曹玉謙 李長莉

（遼寧省丹東市林業(yè)科學研究院，遼寧丹東118011）

布勒雜交現(xiàn)象是由世界著名真菌學家布勒（Buller）先生于1931年研究發(fā)現(xiàn)的，布勒雜交是指同種擔子菌的雙核菌絲與單核菌絲相互接觸后，雙核菌絲細胞中一個核遷移到單核菌絲細胞中使之雙核化，產生新菌株的過程?；剑≒holiota nameko）布勒雜交育種，是針對遼寧地區(qū)滑菇品種使用時間較長，在產量、品質及抗病性狀上已出現(xiàn)不同程度的退化現(xiàn)象進行的，旨在通過研發(fā)滑菇布勒雜交育種技術來培育滑菇優(yōu)良菌株。筆者歷時八年（2007-2015年），育出了丹滑16號滑菇新菌株。

1 材料與方法

1.1 供試滑菇菌株選擇生產上正在應用的滑菇菌株和尚未在生產上應用的單孢雜交菌株，以及野生滑菇菌株野生1號、野生2號等8個雜交親本。對照菌株為生產上正在使用的滑菇C3-1，具體各親本主要性狀和來源見表1。

表1 滑菇布勒雜交親本主要性狀及來源

1.2 培養(yǎng)基①PDA培養(yǎng)基：用于孢子萌發(fā)培養(yǎng)；②雜交培養(yǎng)基：自主研發(fā)，用于滑菇雜交；③馬鈴薯綜合培養(yǎng)基：用于雜交菌絲純化培養(yǎng)；④二、三級種培養(yǎng)基：木屑78%，麩皮20%，石膏1%，蔗糖1%。料含水量62%～63%；⑤栽培培養(yǎng)基：木屑80%，麩皮19%，石膏1%。料含水量62%～64%。

1.3 試驗方法

1.3.1 親本的拮抗檢驗 將選定的滑菇親本在PDA試管斜面上逐一做拮抗檢驗，觀察是否產生拮抗現(xiàn)象，凡是產生拮抗現(xiàn)象的，就可以作為雜交親本。

1.3.2 滑菇布勒雜交菌株的培育 培育方法參照參考文獻[2]，其中確定為單核親本的滑菇有野生1號、丹滑15號和C3-1，且進行半熟料栽培。選育出菌株的栽培小試采用高30 cm，直徑13 cm袋，培養(yǎng)料濕重2.5 kg，干料重0.95 kg的木屑半熟料袋栽；重復小試則采用菌盤長55 cm，寬35 cm，厚3.0 cm，培養(yǎng)料濕重4.5～4.7 kg，干料重1.7 kg的半熟料盤式栽培。

2 結果與分析

2.1 雜交親本的拮抗檢驗8個親本的28組拮抗檢驗結果表明：每一組檢驗的5次重復均有拮抗現(xiàn)象發(fā)生，證明它們是不同的菌株，可作為雜交親本。

2.2 雜交異核體的培育2009年8月完成了400個布勒雜交配對工作，通過培養(yǎng)觀察，剔除了91個不親和組合，通過顯微鏡觀察淘汰了111個無鎖狀聯(lián)合的組合。馬鈴薯綜合培養(yǎng)基及木屑基質出菇檢驗，檢出了67個生長不良或不出菇的個體，保留了131個雜交異核體。

2.3 栽培小試2011年采用半熟料袋栽模式進行小試。當年11月末出菇結束。自此，將小試正常出菇的異核體初步確定為雜交菌株。根據(jù)試驗結果遴選出綜合性狀突出的9個雜交菌株，其主要性狀見表2。

表2 9個滑菇布勒雜交菌株的主要性狀

表2可看出，9個菌株的平均袋單產514～572 g，比對照高出0.8%～12.1%；平均單菇重2.4～4.3 g，比對照高出9.0%～95.4%；出菇方式、菌蓋顏色、菌蓋粘液等性狀與對照相似或相近。

