謝曉芳 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

附子心臟毒效的多維評價和整合分析研究進展

謝曉芳 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學藥學院,中藥材標準化教育部重點實驗室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地,成都,611137)

附子是著名的川產(chǎn)道地藥材,也是傳統(tǒng)確有療效有毒中藥,心臟是其重要毒效靶器官,但毒-效相關性不甚明確。本文在彭成教授提出的“中藥‘毒與效’的多維評價與整合分析”的研究思路指導下,緊密圍繞中藥“品質(zhì)制性效用”六大元素,以本團隊多年的研究成果為基礎,并廣泛整理國內(nèi)外相關研究成果,按附子的心臟“毒-效”物質(zhì)基礎-附子的心臟“毒-效”機制-附子對心臟的增效減毒原理3個層面綜述研究現(xiàn)狀,整合分析附子對心臟的毒效機制。結(jié)果顯示,附子中所含的雙酯型生物堿是附子致心臟毒性的主要物質(zhì)基礎,而附子的強心和保護心肌作用是附子總堿、附子水溶性生物堿、附子多糖及其他一些成分等多成分綜合作用的結(jié)果;附子對心臟的毒機制和效機制在心肌細胞上存在相同靶點,主要包括細胞形態(tài)和功能、細胞膜穩(wěn)定性、細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、離子轉(zhuǎn)運相關ATP酶和通道、細胞能量代謝;但又有各自的獨有機制;可通過依法炮制、合理配伍、辨證用藥、延長煎煮時間和控制劑量等多種手段控制附子的心臟毒性和發(fā)揮其強心、保護心肌作用。

附子;心臟;毒-效;整合分析

附子為毛茛科(Ranunculaceae)植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品,是著名的、療效確切的傳統(tǒng)有毒中藥,功效回陽救逆,溫陽通脈,散寒止痛,傳統(tǒng)廣泛用于治療心陽不足,胸痹心痛,如薏苡附子散;現(xiàn)代藥理研究表明附子具有明顯的強心和心肌保護作用,在現(xiàn)代臨床附子也是治療心力衰竭的常用藥物?？梢?心臟是附子的重要藥效靶器官。而另一方面,傳統(tǒng)古籍多處記載附子毒性大,但其毒性表現(xiàn)不甚清楚;現(xiàn)代毒理研究發(fā)現(xiàn)附子可引起實驗動物心律失常,導致心肌纖維化和心肌細胞損傷,近現(xiàn)代臨床的附子致不良反應事件中心律失常是其特征性的常見毒性表現(xiàn)?？梢?心臟亦是附子的毒性靶器官。揭示附子心臟毒效機制對臨床安全、合理使用附子具有重要意義。本文將在彭成教授針對有毒中藥特點提出的“中藥‘毒與效’的多維評價與整合分析”的研究思路指導下,緊密圍繞中藥“品質(zhì)制性效用”六大元素,從附子的心臟“毒-效”物質(zhì)基礎-附子的心臟“毒-效”機制-附子對心臟的增效減毒原理3個層面綜述研究現(xiàn)狀,整合分析揭示附子對心臟的毒性和治療作用特點。

1 附子的心臟“毒-效”物質(zhì)基礎

現(xiàn)代化學研究表明,附子主要含有生物堿和多糖,此外還有黃酮、甾醇、微量元素等。近年來本研究團隊首次從附子中分離得到吡嗪類和吡咯類成分[1-2]?，F(xiàn)代藥理毒理研究顯示,附子不同提取物對心臟的毒或效作用不同,其中又以生物堿類研究最多。

1.1 附子所含雙酯型生物堿可導致心臟毒性,而水溶性生物堿具有強心作用 附子中的雙酯型生物堿為脂溶性生物堿,易溶于乙醇等有機溶劑,而難溶于水。為了解不同提取物的心臟毒性,本研究團隊從附子不同炮制品(泥附子、黑順片、白附片)中均分別制備附子醇提物、附子水提物,進行灌胃小鼠、大鼠的急性毒性試驗,結(jié)果顯示,3個醇提物對小鼠均有明顯的急性毒性,其LD50分別為5.054(4.798～5.361)g/kg、5.783(5.313～6.338)g/kg、6.872(6.173～7.724)g/kg,均可引起小鼠明顯心臟毒性;表現(xiàn)為先出現(xiàn)心率加快和心律不齊,體熱,皮膚、尾、足墊發(fā)紅,心前區(qū)搏動明顯加快,逐漸轉(zhuǎn)為體涼,唇爪、尾部、耳、足墊蒼白,唇爪發(fā)紺,最后心前區(qū)搏動減弱,心率減慢,死亡。3種醇提物分別以4.56、5.08、6.06 g/kg灌胃大鼠,也可引起類似的急性心臟毒性反應,解剖可見急性死亡的大鼠心肌充血,心臟系數(shù)增加,部分大鼠CK明顯升高。泥附子醇提物6.20 g生藥/kg灌胃大鼠3個月,早期給藥時可觀察到大鼠心前區(qū)搏動有所加快,心律紊亂,3個月末病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠心臟損傷,主要表現(xiàn)心肌小片狀或灶性壞死、溶解,伴隨慢性炎細胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生,不可逆。這是附子長期給藥的蓄積心臟毒性。而上述3個炮制品的水提物灌胃小鼠、大鼠無明顯心臟毒性[3]。

