葛宇　林興娥　王甲水　臧小平　馬蔚紅

摘 要 為了獲取高質(zhì)量的油梨果肉DNA，以油梨果肉為試材，比較改良SDS法、改良CTAB法和試劑盒法對(duì)油梨果肉DNA的提取效果。結(jié)果表明：上述3種方法均可從油梨果肉中提取DNA，但改良SDS法與改良CTAB法所獲得的DNA濃度都在600 μg/mL以上，純度（OD260nm/OD280nm）均在1.8左右，純度高且完整性較好，可用于未來分子標(biāo)記分析。

關(guān)鍵詞 油梨 ；果肉 ；DNA提取 ；改良SDS法 ；改良CTAB法

中圖分類號(hào) S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.007

油梨（Persea americana Mill.）為樟科油梨屬植物，又名鱷梨、牛油果，英文名為avocado。油梨起源于中美洲、墨西哥熱帶濕潤地區(qū)及海拔較高的山地森林或熱帶高原，是著名的熱帶、亞熱帶果樹，也是一種木本油料作物[1]。油梨于1918年被引種到中國臺(tái)灣省，在海南、廣東、廣西、貴州、云南、臺(tái)灣等地均有栽培[2-5]。油梨果實(shí)形狀一般為卵圓形、倒卵圓形、圓形及梨形，重量通常為50～2 000 g[6]。油梨果肉是由果皮發(fā)育而成，富含脂肪酸、膳食纖維、蛋白質(zhì)、多酚、黃酮、葉酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)及活性成分，其中油梨脂肪酸含量根據(jù)品種及種植條件的差異可達(dá)到其果實(shí)重量的15%～30%[7-8]。但對(duì)于DNA提取，多酚、黃酮、脂肪酸等物質(zhì)會(huì)使DNA氧化成褐色凝膠狀物或與DNA結(jié)合成黏稠膠狀物，阻礙其作為PCR模板進(jìn)行分析[9-11]。這就需要對(duì)傳統(tǒng)的DNA提取方法加以改進(jìn)，以提取出高質(zhì)量的DNA。周海蘭等[12]以油梨葉片為試材，對(duì)比了傳統(tǒng)CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法3種方法的提取效果。結(jié)果顯示，通過改良CTAB法所提取的DNA的濃度和純度要遠(yuǎn)高于通過傳統(tǒng)CTAB法所提取的DNA。但周海蘭等[12]僅對(duì)傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行了改良，而未對(duì)另一種廣泛應(yīng)用的SDS法進(jìn)行改良并分析其效果。此外，油梨果肉中所含有的影響DNA提取的物質(zhì)含量，如脂肪酸、多酚、黃酮等含量，要遠(yuǎn)高于油梨葉片[6]。所以提取油梨果肉的難度要遠(yuǎn)高于油梨葉片。提取到高質(zhì)量的DNA或RNA是許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（PCR擴(kuò)增、基因克隆、基因表達(dá)等）的初始第一步驟，而油梨作為熱帶水果，果肉是油梨研究的主要部位，對(duì)油梨果肉組織進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)將有助于深入研究油梨果肉中營養(yǎng)物質(zhì)及活性成分的生成、代謝等[1，13]。前人已經(jīng)發(fā)表了有關(guān)油梨果肉RNA提取的優(yōu)化方案，但對(duì)于相對(duì)較容易的油梨果肉DNA提取優(yōu)化方案未見相關(guān)報(bào)道[13]。本實(shí)驗(yàn)通過比較改良SDS法、改良CTAB法和試劑盒法對(duì)油梨果肉DNA的提取效果，以期獲得高效的油梨果肉DNA提取方法，為后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用優(yōu)良油梨品系‘RN-5果實(shí)樣品于2016年8月在海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹基地采集。每個(gè)DNA提取方法重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 改良SDS法和改良CTAB法

本實(shí)驗(yàn)采用的改良SDS法和改良CTAB法參照朱威龍等[14]的SDS法和CTAB法，改良之處如下：（1）在樣品研磨步驟中加入0.03 g聚乙烯吡咯烷酮；（2）在SDS提取緩沖液或CTAB提取緩沖液中加入2%（m/V）的聚乙烯吡咯烷酮；（3）在溫水水浴前，加入20 μL β-巰基乙醇，并于SDS提取緩沖液或CTAB提取緩沖液混勻；（4）水浴冷卻后加入的提取液中加入酚，并且酚與氯仿和異戊醇的體積比為25∶24∶1；（5）延長異丙醇沉淀時(shí)間到過夜。

1.2.2 試劑盒法

稱取幼嫩葉片0.2 g，加入液氮充分研磨，使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的DNA secure plant Kit（DP320）新型植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）進(jìn)行提取，具體操作見產(chǎn)品說明書。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

取DNA樣品20 μL，用TE緩沖液稀釋至10倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD260nm和OD280nm。DNA濃度=OD260nm×10（稀釋倍數(shù)）×50（μg/mL）；DNA純度=OD260nm/OD280nm。

