帶賦值為0，建立“0，1”數(shù)據(jù)陣。利用NTSYS-pc 2.l0e軟件以UPGMA法（類平均法）進(jìn)行PCoA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉侵染對(duì)花生胚細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的影響

從圖1可以看出，黃曲霉侵染后，抗病種質(zhì)J11和感病種質(zhì)泉花10號(hào)的胚表皮細(xì)胞完整而連續(xù)，無明顯差異，但內(nèi)部的胚細(xì)胞卻發(fā)生了顯著變化。侵染后3、6 d及9 d，J11胚細(xì)胞壁和細(xì)胞膜依然比較完整，脂肪粒成團(tuán)聚集存在；而泉花10號(hào)的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜則逐漸裂解，脂肪粒大量流失，侵染后9 d，部分細(xì)胞的脂肪粒已完全消失。由此看出，在花生胚表皮出現(xiàn)肉眼可見的黃曲霉定殖之前，籽仁內(nèi)部的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分已發(fā)生了質(zhì)變。收獲后花生籽仁篩選以及種質(zhì)抗病性的判斷不能以表皮癥狀為依據(jù)，而要以胚組織的結(jié)構(gòu)變化來判斷。

2.2 SSR標(biāo)記在基因組上的分布及其多態(tài)性

46個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記中，除7個(gè)來自其他連鎖圖譜或未定位外，其余標(biāo)記分布于16個(gè)不同的連鎖群上，LG13、LG14、LG19、LG20、LG21等5個(gè)連鎖群上各有1個(gè)，LG6上分布最多，為7個(gè)，其余2～5個(gè)不等（圖2），覆蓋較為均勻。標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（PIC值）見于閆彩霞等[31]的研究結(jié)果，這些標(biāo)記的變異豐富且在基因組的分布較為均勻，比較適合進(jìn)行種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)分析。

2.3 抗感黃曲霉相關(guān)種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)48個(gè)抗感黃曲霉相關(guān)材料46個(gè)SSR位點(diǎn)的等位變異矩陣，利用Structure 2.3.3軟件，采用基于貝葉斯數(shù)學(xué)模型的聚類方法對(duì)全部種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)檢測(cè)，亞群數(shù)由最大似然值對(duì)應(yīng)的△K值確定，結(jié)果表明，供試材料的確存在群體結(jié)構(gòu)。當(dāng)K=2時(shí)，△K出現(xiàn)最大峰值，似然值最大（圖3），因此判斷，供試材料可劃分為兩大類（圖4）；而當(dāng)K=4的時(shí)候，△K又出現(xiàn)了一個(gè)較高的峰值，表明這48份材料可進(jìn)一步劃分成4個(gè)亞群，分別命名為POP1、POP2、POP3和POP4（圖3、5）。

2.4 種質(zhì)的亞群劃分

成員概率（Membership Probabilities）≥0.5的材料被劃分到相應(yīng)的亞群，成員概率<0.5的材料劃為混合亞群，每一份材料的劃分信息見圖5。各亞群包含的材料數(shù)依次為8、13、9和15，只有3份材料屬于混合亞群，分別為香鄉(xiāng)、泉花10號(hào)和茶杵豆，其中香鄉(xiāng)和泉花10號(hào)均為POP2和POP3的混合亞群，茶杵豆為POP1和POP2的混合亞群。從整體來看，這些種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)非常理想。

分析亞群組成發(fā)現(xiàn)，其亞群劃分與材料的地理來源及生長(zhǎng)習(xí)性無明顯關(guān)系，而與其抗病性呈一定相關(guān)性。例如，POP1的8份材料中，有AR-1、AR-2及ICGV87110共3份抗黃曲霉種質(zhì)，以及紅膜七十日早、蒲廟花生、石龍紅花生、萬(wàn)安花生及贛榆小站秧共5份抗旱種質(zhì)；POP2的13份材料中，有PI337409F、ICGV87094、ICGV92243、ICGV94379、ICGV94434、ICGV95440及新會(huì)小粒共7份抗侵染種質(zhì)，91048和91322共2份低產(chǎn)毒種質(zhì)，瑤上大麻殼和粵油92共2份抗旱種質(zhì)，還有金花1012和白沙1016共2份高感種質(zhì)；POP3的9份材料中，包含有Tiffrunner、C11-2-39、C209-6-60、C724-25-22、C156-47和C76-16共6份抗其它真菌種質(zhì)，US26和Tifton-8共2份低產(chǎn)毒種質(zhì)，以及抗黃曲霉種質(zhì)湛秋48；POP4則包含材料3～14、16、17和18共15份抗侵染種質(zhì)，以及抗根腐?。═hielariopsis basicola）的PERRY。