進一步,團隊制備附子總生物堿、附子脂溶性生物堿和附子水溶性生物堿開展相關研究。結(jié)果附子總生物堿按相當于生藥量2.5 g/kg經(jīng)十二指腸給藥鹽酸普羅帕酮致急性心力衰竭大鼠,可明顯改善其心臟血流動力學,使心率增加,并可明顯增加大鼠左心室內(nèi)壓最大上升速率(LV+dp/dtmax)和降低最大下降速率(LV-dp/dtmax)具有強心作用[4];附子脂溶性生物堿0.425 mg/kg股靜脈注射大鼠,記錄心電圖發(fā)現(xiàn)可導致大鼠出現(xiàn)明明為的心律失常,并能持續(xù)19～42 min,而再次給予水溶性生物堿248.00、277.264、309.98 mg/kg,可明顯縮短大鼠心律失常持續(xù)時間,且具有一定量-效正相關;1%附子脂溶性生物堿體外作用于原代培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞,可導致其細胞活力明顯下降、細胞死亡數(shù)增加、細胞超微結(jié)構(gòu)破壞和細胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性降低,而當將之與水溶性生物堿按1∶1配伍給藥時,上述心肌細胞損傷均明顯降低。附子多糖與1%附子脂溶性生物堿按1∶1配伍則無明顯作用[5]。此外,附子水溶性生物堿按1.25、2.50、5.00 mg/kg靜脈注射,對鹽酸普羅帕酮致急性心力衰竭大鼠可明顯升高其心率和LV+dp/dtmax,降低LV-dp/dtmax,且能降低其血清Ang II、TNF-α、ANP、BNP、ALD水平;附子水溶性生物堿0.01、0.02、0.04 g/L體外作用于0.8%戊巴比妥鈉誘導的原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞心力衰竭模型,可明顯提高細胞活力,增加細胞內(nèi)Na+、Mg2+含量,提高細胞內(nèi)Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,降低K+、Ca2+含量和Na+-K+-ATP酶活性[6-7]。上述結(jié)果表明,附子總生物堿具有強心作用,附子脂溶性生物堿具有顯著心臟毒性和心肌細胞毒性,而附子水溶性生物堿具有強心作用的對抗附子脂溶性生物堿心臟毒性的作用,因而附子生物堿類是其引起心臟毒-效的重要物質(zhì)基礎。

烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿屬雙酯型生物堿,為脂溶性生物堿,是目前研究最多的烏頭類生物堿,其中又以烏頭堿的關注度最高。烏頭堿對心臟和心肌細胞的毒性是得到公認的。如在心血管藥理研究中,利用其毒性作為誘導動物快速心律失常的常用工具藥[8]。Kentaro Wada等研究發(fā)現(xiàn),當以1 mg/kg長期灌胃小鼠(22 d)時,可導致小鼠出現(xiàn)各種類型心律失常,但隨著給藥次數(shù)的增加或給藥后時間延長,心律失常的頻率顯著下降[9]。Jean Pierre Pennect等發(fā)現(xiàn)烏頭堿在1×10-6M時可導致歐洲鰻鱺離體灌流心臟心率減慢,而大于此濃度時則誘導快速性心律失常,直至心室肌細胞去極化[10]。在細胞層面,我們研究發(fā)現(xiàn),烏頭堿對原代培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞具有明顯的毒性,可導致細胞損傷和死亡,且呈“量-時-毒”正相關,作用1 min的最大毒性濃度為3%,隨著作用時間(0.5～30 min)延長毒性增強;而在相同作用時間(30 min)下存在最大毒性濃度(2%)和最低毒性濃度(0.2%)[3,11]。

新烏頭堿和次烏頭堿也具有顯著心臟毒性。李志勇等研究表明,次烏頭堿30、60、120 μM對體外培養(yǎng)乳大鼠心肌細胞具有明顯毒性[12];王相沖等研究顯示,新烏頭堿以25 μg/kg股靜脈注射豚鼠可致其發(fā)生多種類型的心律失常,以1×10-7M、3×10-7M體外處理豚鼠心室肌細胞可影響其動作電位[13]。

而另一方面烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在低濃度時具有心肌細胞保護作用。如我們的研究發(fā)現(xiàn),當烏頭堿濃度較低(1×10-9M)時,對0.8%戊巴比妥鈉誘導的大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細胞損傷有保護作用;張碩峰等以50 μg/mL的烏頭堿預防性股靜脈推注給大鼠,可減輕尼莫地平所致大鼠心力衰竭,表現(xiàn)為心率、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax和RPP異常均得到改善[14],新烏頭堿和次烏頭堿也對該模型所致快速心率和心功能異常有改善作用[15]。方堃等研究顯示,用250 ng/mL的次烏頭堿預處理大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細胞,可減少H2O2誘導的細胞細胞增殖活力下降和細胞凋亡的發(fā)生,降低細胞內(nèi)Caspase 3和Caspase 9的表達[16]。