取DNA樣品10 μL，加入5 μL溴酚藍(lán)緩沖液，用5%瓊脂糖凝膠電泳，15 min后拍照，分析DNA的質(zhì)量和完整性。

1.2.4 EST-SSR分子標(biāo)記驗(yàn)證提取效果

以3種提取方法所獲得的DNA為模板，采用油梨EST-SSR引物SHRSPa003進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)3種DNA 提取方法的效果。油梨EST-SSR引物SHRSPa003序列信息來自Borrone等[15]的文獻(xiàn)，油梨EST-SSR引物PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系參照Ge等[16]的方法。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色、拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法所得的DNA濃度和純度

由表1可知，改良SDS法與改良CTAB法提取出的DNA濃度均超過600 μg/mL，濃度較高。2種方法純度也均超過1.8，表明DNA樣品中的蛋白質(zhì)、酚類和脂肪酸去除較為充分，雜質(zhì)較少，其DNA質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。試劑盒法提取的DNA濃度僅為其他2種方法的十分之一，DNA純度也較比其他2種方法低近1倍，其DNA質(zhì)量很難滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳

由圖1可知，改良SDS法、改良CTAB法和試劑盒法3種方法均能從油梨果肉中提取出DNA，其大小均在2.0 kb以上。改良SDS法與改良CTAB法提取的DNA量明顯高于試劑盒法，其電泳條帶也明顯比試劑盒法的亮，提取效果的穩(wěn)定性好。但改良SDS法提取DNA的3次重復(fù)所得的效果并不相同，有些DNA條帶較亮，有些較暗，重復(fù)性較比改良CTAB法較差。

2.3 EST-SSR標(biāo)記PCR擴(kuò)增驗(yàn)證

由圖2可知，改良SDS法與改良CTAB法提取的DNA模板均可擴(kuò)增出比較清晰的EST-SSR標(biāo)記條帶，且穩(wěn)定性好；試劑盒法提取的DNA未成功擴(kuò)增出清晰的EST-SSR標(biāo)記條帶，這可能是含有較多的蛋白質(zhì)、糖、色素等反應(yīng)抑制物所導(dǎo)致的。綜上所述，改良SDS法與改良CTAB法提取的油梨果肉DNA純度高，雜質(zhì)去除充分，可滿足EST-SSR等分子標(biāo)記分析的需要。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

利用紫外分光光度法測(cè)定DNA純度時(shí)，如果1.9>OD260nm/OD280nm>1.8時(shí)，表明DNA樣品受雜質(zhì)污染少，質(zhì)量高；如果OD260nm/OD280nm>1.9時(shí)，表明DNA樣品存在少量RNA；如果OD260nm/OD280nm<1.8時(shí)，表明DNA樣品存在蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[17]。由于油梨果肉含有大量脂肪酸，利用試劑盒法提取過程中脂肪酸等物質(zhì)很容易形成粘稠的膠狀物質(zhì)，難于溶解堵塞柱子造成所獲得的DNA濃度低，質(zhì)量不高。

與寒溫帶水果相比，熱帶水果葉片、果實(shí)等各部位普遍含有更多的多糖、多酚、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，其中果實(shí)內(nèi)各種物質(zhì)又比其它部位更多，這些物質(zhì)對(duì)DNA的提取影響較大[11，18-19]。前人對(duì)熱帶水果DNA的提取，把聚乙烯吡咯烷酮和β-巰基乙醇加入到傳統(tǒng)的SDS法和CTAB法中，大幅提高了DNA的濃度與質(zhì)量，取得了較好的結(jié)果[10-12，20-23]。本實(shí)驗(yàn)中的改良SDS法和改良CTAB法，在前處理期加入了聚乙烯吡咯烷酮，其可有效防止多酚氧化，并可與酚類、單寧酸、脂肪酸等共沉淀用以去除雜質(zhì)。在裂解液中加入了聚乙烯吡咯烷酮和β-巰基乙醇，可進(jìn)一步抑制多酚氧化，并去除雜質(zhì)。此外，延長異丙醇沉淀時(shí)間到過夜。前人研究結(jié)果表明，異丙醇沉淀時(shí)間越長，DNA濃度越高[24]。本實(shí)驗(yàn)改良CTAB法與周海蘭等[12]的改良CTAB法略有區(qū)別，本實(shí)驗(yàn)額外增加了2個(gè)步驟，即水浴冷卻后加入的提取液中加入了酚和延長異丙醇沉淀時(shí)間到過夜。這2個(gè)步驟前一個(gè)可更有效地抽提DNA，而第2個(gè)步驟可提高DNA濃度。雖然油梨果肉的雜質(zhì)或抑制物質(zhì)比葉片多，但本實(shí)驗(yàn)改良CTAB法增加的2個(gè)步驟使得提取的DNA純度（1.81）與周海蘭等[12]的通過改良CTAB法提取的DNA純度（1.7～2.0）大致相同。

3.2 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采取改良SDS法、改良CTAB法和試劑盒法3種DNA提取方案從油梨果實(shí)中提取DNA，通過比較DNA的濃度和純度，進(jìn)一步通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和純度，確定了提取DNA質(zhì)量較高的方法為改良SDS法和改良CTAB法。

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