2.5 主成分（PCoA）分析

從圖6可以看出，在0坐標(biāo)軸上，將所有種質(zhì)劃分成4個(gè)象限，其中第Ⅰ和第Ⅲ象限集中了群體結(jié)構(gòu)分析中POP1的全部種質(zhì)，第Ⅳ象限集中了POP3中幾乎全部種質(zhì)，第Ⅰ和第Ⅱ象限集中了POP2和POP4 的幾乎全部種質(zhì)。屬于POP1和POP2混合亞群的茶杵豆則處于4個(gè)象限的交匯處。香鄉(xiāng)與泉花10號(hào)處于第Ⅳ象限中。綜上所述，當(dāng)坐標(biāo)軸為0時(shí)，主成分分析的分組結(jié)果與群體結(jié)構(gòu)中亞群劃分結(jié)果是比較吻合的，也證實(shí)了48份材料的分群是比較可靠的。

3 結(jié)論與討論

3.1 黃曲霉侵染對(duì)花生籽仁的影響

花生籽仁是花生收獲的主要目標(biāo)產(chǎn)物，決定著花生產(chǎn)量和品質(zhì)的形成，但花生籽仁在生長(zhǎng)過程中容易受到黃曲霉等病菌的侵染，特別是后期遭遇干旱或生長(zhǎng)過程中遭遇間歇性干旱。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，侵染后9 d，抗病種質(zhì)的胚細(xì)胞膜依然比較完整，脂肪粒聚集成團(tuán)，而感病種質(zhì)的胚細(xì)胞膜開始裂解，脂肪粒流失。以前的研究認(rèn)為種皮是花生抵御黃曲霉侵染的第一道屏障，收獲后花生種仁的篩選或者是抗感黃曲霉種質(zhì)的鑒定均是以種皮是否有無黃曲霉侵染或定殖為依據(jù)，但實(shí)際上種仁內(nèi)部也就是胚細(xì)胞的解體、化學(xué)物質(zhì)的滲漏早已開始，抗病基因的表達(dá)此時(shí)也迅速增強(qiáng)[32]。關(guān)于種仁脂肪、蛋白質(zhì)等化學(xué)物質(zhì)的組成、性質(zhì)是否改變，以及黃曲霉毒素的含量變化還需要進(jìn)一步確定。

3.2 群體結(jié)構(gòu)分析

本研究將全部材料劃分為兩大類4個(gè)亞群，亞群間分化系數(shù)（Fst）為1.239～1.347，分組結(jié)果與其抗性基本一致，而與材料的地理來源無明顯關(guān)系。Kameswara等[33]利用73個(gè)SSR標(biāo)記評(píng)價(jià)美國(guó)微核心種質(zhì)的72份花生材料，發(fā)現(xiàn)其遺傳距離為0.088～0.254，聚類分析發(fā)現(xiàn)其類群劃分是基于亞種分類和植物學(xué)類型。利用同樣的材料，Wang等[34]和Belamkar等[35]先后進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)美國(guó)核心種質(zhì)存在群體結(jié)構(gòu)，可劃分為4個(gè)主要的亞群，亞群劃分與2個(gè)變種和4個(gè)植物學(xué)類型有關(guān)。Naito等[36]將日本花生種質(zhì)分成了多粒型亞群以及多粒型和珍珠豆型的混合亞群。這些研究與本研究結(jié)論并不一致，因此需要對(duì)本研究材料的植物學(xué)類型做進(jìn)一步劃分。本研究中香鄉(xiāng)和泉花10號(hào)均為POP2和POP3的混合亞群，這與之前的聚類結(jié)果也是非常一致的[31]，證明其遺傳基礎(chǔ)較為復(fù)雜，Peng等[37]在107份美國(guó)微核心種質(zhì)和31個(gè)育成花生品種中也發(fā)現(xiàn)了類似情況。

3.3 干旱與抗黃曲霉及抗黃曲霉與抗其他真菌病害的關(guān)系

本研究選用在全基因組范圍分布較為均勻的46個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)48份抗感黃曲霉花生種質(zhì)、抗其它真菌類種質(zhì)及抗旱種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)及PCoA分析，將這些種質(zhì)劃分為4個(gè)亞群和四個(gè)象限，可以看出，抗其它真菌類的種質(zhì)幾乎全部劃分到POP3和第Ⅳ象限中，表明黃曲霉菌雖然也屬于真菌范疇，但其抗病機(jī)理不同，是由不同的抗病基因控制的[32]；8份抗旱種質(zhì)和抗黃曲霉種質(zhì)主要集中于第Ⅰ和第Ⅱ象限，表明抗黃曲霉與干旱有一定關(guān)系。Waliyar等[38]和Sudhakar等[39]的研究也證實(shí)在干旱條件下，會(huì)阻止植物抗毒素產(chǎn)生，而有利于黃曲霉菌生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致黃曲霉毒素產(chǎn)生[40-42]。但從亞群組成上看，抗旱種質(zhì)全部劃分到POP1和POP2中，抗黃曲霉種質(zhì)則主要分布于POP2和POP4中，并不一致，表明在大田中干旱雖然是黃曲霉毒素污染的主要誘因，但其也受干旱發(fā)生階段、頻率、地溫或氣溫等其他因素的影響[43]。

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