去甲烏藥堿是較早被認識到具有強心作用的附子生物堿,靜脈滴注2 μg/kg可使豚鼠正常心臟收縮力加強,也可加強離體豚鼠衰竭心臟的收縮功能,但普奈洛爾可使之對離體豚鼠心臟右心房加速自律性的量效曲線右移,提示可能是β受體部分激動劑[17-18]。近年來還有一些成分被報道有強心作用。如王璐等采用離體蛙心臟觀察了從附子中分離得到的13個胺醇型二萜生物堿的強心活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)北烏頭堿、新烏頭堿、烏頭原堿、3-去氧烏頭原堿、異塔拉定具有強心活性[19]。另外,日本有報道日本附子中所含的去甲烏藥堿是附子強心作用的重要物質(zhì)基礎,但該成分至今尚未在我國江油附子中分離到。

1.2 附子多糖是保護心肌細胞的有效物質(zhì)之一 附子多糖是附子的主要成分之一,也是附子的重要藥效物質(zhì)基礎。過去附子多糖的藥理研究主要集中在調(diào)節(jié)免疫方面,而近年來發(fā)現(xiàn),附子多糖可能也是附子強心、保護心肌的藥效物質(zhì)之一。劉古鋒等將附子多糖預防性灌胃游泳力竭小鼠14 d,結(jié)果可顯著提高小鼠運動耐力,升高小鼠心肌SOD、CAT、GSH-Px活性,同時降低MDA含量,并降低心肌細胞凋亡指數(shù),升高Bcl-2表達而抑制Caspase 3的表達[20]。劉穎等采用大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細胞建立缺氧/復氧損傷模型,給予10 mg/mL的附子多糖干預,結(jié)果可明顯增加細胞存活率,減少LDH、CK的釋放和降低細胞內(nèi)Ca2+濃度,亦能抑制細胞凋亡的發(fā)生[21]。上述結(jié)果表明,附子多糖是附子保護心肌的藥效物質(zhì)基礎之一。

1.3 其他具有強心或保護心肌作用的成分 除了生物堿類和多糖,還有一些成分被報道對心肌細胞具有活性。韓公羽等對從附子中分離得到的尿嘧啶、附子苷作用于蟾蜍離體心臟,結(jié)果均可明顯加強其收縮作用[22-23]。本研究團隊從附子中分離得到的新成分吡嗪類和吡咯類成分均對戊巴比妥鈉誘導的大鼠乳鼠原代心肌細胞損傷有一定保護作用[1-2]。

2 附子的心臟“毒-效”機制

附子對心臟的毒性主要有急性毒性、慢性毒性和細胞毒性,引起毒性的機制包括破壞心肌細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能,以及影響心肌傳導系統(tǒng),其中絕大部分毒性機制研究均是以心肌細胞為靶點。

2.1 附子致心臟毒性機制

2.1.1 引起急性心臟毒性 急性心臟毒性是指24 h內(nèi)1次或多次給予附子后,可引起心臟功能、形態(tài)、生化等的異常。本團隊開展的附子不同炮制品醇提物灌胃小鼠、大鼠的急性心臟毒性試驗顯示,附子醇提物可引起急性心律失常,劑量較小時癥狀可逐漸緩解,而當劑量較大時癥狀逐漸加重,最終因呼吸-循環(huán)衰竭而急性死亡,解剖可見心臟充血明顯,心臟的臟器指數(shù)增加。對急性中毒大鼠進行血液生化檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠血清CK水平明顯升高,病檢部分大鼠心肌充血[3]。馮群等以心電圖、血生化指標(CK、LDH、BNP、cTn I)和臟器指數(shù)(心、肝、腎)為評價指標觀察給予小鼠單次灌胃7.20 g/kg后0～120 min的“時-毒”相關性,及分別灌胃7.20、4.64、2.99、1.93、1.25 g/kg后的“量-毒”相關性,結(jié)果顯示,附子可引起小鼠心率和ECG(QRS間期、R波幅度、T波時間和幅度、QT間期)異常,血清CK、LDH、BNP、cTn I水平逐漸升高,且呈明顯“時-毒”正相關和“量-毒”正相關;但對小鼠重要臟器指數(shù)均無明顯影響[24]。附子不同炮制品(生附子、黑順片、白附片)水煎液均以0.27、1.35、5.4 g/kg對麻醉大鼠經(jīng)十二指腸給藥,亦可導致ECG明顯異常和血清CK、LDH升高,并呈一定量-毒正相關[25]。