2.4 雜交異核體與親本的拮抗檢驗將9個雜交異核體分別與各自的親本進行拮抗檢驗，以進一步確定它們是否雜交新菌株，產生拮抗現(xiàn)象者即可確定為新菌株。結果表明：被檢的9個異核體，與各自的兩個親本都產生拮抗現(xiàn)象。因此，進一步確定它們是雜交新菌株。

2.5 DNA檢測結果與分析經過重復小試選出B52和B17兩個新菌株。為準確確定B52和B17是否雜交新菌株，對其進行DNA檢測。

將ISSR分子標記與SRAP分子標記結合來看，綜合了49條引物擴增出的293條DNA片段，其中多態(tài)性條帶135條。用NTSYSpc 2.10軟件對5個供試菌株進行聚類分析，獲得各菌株間的聚類圖（圖1）。

圖1 ISSR和SRAP結合對五種相似系數(shù)滑子菇分子標記的聚類分析

從圖1中，明顯看到雜交種B52與親本野生一號和親本Ph25相似性很低，可以判斷B52與親本相比產生新的變化。同樣，雜交種B17與親本野生一號相似性在0.75左右，與SRAP結果相同（分析略），與ISSR結果相差0.05的相似性，與親本Ph08的相似性在0.86左右，與ISSR和SRAP單獨分析結果基本一致（分析略）。由此判斷B17與親本相比有明顯變化。

雜交種B52和雜交種B17與各自親本相比，在遺傳上存在的明顯的分化，證明了其為雜交新菌株。

2.6 中試結果與分析

2.6.1 丹滑16號產量穩(wěn)定性分析 為了擴大菌株B52和菌株B17的影響，將其分別命名為丹滑16號和丹滑17號。調查發(fā)現(xiàn)，丹滑16號比丹滑17號表現(xiàn)出更強的抗高溫能力，因此著重進行丹滑16號菌株的中試試驗。為了驗證丹滑16號性狀的穩(wěn)定性，連續(xù)三年（2013-2015年）在不同地區(qū)進行丹滑16號的中試，產量結果見表3。

表3 丹滑16號中試基點產量 kg/盤

從表3的結果可看出：丹滑16號在2013年、2014年、2015年各基點的平均單產分別為2.17 kg/盤、2.14 kg/盤、2.10 kg/盤，三年總平均值為 2.14 kg/盤。方差分析結果表明：F=0.4594，F(xiàn)0.05（3，8）=4.07，差異不顯著。由此可見：丹滑16號在中試基點三年的平均單產是穩(wěn)定的，因而具備了高產穩(wěn)產的優(yōu)良特性。

2.6.2 丹滑16號中試基點的保盤率 表5的結果表明：丹滑16號在各中試基點的保盤率為97.8%，對照為92%，比對照高出5.8%。方差分析結果表明：F=40.97，F(xiàn)0.01（7，16）=4.03，F(xiàn)＞F0.01（7，16），丹滑16號與對照的差異極顯著。由此可見，丹滑16號抗高溫、抗雜菌能力顯著高于對照。

表4 丹滑16號中試產量方差分析

表5 丹滑16號中試基點的保盤率%

表6 丹滑16號保盤率方差分析

2.6.3 丹滑16號子實體的性狀 丹滑16號（圖2）與對照的性狀對比見表7。

表7 丹滑16號與對照子實體的性狀對比

從表7可看出，丹滑16號的品質高于對照，菌蓋橘紅色，單個子實體較大，菌柄長短比對照更為適度，菌柄較粗。在正常情況下，菌柄粗者子實體健壯，不易開傘。基于以上特點，該菌株適合多種加工方式要求。

圖2 丹滑16號出菇場景

3 小結與討論

首次研發(fā)滑菇布勒雜交育種技術，并且成功育出滑菇新菌株。結果證明，運用布勒雜交技術進行滑菇育種是可行的，育出的滑菇新菌株達到了高產、優(yōu)質和性狀穩(wěn)定的育種目標。

應用布勒雜交技術培育出丹滑16號新菌株，具有發(fā)菌快、抗高溫抗雜菌能力強、高產、優(yōu)質、適應范圍廣、性狀穩(wěn)定等特點。丹滑16號中試平均單產為2.14 kg/盤，生物轉化率為125.8%，在滑菇生產上取得了理想的應用效果。