2.1.2 引起慢性心臟毒性 我們在前期開展的附子醇提物長期毒性試驗,結(jié)果6.20 g生藥/kg灌胃大鼠3個月,不引起明顯毒性反應,但早期給藥時在給藥后心前區(qū)搏動有所加快,心律紊亂,雄性大鼠耗食量降低,隨后恢復正常;病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)部分大鼠心臟損傷,主要表現(xiàn)心肌小片狀或灶性壞死、溶解,伴隨慢性炎細胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生[3]。

2.1.3 導致心臟功能異常 楊龍坡等采用大鼠離體心臟灌流技術(shù)發(fā)現(xiàn),附子總堿可導致離體心臟血流動力學下降,使心率加快,使左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張壓(LVDP)、±dp/dtmax明顯降低,且與累積給藥量呈正相關趨勢,同時使左心室舒張末期壓(LVEDP)上升[26]。

2.1.4 細胞毒機制 大量的實驗研究以烏頭堿作為附子的主要毒性成分,觀察其對心肌細胞的毒性;也有一些研究以新烏頭堿、次烏頭堿開展毒性機制研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)附子的心肌細胞毒性包括心肌細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)損害、損傷細胞膜穩(wěn)定性、細胞能量代謝異常、酶和受體損傷、細胞增殖抑制等。1)抑制心肌細胞搏動和破壞細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)。大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細胞具有節(jié)律性搏動,甚至連成片,烏頭堿可導致該搏動異常,毒性較大時完全抑制。我們的研究顯示,1 μM的烏頭堿作用5 min即可導致大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細胞自發(fā)搏動的頻率加速,甚至抽搐樣,隨著時間延長又逐漸變慢至恢復正常,當濃度到2 μM時亦先快后慢,并最終搏動被部分或完全抑制,因此認為可以將之作為心律失常細胞模型[27];暴露于3%烏頭堿中30 s即出現(xiàn)形態(tài)損傷,可見細胞間連續(xù)減少、空隙增加,細胞收縮和胞體變小,細胞內(nèi)見顆粒狀物,伊紅染色進一步發(fā)現(xiàn)細胞核周圍有空隙存在,細胞偽足縮短或變少,隨著給藥時間延長上述損傷加重,至30 min細胞極度萎縮,細胞質(zhì)內(nèi)大量空泡和顆粒,細胞核碎裂;電鏡下可見作用30 s時,細胞核呈不規(guī)則型,染色質(zhì)濃縮,核內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡,核仁、核膜清晰,胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹,嵴模糊、斷裂、減少或消失,基質(zhì)密度變淺,部分線粒體溶解,溶酶體腫脹,胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的空泡,伴局灶性肌絲溶解,部分細胞器失去結(jié)構(gòu),細胞膜不完整;隨著暴露時間延長核仁消失,胞質(zhì)內(nèi)線粒體膜結(jié)構(gòu)腫脹或破裂消失,大量的溶酶體出現(xiàn),細胞膜不完整;至30 min細胞核染色質(zhì)幾乎全部丟失,核膜呈鋸齒狀,肌絲全部溶解,胞質(zhì)細胞器消失,甚至細胞破裂。在上述損傷前,原代培養(yǎng)心肌細胞搏動明顯減弱,甚至消失[3,28]。次烏頭堿60、120 μM也可引起原代培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞搏動減弱和形態(tài)異常[29]。2)損傷細胞膜穩(wěn)定性。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min或0.63%、1.13%、2%烏頭堿作用30 min,均可導致原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞漏出LDH、ACP增加[3,28]。3)干擾細胞能量代謝,破壞線粒體。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min或0.36%、0.63%、1.13%、2%烏頭堿作用30 min,均可導致原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞內(nèi)糖原含量降低,3%烏頭堿作用1、30 min使細胞內(nèi)SDH活力下降,cAMP/cGMP比值顯著升高[3,28];3%新烏頭堿和次烏頭堿分別對心肌細胞作用30 s、1 min、30 min,均能顯著升高心肌細胞內(nèi)IP3的生成,同時顯著升高cAMP/cGMP的比值[30];0.2%烏頭堿可使細胞色素C氧化酶活性亦降低[31]。趙佳偉等將來源于大鼠的H9C2心肌細胞系暴露于附子水提取物12.5、25、50、100 g/L中24 h,結(jié)果可導致細胞線粒體膜電位下降,線粒體內(nèi)活性氧(ROS)和超氧化物熒光表達增強,而Ca熒光強度降低,同時導致細胞內(nèi)線粒體生物合成關鍵因子Pgc-1降低,使凋亡相關蛋白Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào),從而多途徑導致心肌細胞線粒體損傷[32]。4)破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),影響離子交換相關酶和通道開放,造成細胞內(nèi)鈣超載。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min或0.2%作用1 h,均可導致原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞離子水平異常,Na+、Ca2+含量顯著增加而K+、Mg2+含量顯著降低,使心肌細胞Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均下降,其中以Ca2+-ATP酶活性下降最顯著[28,33]。烏頭堿引起的心肌細胞內(nèi)鈣超載和離子水平紊亂被認為是其導致心律失常、心肌損傷的重要原因,而引起上述變化與烏頭堿抑制了心肌細胞膜上調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運相關ATP酶活性、電壓或門控式離子通道開放有關。早在20世紀國外采用膜片鉗技術(shù)研究就發(fā)現(xiàn),烏頭堿可使大鼠乳鼠心肌細胞上L型鈣通道開放數(shù)量和開放時間均降低[34];近年研究顯示,烏頭堿可增加大鼠心肌細胞胞質(zhì)內(nèi)L型鈣通道電流,增加NCX表達而降低SERCA2a表達,從而觸發(fā)心律失常發(fā)生[35]。烏頭堿可使成年小鼠心室肌細胞上的電壓鈉離子通道開放數(shù)量增加和再次開放,鈉通道阻滯劑河豚毒素可降低烏頭堿致小鼠心電圖異常,均表明烏頭堿可興奮鈉通道[36-37]。近年來又發(fā)現(xiàn),烏頭堿可抑制H9c2心肌細胞系上超速延遲鉀電流(IKur),且呈明顯依賴性,對它的影響也符合其作用于大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心室肌細胞時細胞心電圖的改變[38]。進一步研究發(fā)現(xiàn),烏頭堿對鉀、鈉、鈣離子通道調(diào)控的影響可能是通過調(diào)節(jié)通道相關蛋白Nav1.5、Kv4.2、RyR2、NCX的表達達到[33,39]。次烏頭堿致心肌細胞心律失常的鈣超載機制與烏頭堿相似,并降低心肌細胞縫隙連續(xù)Cx43蛋白表達而使細胞更易于發(fā)生心律失常[29]。5)抑制細胞增殖。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min,可明顯降低原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞增殖活力,且隨著作用時間延長,使細胞周期的S期縮短而G0期延長,因而G0/G1明顯升高,G2+M則先延長后縮短[28]。6)其他。我們的研究顯示,3%烏頭堿作用30 s、1 min、30 min或0.36%、0.63%、1.13%、2%烏頭堿作用30 min,均可導致原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞內(nèi)MDA含量明顯增加[3,28];次烏頭堿0.23、0.69、2.07 mg/kg灌胃大鼠,連續(xù)7 d,可明顯抑制其心肌組織中鈣調(diào)蛋白(CaM)的蛋白和mRNA表達,同時顯著抑制細胞縫隙連接蛋白CX43(Ser368)磷酸化[29]。

2.2 附子強心作用機制 臨床上,附子常用于治療急性心力衰竭和慢性心力衰竭。現(xiàn)代藥理研究亦顯示,附子對急性心力衰竭和慢性心力衰竭均有治療作用,可改善其心臟血流動力學和抑制心室重松,機制涉及改善心力衰竭發(fā)生發(fā)展密切相關的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、炎性反應因子等神經(jīng)內(nèi)分泌和體液因子分泌,升壓,保護心肌細胞等。1)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和體液因子分泌。為探討附子回陽救逆、強心的作用,我們團隊早在2008年采用鹽酸普羅帕酮建立了心陽虛急性心力衰竭大鼠模型[40]和阿霉素合氫化可的松誘導的心腎陽虛慢性心力衰竭模型[41],已被廣泛認可和應用。采用上述模型我們研究發(fā)現(xiàn),白附片水煎液1.5 g/kg十二指腸給藥,可增強鹽酸普羅帕酮致心陽虛急性心力衰竭大鼠的心率,增加LV±dp/dtmax絕對值,水煎液還有升高血漿腎素、心鈉肽(ANP)和內(nèi)皮素(ET)的趨勢[42-43];進一步研究顯示,附子總堿2.0 g/kg,附子水溶性生物堿1.25、2.50、5.00 mg/kg,或烏頭堿5 μg/kg經(jīng)十二指腸給藥,對上述急性心力衰竭大鼠也能明顯增強血流動力學,水溶性生物堿明顯降低ALD、ANP和BNP水平,烏頭堿可降低血清ALD水平[6,33-44]。吳美平等以結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備的心肌梗死心力衰竭大鼠模型,給予灌胃附子水煎液4.5、9.0 g/kg,連續(xù)4周,可明顯改善其心臟血流動力學參數(shù),降低左心室質(zhì)量指數(shù),并顯著降低血清AngII水平[45]。張俊平等給予阿霉素誘導的慢性心力衰竭大鼠灌胃附子水煎液21 d,結(jié)果可明顯降低大鼠血清NO、TNF-α含量[46]。附子水煎液按4.5、9.0 g/kg灌胃冠脈結(jié)扎致慢性心力衰竭大鼠連續(xù)21 d,可明顯改善其血流動力學,但對升高的Ang II、ALD和左心室臟器指數(shù)無下降作用,高劑量組反而使之升高,提示附子對慢性心力衰竭的治療不能調(diào)節(jié)紊亂的RAAS系統(tǒng)和抑制心室重構(gòu)[47]。2)升壓。附子提取物30 g/kg經(jīng)十二指腸給藥戊巴比妥鈉誘導的急性心力衰竭大鼠,可顯著升高其降低的心率、LVSP及LV±dp/dtmax,但當同時給予靜脈注射酚妥拉明500 μg/kg時可減弱其對LVSP的升壓作用,給予靜脈注射普奈洛爾300 μg/kg可一定程度抑制其升高LVSP和加快心率的作用,表明附子對心力衰竭大鼠增強心室內(nèi)壓作用與激活腎上腺素能α、β受體均有關[48]。附子全組分、水組分和醇組分均對正常大鼠和放血致低血壓大鼠有升壓作用,主要以升高收縮壓為主,用呈現(xiàn)明顯的“量-時-效”關系[49]。3)保護心肌細胞。附子對心肌細胞有保護作用,可以增強其增殖活力、保護細胞膜穩(wěn)定性、改善細胞內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運相關ATP酶和離子通道、抗細胞凋亡等。我們前期采用0.8%戊巴比妥鈉處理體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞制備心肌細胞心力衰竭模型,表現(xiàn)為心肌細胞搏動明顯抑制,細胞內(nèi)離子水平紊亂和細胞膜上離子轉(zhuǎn)運相關ATP酶異常。對這樣的細胞,我們用附子水溶性生物堿0.1、0.2、0.4 g/L作用1 h,結(jié)果可使細胞搏動恢復,使細胞內(nèi)異常升高的Ca2+、K+水平降低和異常降低的Na+、Mg2+水平升高,同時使Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力增加和Na+-K+-ATP酶活力降低[7];烏頭堿1×10-7M對該模型細胞也有相似保護作用,可明顯降低細胞內(nèi)K+水平和Na+-K+-ATP酶活力,增加Ca2+-ATP酶活力[33];此外,烏頭堿1×10-7M、1×10-9M還能使該心力衰竭細胞漏出LDH、ACP減少[33,50]。郭雄等采用膜片鉗技術(shù)觀察附子含藥血清對大鼠心室肌細胞L-鈣通道(Ica-L)的影響,結(jié)果顯示,附子含藥血清可以增加Ica-L的電流密度、激活曲線左移,失活曲線右移[51],這可能是附子治療緩慢型心律失常的機制之一。范穎等給予阿霉素致的心臟毒性損傷大鼠灌胃附子水煎液1.75 g/kg,連續(xù)30 d,結(jié)果可使心肌線粒體中Bcl-2表達升高而Bax表達下降,因而Bcl-2/Bax比值顯著升高,并使caspase-3、caspase-9表達均下降,從而抑制阿霉素所致心肌細胞凋亡。

3 以心臟為靶點的附子增效減毒原理

3.1 依法炮制 炮制是附子減毒的重要手段。炮制過程中,附子所含的雙酯型生物堿水解為毒性較小的單酯型生物堿苯甲酰烏頭胺、苯甲酰中烏頭胺和苯甲酰次烏頭胺,進一步水解成毒性更小的胺醇類烏頭胺、中烏頭胺和次烏頭胺,從而使毒性降低70%～80%。而炮制所用膽巴中含有鎂鹽,有助于雙酯型生物堿的溶出、水解和拮抗烏頭堿心臟毒性的作用[52]。如我們的研究顯示,泥附子、黑順片和白附片的醇提物灌胃小鼠的LD50以泥附子最小,急性心臟毒性的表現(xiàn)最劇烈,而炮制品黑順片和白附片的LD50相對較大,毒性也相對緩和[3]。亦賈雪巖等比較了生附子和不同炮制方法的4個炮制品(黑順片、高溫片、高壓片、微波片)及煎煮液中雙酯型生物堿的含量,并采用langendorff大鼠離體心臟灌流法比較其對心功能影響。結(jié)果顯示,經(jīng)炮制后的4個炮制品的雙酯型生物堿含量均較生附子含量明顯降低,而單酯型生物堿逐漸增加,其相應煎煮液中6種生物堿(烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次原烏頭堿)的溶出率與炮制品中生物堿水平呈正相關,而4個炮制品均可增加離體心臟的HR、LVSP、±dp/dtmax和降低LVEDP,以高壓片中生物堿保存量最高、藥效最明顯[53]?？梢?炮制過程中可通過使雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿而達到降低心臟毒性和增強強心作用。

3.2 合理配伍 附子在心臟方面的配伍“增效減毒”存在兩方面,一是附子自身存在組分配伍調(diào)控其心臟的毒效作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),附子中存在導致心律失常的毒性組分脂溶性生物堿,同時存在對抗該毒性的控毒組分水溶性生物堿,可有效對抗脂溶性生物堿所致大鼠心律失常和原代培養(yǎng)心肌細胞毒性[5];二是附子與其他中藥配伍治療心律失常、心力衰竭等心臟疾病,如常與甘草、干姜、人參等配伍。我們按照“飲片配伍-組分配伍、成分配伍”的3個層次,從化學和藥理毒理學兩方面,系統(tǒng)研究了附子配伍干姜治療急、慢性心力衰竭的增效減毒原理,附子配伍人參治療心力衰竭的增效減毒原理,及附子配伍甘草治療心律失常的增效減毒原理[54]。結(jié)果顯示,在上述配伍中,干姜、人參、甘草均可促進附子中總生物堿和酯型生物堿的溶出而降低雙酯型生物堿的含量,從而在化學層面盡量保存了有效物質(zhì)而降低了毒性物質(zhì)含量;在藥效方面：1)附子干姜配伍,干姜提取物、干姜揮發(fā)油與附子總堿配伍均可降低附子總堿灌胃正常小鼠的急性毒性,同時附子總堿與干姜提取物、干姜揮發(fā)油配伍,對急、慢性心力衰竭大鼠血漿TNF-α、AngⅠ、AngⅡ、ANP、ET、TNF的水平有一定的調(diào)控作用;也能抑制慢性心力衰竭模型大鼠心肌重構(gòu)效應,體現(xiàn)增效減毒。2)附子人參配伍,即參附注射液的組成。我們團隊圍繞參附注射液開展了其治療心力衰竭增效減毒原理研究,采用整體(鹽酸普羅帕酮致急性心力衰竭模型)和離體(原代培養(yǎng)正常心肌細胞和心肌細胞心力衰竭模型)模型,從組分配伍(紅參提取物、附子提取物)和成分配伍(附子與人參皂苷Rg1、Rb1配伍)2個層面,開展了系列藥理研究,結(jié)果顯示,一方面紅參中的皂苷類成分可對抗附子中毒性成分烏頭堿所致的心肌細胞活力下降、細胞膜紊亂、細胞因子分泌異常等心肌細胞毒性;另一方面附子中成分在一定狀態(tài)下(如烏頭堿在低濃度1×10-7M、1×10-9M)又可與皂苷類成分協(xié)同增效,共同改善心力衰竭細胞的細胞因子分泌和細胞結(jié)構(gòu)、功能,從而表現(xiàn)出減毒增效機制。3)附子甘草配伍,從化學角度分析,甘草皂苷和甘草黃酮等具有酸性基團,可與附子生物堿的堿性基團結(jié)合形成鹽,從而改變了附子中生物堿的存在形式,降低了毒性;在藥理研究中發(fā)現(xiàn),甘草皂苷、甘草黃酮可有效降低附子脂溶性生物堿誘導的大鼠心律失常持續(xù)時間,并減輕其對原代培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞的損傷。甘草多糖對附子脂溶性生物堿的毒性無控毒作用。上述研究科學闡釋了合理配伍可調(diào)控附子對心臟的毒、效。

配伍不當,使附子心臟毒性增強。按照中藥“十八反”規(guī)定,附子不宜與貝母同用。如劉萍等觀察了灌胃白順片水煎液或白順片+貝母2.5 g/kg,連續(xù)14 d,結(jié)果均可導致大鼠心臟指數(shù)升高和心肌組織形態(tài)學損傷,但白順片+貝母組損傷較白順片組明顯;瓜蔞亦可增強附子的心臟毒性[55]。而按中藥相畏、相殺原則將附子與黃芪、防風或遠志配伍時,其心臟毒性可得到部分減輕[56]。上述研究體現(xiàn)了中藥“十八反”“七情”配伍原則的科學性,附子臨床用藥時應遵守配伍原則。

3.3 辨證用藥 Min Li等研究發(fā)現(xiàn),在大鼠清醒狀態(tài)下,里昂高血壓大鼠較里昂低血壓大鼠更易被烏頭堿誘導心律失常[57]。趙慶華等研究發(fā)現(xiàn),附子水提組分1.08、1.35 g/kg灌胃可導致正常大鼠血清LDH水平升高,而1.08 g/kg組無異常,但當給予放血法致低血壓大鼠時,1.08 g/kg組亦出現(xiàn)LDH顯著升高,表明其對心肌損傷毒性與機制狀態(tài)有關[49]。

3.4 延長煎煮時間 在附子的傳統(tǒng)應用中,要求“先煎,口嘗無麻味”,其實質(zhì)即是通過延長煎煮時間,使雙酯型生物堿充分水解,從而降低附子毒性,也降低了其心臟毒性。我們采用鹽酸普羅帕酮建立大鼠心陽虛急性心力衰竭模型,按均勻設計法設計實驗方案,觀察白附片不同煎煮時間水煎液(15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h)不同劑量的強心作用,結(jié)果顯示,上述提取物均能明顯提高心陽虛大鼠心率,顯著升高+LV dp/dtmax,降低-LV dp/dtmax,經(jīng)回歸分析提示,以煎煮6 h、劑量為12 g/kg時作用最好[58]。

3.5 控制劑量 劑量是中毒的重要因素。附子中雙酯型生物堿既是其致心臟毒性的毒性物質(zhì)基礎,亦是強心藥效物質(zhì),關鍵在于劑量。我們的研究顯示,附子中的烏頭堿當濃度為3%時,作用5 s即可引起體外培養(yǎng)心肌細胞活力明顯下降,30 min可致細胞破裂、死亡,而濃度降至0.2%(3×10-3M)時毒性明顯減輕,需作用30 min才使細胞活力明顯下降,進一步降至1×10-7M時,對正常心肌細胞無毒性,且對0.8%戊巴比妥鈉致心肌細胞心力衰竭模型有保護作用[3,28,33]。次烏頭堿、新烏頭堿在不同劑量下也分別表現(xiàn)為心臟毒性和心臟保護作用。趙慶華等研究發(fā)現(xiàn),附子全組分0.2、0.54、0.81、1.08、1.35 g/kg灌胃可升高正常大鼠和低血壓大鼠血壓,但1.35、0.81 g/kg組為先降壓后升壓,而其余3個組在給藥60 min內(nèi)一直呈升壓作用,且1.35、1.08 g/kg組導致血清中LDH升高,1.35、1.08、0.81、0.54 g/kg組CK明顯升高,提示對心肌有損傷[49]。可見,隨著劑量的增加,雖然升壓作用仍存在,但毒性也出現(xiàn)了。

4 總結(jié)

附子是傳統(tǒng)確有療效的有毒中藥,是臨床上用于治療心力衰竭的常用中藥。本文經(jīng)綜述可見,附子中引起心臟毒性的主要毒性物質(zhì)是雙酯型生物堿,強心和保護心肌細胞有效物質(zhì)主要有附子總生物堿、附子水溶性生物堿、附子酯型生物堿、附子多糖及腺苷、尿嘧啶等成分;附子致心臟毒性和強心作用存在共有靶點,主要包括心肌細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)、心肌細胞膜穩(wěn)定性、心肌細胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)和離子轉(zhuǎn)運相關ATP酶和離子通道,心肌細胞能量代謝;附子致心臟毒性的機制還有損傷心肌細胞線粒體、抑制細胞增殖;附子強心作用機制還有調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌體液因子分泌、升壓。臨床應用中,一定要按照辨證論治的法則使用附子,使用過程中應注意選用合適的炮制品、合理配伍、嚴格按照處方劑量和煎煮方法用藥,使附子藥效得到最大應用而毒性得到有效控制。

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StudyProgressofMultidimensionalEvaluationandIntegratedAnalysisbetweenToxicityandEfficacyonHeartofRadixAconitiLateralisPraeparata

Xie Xiaofang, Peng Cheng

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

As a famous geo-authentic medicine distributed in Sichuan Province, Radix Aconiti Lateralis Praeparata is also a traditionally toxic medicine with curative effect in clinic. Heart is the key target for both toxicity and efficacy of Radix Aconiti Lateralis Praeparata. However, the correlation between toxicity and efficacy on heart remains unknown. Under the guidance of the research idea “multidimensional evaluation and integrated analysis between ‘toxicity and efficacy’ for Chinese materia medica” proposed by professor Peng Cheng, the article tightly focused on the six factors as “variety, quality, processing, property, efficacy, application” of Chinese materia medica. The research status of ‘toxicity-efficacy’ material basis, mechanism, and effect-enhancing and toxicity-reducing principle for Radix Aconiti Lateralis Praeparata on heart were summarized based on our years of researches and other relative researches at home and abroad. Cardiac toxicity-efficacy mechanism was integrated analyzed then. It was shown that diester-type alkaloids (DA) was material base for heart toxicity in Radix Aconiti Lateralis Praeparata, while total alkaloids (AD), water-soluble alkaloids (WA), polysaccharide and some other compounds in Radix Aconiti Lateralis Praeparata were responsible for effects of cardiotonic and protecting myocardial cells. There were the same targets in myocardial cells for toxicity and efficacy of Radix Aconiti Lateralis Praeparata, such as cell morphology and function, membrane stability, cellular environmental homeostasis, ion transport-related ATPase and channels, and energy metabolism. However, there was some respective mechanism for each other. Multi-means could be taken to control cardiac toxicity and enhance effects on heart for Radix Aconiti Lateralis Praeparata, including legal processing, reasonable compatibility, differentiation for use, extending time of decoction, dosage control.

Radix Aconiti Lateralis Praeparata; Heart; Toxicity-efficacy; Integrated analysis

國家自然科學基金重點項目(81630101);國家發(fā)改委標準化項目(ZYBZH-C-SC-51);國家自然科學基金國家基礎科學人才培養(yǎng)基金(J1310034);四川省中醫(yī)藥管理局“川產(chǎn)道地藥材綜合開發(fā)與區(qū)域發(fā)展”項目(2016ZY008)

謝曉芳(1983.02—),女,博士,副研究員,研究方向：中藥藥理與毒理研究,E-mail:xxf14544@163.com

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生導師,研究方向：中藥毒效的系統(tǒng)評價與整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R285.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.003

(2017-10-09收稿 責任編輯：王明)